Name: 生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぼう、マウスの脳・肺・心臓組織から血管内皮細胞のリボソーム結合mRNAをEGFPタグを用いて精製するTRAP法。この手法は、血管新生における転写制御メカニズムの解明と心血管疾患研究への応用に有用です。

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レン博士の研究は、アメリカ心臓協会(13SDG14800019;)BR)、アンの希望財団(FP00011709;BR)、米国癌学会(86-004-26;BRへのMCW癌センター)、および国立衛生研究所(HL136423);BR);ジョーダン・パーマーは、2018年MCW CTSI 500スターインターンシッププログラムによってサポートされています。P.モランは、NHLBI(5T35 HL072483-34)からの機関研究訓練助成金によってサポートされています。

動物実験のために、ここに記載されているすべての方法は、ウィスコンシン医科大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。
1. 試薬の準備
<ol><li>10mM HEPES、pH 7.4、150mM KCl、5mM MgCl 2、0.5 mM DTT、100mg/mLシクロヘキシミド、プロテアーゼ阻害剤、および組換えRNase阻害剤の濃度に対するリシスバッファーを以下に説明する。<ol>
<li>RNaseフリー脱イオン水の500 mLに以下の試薬を追加:HEPESの1.19グラム、 KClの5.59g、MgCl2の0.24g、DTTの35mg、シクロヘキシミドの0.5 mL、およびNaOHはpH 7.4まで必要に応じて、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤(10mLあたり1つのミニ錠剤)およびRNase阻害剤(10 μL/mL)。</li>
		<li>4°Cの冷蔵庫に最大1ヶ月間保存してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mM HEPES、pH 7.4、350 mM KCl、5 mM MgCl 2、1%vol/vol CA-630、0.5 mM DTT、および 100 mg/mL シクロヘキシミドの濃度に高塩ポリソーム洗浄バッファーを調製します。<ol>
<li>RNaseフリー脱イオン水の500 mLに以下の試薬を添加する:HEPESの1.19g、KClの13.05g、MgCl2の0.24g、ニオニティック、非脱帰性洗剤の5mL、DTTの7.7mgチューブの5、および7.5mLのシメフロフが必要になるまで。</li>
		<li>4°Cの冷蔵庫に最大1ヶ月間保存してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>実験開始前にタンパク質G磁気ビーズに抗GFP抗体を結合する。<ol>
<li>タンパク質Gビーズに200mLのPBSで希釈した抗GFP抗体を10mg添加する。</li>
		<li>室温で10分間エンドオーバー回転でインキュベートします。</li>
		<li>ビーズを磁気ラックに置き、上清を取り除きます。</li>
		<li>ビーズを200mLのPBSで一時停止し、最大1週間4°Cの冷蔵庫に保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 mg/mL シクロヘキシミドで氷冷PBSを調製します。<ol>
<li>99体の氷冷PBSに1体のシクロヘキシミド溶液(100mg/mL)を添加する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 所望の組織を分離し、lyseする
<ol><li>ケタミン(500mg/kg/体重)とキシラジン(10mg/kg/体重)のIP注射によりマウスを安楽死させ、所望の組織(すなわち、心臓、肺)を分離する。すぐに次の手順に進みます。</li>
	<li>100 mg/mL シクロヘキシミドを使用して、所望の組織を 500 mL の氷冷 PBS に入れます。</li>
	<li>モータ駆動ホモジナイザーまたは小クリアランスガラスホモジナイザーを用いた細胞懸濁液に組織をミンチする。モータ駆動ホモジナイザーを使用する場合は、RNAの不飽和を避けるために、低周波(<15,000 Hz)で均質化を1分未満に制限します。</li>
	<li>ピペッティングとバッファの再描画により、200 mLのリシスバッファーで細胞ペレットを中断します。さらに、小クリアランスガラスホモジナイザーで10ストローク、またはモータ駆動ホモジナイザーで低周波(<15,000 Hz)で15秒間セルサスペンションを均質化します。</li>
	<li>遠心分離機は、4°Cで2,000 x gで10分間均質化し、ペレット核と大きな細胞の破片にし、上清を保ちます。</li>
	<li>上清に1%vol/volおよびDHPCに非変性の非変性洗剤を30mMに加える。氷の上で5分間インキュベートします。</li>
	<li>遠心分離機は、ペレット不溶性材料に16,000 x gで10分間溶解します。転送し、将来のステップのための入力としてクリアリサートの15%を維持します。</li>
</ol>3. リボソーム/mRNA複合体の単離
<ol><li>細胞リサート上清に50mLの抗体結合ビーズを加え、4°Cで混合物を30分間エンドオーバー回転でインキュベートします。これは、抗GFP抗体がGFPタグ付きリボソームに結合し、これらのリボソームからRNAをさらに単離することを可能にする場所です。</li>
	<li>磁気ラックにビーズを集め、高塩ポリソーム洗浄バッファーで5回洗います。<ol>
<li>チューブの側面にビーズが集まったら、液体を引き上げて捨てます。次にピペットを入れ直し、200mLの高塩ポリソーム洗浄バッファーを数回再描画する。この手順を 5 回繰り返し、最終的な繰り返しに続くすべてのバッファーを破棄します。すぐに次の手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mRNAの単離
<ol><li>ビーズを RLT バッファーに配置します。次の手順は、RNeasy ミニ キット プロトコルから直接実行され、展開されませんでした。 注意: RLT バッファーにはグアニジン塩が含まれています。漂白剤と混ぜないでください。</li>
	<li>遠心分離機は、フルスピード13,000 rpmまたは4°Cで16,000gで3分間リザートします。ピペッティングにより350mLの上清を慎重に取り除き、新しいマイクロフュージチューブに移します。後続の手順では、この上清 (リサート) のみを使用します。</li>
	<li>マイクロフュージチューブに70%エタノールを同量に加えます。</li>
	<li>2 mL回収管に入れられたスピンカラムに、形成された可能性のある沈殿物を含む試料の最大700 mLを転送する。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15sで閉じ、スピンカラム膜を洗います。フロースルーを破棄します。</li>
	<li>350 mL のバッファ RW1 をスピンカラムに追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15sで閉じ、スピンカラム膜を洗います。フロースルーを破棄し、次のステップで収集チューブを再利用します。 注意: バッファ RW1 にはグアニジン塩が含まれています。漂白剤と混ぜないでください。</li>
	<li>350 mL のバッファ RW1 をスピンカラムに追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15~8,000 x gで閉じます。フロースルーを破棄します。</li>
	<li>スピンカラムに500 mLのバッファRPEを追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を15sで15sで閉じ、スピンカラム膜を洗います。フロースルーを破棄します。</li>
	<li>スピンカラムに500 mLのバッファRPEを追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を2分間≥8,000 x gで閉じ、スピンカラム膜を洗います。次に、コレクション チューブからスピン カラムを慎重に取り外し、列がフロースルーに接触しないようにします。</li>
	<li>新しい2 mLコレクションチューブにスピンカラムを配置し、フロースルーで古いチューブを廃棄します。蓋を軽く閉じ、遠心分離機を全速力で1分間閉じ、残留バッファーを取り除きます。</li>
	<li>スピンカラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに入れます。スピンカラム膜に直接RNaseフリー水の30-50 mLを追加します。蓋をそっと閉じ、遠心分離機を1分間≥8,000 x gで閉じてRNAを溶出します。</li>
	<li>予想されるRNA収率が>30 mgの場合は、RNaseフリー水の別の30-50 mLでステップ4.10を繰り返すか、ステップ4.10から溶出を使用します(高い[RNA]が必要な場合)。ステップ 4.10 からコレクション チューブを再利用します。</li>
	<li>精製RNAを使用して、RNAシーケンシングまたはリアルタイム定量PCRを含む下流分析に使用するか、またはRNaseフリーH2Oに溶解した保存RNAを最大1年間-80°Cで保存します。</li>
</ol>

<ol><li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9, 1282-1291 (2014).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+translational+efficiency+and+lineage-specific+transcriptomes+using+ribosome+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Interrogating translational efficiency and lineage-specific transcriptomes using ribosome affinity purification.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 15395-15400 (2013).</li>
<li>Best, B., Moran, P., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF%2FPKD-1+signaling+mediates+arteriogenic+gene+expression+and+angiogenic+responses+in+reversible+human+microvascular+endothelial+cells+with+extended+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">VEGF/PKD-1 signaling mediates arteriogenic gene expression and angiogenic responses in reversible human microvascular endothelial cells with extended lifespan.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 446, 199-207 (2018).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA%2FPKD-1-FoxO1+Signaling+Axis+Mediates+Endothelial+Cell+CD36+Transcriptional+Repression+and+Proangiogenic+and+Proarteriogenic+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosclerosis+Thrombosis%2C+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">LPA/PKD-1-FoxO1 Signaling Axis Mediates Endothelial Cell CD36 Transcriptional Repression and Proangiogenic and Proarteriogenic Reprogramming.</a> Arteriosclerosclerosis Thrombosis, Vascular Biology. 36, 1197-1208 (2016).</li>
<li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Kinase+D1+Signaling+in+Angiogenic+Gene+Expression+and+VEGF-Mediated+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein Kinase D1 Signaling in Angiogenic Gene Expression and VEGF-Mediated Angiogenesis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 37(2016).</li>
<li>Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO1+transcriptional+activities+in+VEGF+expression+and+beyond%3A+a+key+regulator+in+functional+angiogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">FoxO1 transcriptional activities in VEGF expression and beyond: a key regulator in functional angiogenesis?</a> Journal of Pathology. 245, 255-257 (2018).</li>
<li>Hupe, M., Li, M. X., Gertow Gillner, K., Adams, R. H., Stenman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+TRAP-sequencing+technology+with+a+versatile+conditional+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of TRAP-sequencing technology with a versatile conditional mouse model.</a> Nucleic Acids Research. 42, e14(2014).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+links+to+ER+positive+breast+cancer+progression+via+LPA%2FPKD-1-CD36+signaling-mediated+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity links to ER positive breast cancer progression via LPA/PKD-1-CD36 signaling-mediated microvascular remodeling.</a> Oncotarget. 8, 22550-22562 (2017).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1%2F2-Akt1+crosstalk+regulates+arteriogenesis+in+mice+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">ERK1/2-Akt1 crosstalk regulates arteriogenesis in mice and zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 120, 1217-1228 (2010).</li>
<li>Skuli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+HIF-2alpha+regulates+murine+pathological+angiogenesis+and+revascularization+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial HIF-2alpha regulates murine pathological angiogenesis and revascularization processes.</a> Journal of Clinical Investigation. 122, 1427-1443 (2012).</li>
</ol>

著者らは、利益相反がないと宣言している。

血管新生は、EC特異的血管新生遺伝子転写および発現がEC分化および血管新生リプログラミング3、4において重要な役割を果たす複雑な多段階プロセスである。細胞の多様性と建築の複雑さから、生体内の分子レベルで哺乳類血管系の機能をよりよく理解するために、EC特異的なCD36を伴うEC特異的TRAPマウスを作成しました。 、EC特異的pkd-1欠乏またはグローバルcd36欠乏は、他の遺伝子操作マウスラインと組み合わせてPu実験室2で生成された汎用性の高いフロキセドTRAPマウスモデルまたはEGFP-TRAPを用いて用いる。これにより、pkd-1またはcd36遺伝子発現8におけるEC特異的な生体内の無傷組織からの血管ECの翻訳されたmRNA補体全体の検査が可能となり、これは、調査に不可欠である。生理学的および病理学的血管新生<sup class="x...

哺乳類の脳、心臓、肺などの複雑な組織では、細胞の不均一性の高いレベルは、組織サンプル全体から得られる遺伝子発現データの分析を複雑にします。生体内の特定の細胞型における遺伝子発現プロファイルを観察するために、最近新しい方法論が開発され、遺伝子決定された任意の細胞型の翻訳されたmRNA補体全体の尋問が可能になった。この方法論は、翻訳リボソーム親和性精製(TRAP)技術1、2として知られている。これは、動物の他の血管新生関連遺伝子を遺伝的に操作する場合、内皮細胞生物学と血管新生を研究するのに有用なツールです。
血管新生PKD-1シグナル伝達および血管新生遺伝子CD36の転写は、内皮細胞(EC)分化および機能血管新生3、4、5、6に重要であることを示した。遺伝子転写およびECトランス分化における血管新生および代謝シグナル伝達の分子機構を決定するために、TRAP技術1に基づいて特異的に削除された血管新生遺伝子を用いた遺伝子組み換えTRAPマウスを作成した。,2.さらに、TRAP動物では、血管内皮またはcd36遺伝子の世界的な欠失にpkd-1またはcd36遺伝子欠損があるだけでなく、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)も遺伝的にタグ付けされています。ECのリボソームの翻訳TRAPは、標的組織の血管内皮から直接リボソーム結合mRNAの親和性精製を可能にし、遺伝子発現の解析とEC分化に関連する新しい転写物の同定を可能にし、生体内条件下で直接血管新生。これらの遺伝子組み換え動物では、内皮からリボソーム結合RNAを単離することに成功しました。精製されたRNAは、EC分化および機能の調節における血管新生または動脈系遺伝子のさらなる特徴付けに使用することができる。このプロトコルは、生体内で直接IC内のmRNAを単離するためのTRAPアプローチを実装するためのステップバイステップガイドを提供します。

<table><tbody><tr><td>2100 ナノチップとピコチップス付き電気泳動バイオアナライザー</td><td>Agilent</td><td>G2939AA, 5067-1511 & 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>Sarstedt</td><td>83.1832</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>K8855100020</td><td></td></tr><tr><td>マグネット (Dynamag-2)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td>精製スケールによります; 1.5 mLチューブ内のサンプルは濃縮できますDynaMag-2</td></tr><tr><td>ミニ遠心分離機</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000C 分光光度計</td><td>サーモ・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL微量遠心チューブ用ローター付き</td>冷蔵<td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td></tr><tr><td>RNaseフリー1.5mL微量遠心チューブ</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>AM12450</tr><tr><td>Rnaseフリー50mLコニカルチューブ</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td>AM12501</tr><tr><td>RNaseフリー 1000-&mu;l フィルターチップ</td><td>レイニン</td><td>RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 200-&mu;l フィルターチップ</td><td>レイニン&nbsp;</td><td>RT-200F</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリー 20-&mu;l フィルターチップ</td><td>レイニン&nbsp;</td><td>RT-20F</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー用ローター</td><td>大和&nbsp;</td><td>LT-400D</td><td></td></tr><tr><td>チューブローテーター、Labquakeブランド</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー13-687-12Q</td><td></td></tr></tbody></table>

生体内細胞からのrna単離に対するリボソーム親和性精製(trap)の翻訳

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

多くの研究は、qPCRおよびRNAシーケンシングによる転写物および遺伝子発現のインビトロ分析のために、インビトロ細胞アッセイおよび全組織または動物からの特定の細胞型の単離に限定されている。複雑な組織や臓器における特定の細胞型の包括的な転写物および遺伝子発現解析は、遺伝子が調節される細胞および分子機構と組織恒常性および器官との関連を理解するために重要である。関数。本稿では、動物肺の血管内皮におけるリボソーム結合RNAを生体内で直接単離する方法論を例として示す。組織処理およびRNA精製のための具体的な材料および手順について説明し、RNAの品質と収量の評価、ならびに動脈系遺伝子アッセイのためのリアルタイムqPCRを含む。このアプローチは、リボソーム親和性精製(TRAP)技術の翻訳として知られており、複雑な組織における任意の特定のタイプの生体内で直接生体内の特定の細胞タイプの遺伝子発現およびトランスクリプトーム分析の特性評価に利用することができる。

我々の以前の研究4,7は、CD36がLPA/PKD-1シグナル伝達経路を介した動脈分化および毛細血管動脈化のスイッチとして機能する可能性があることを示唆している。LPA/PKD-1-CD36シグナル伝達軸が生体内の動脈形成に不可欠であるかどうかを調べるために、我々は、グローバルCD36欠乏症または内皮特異的CD36-またはpkd-1欠乏症を有するだけでなく、選択的分離を可能にする新しいTRAPラインを確立した。GFPによるクレマークされた細胞系統からのリボソーム結合RNAの、およびクレ活性化蛍光レポーター2として有用である。
ジェノタイピングを行うことにより、cd36遺伝子が世界的に、または内皮特異的cd36ヌルマウス(データを示さない)の血管内皮内で削除され、pkd-1遺伝子も血管内皮で削除されたことが観察された。図1は、作成されたグローバルcd36 TRAPまたは内皮特異的pkd-1 TRAPマウスラインを示す代表...

我々は、RNA精製と組み合わせてリボソーム中の増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)のEC特異的遺伝的タグを介して、マウス脳、肺および心臓組織における血管内皮細胞(EC)からリボソーム結合mRNAを精製するアプローチを提示する。.

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

こんにちは、私はビンレンです、私はアラバマ大学バーミンガム医学部の外科と生物医学工学の准教授です。我々の研究室は、これらの一般的な心血管疾患および癌の文脈における血管新生の血管新生機能に興味を持っています。我々の研究の一つは、内皮細胞のトランスセ分化と血管新生のエピジェネティックおよび転写調節に焦点を当てています。血管新生の転写機構を理解するために、内皮細胞の血管新生に関連する特定の遺伝子を削除しただけでなく、強化されたGFPプローブをネイティブ内皮細胞のリボソームに遺伝的にタグ付けするトランスジェニック工学的マウスラインを確立しました。このようにして、トランスジェニック動物の異なる組織器官の内皮細胞から関連メッセンジャーRNAのループを直接分離して精製することができます。その後、精製されたメッセンジャーRNAを使用して、トランスクリプトとトランスクリプトームの下流分析を行うことができます。RNAシーケンシングとリアルタイムチルPCRによって。このビデオでは、私の学生パトリック・モランとジョーダン・パーマーと研究技術者ニコラス・バーネコウとロン・ユアンは、トランスジェニックマウスとトランスジェニック動物の内皮から直接吸引メッセンジャーRNAのアプローチを紹介します。ジェノタイピングは、このプロトコルにおいて、氷が内皮細胞のリボソームにGFPタグを持つことを保証するための重要な予備です。すべての下流のRNAi分離ステップは、GFPタグリボソームの存在に依存しているため、実験を開始する前に遺伝子型を決定することが不可欠です。RNAの単離を開始する前に、いくつかの準備ステップを完了する必要があります。これらには、抗GFP抗体をタンパク質Gディナビーズに対して緩衝製剤および結合させる。バッファーは摂氏4度で最大1ヶ月間持続することができ、抗体結合ビーズは摂氏4度で最大1週間持続することができます。実験を計画する際には、これらの制限を考慮してください。モル駆動ホモジナイザーを使用すると、RNAの収量を増加させる優れた方法です。RNA の分解を減らすために、低い周波数設定と持続時間を使用してください。前述のように、ジェノタイピングは試用プロトコルにおける重要な予備ステップです。TRAP技術を用いてRNAを単離するマウスがTRAP遺伝子、少なくともヘテロ接合性の遺伝子に陽性であることを確認するが、理想的にはTRAP遺伝子のホモ接合性が重要なステップである。マウスから所望の組織を分離し、ミリリットルシクロヘキサミド溶液あたり100マイクログラムの氷冷PBSにすぐに置きます。これにより、翻訳が停止し、転写が安楽死前のマウスの正確な描写になります。モーター駆動のホモジナイザーを使用して、組織を細胞懸濁液に均質化します。理想的なタイミングと周波数の設定は、使用する特定のモータ駆動ホモジナイザーに基づいて、個々のラボによって決定する必要があります。周波数設定を高くしすぎると、RNA の分解が発生し、プロトコルの残りの部分が中断する可能性があります。実験を開始する前に準備しておく必要のあるリシスバッファー内の細胞ペレットを中断します。プロトコルの残りの部分を進める前に、適切な均質化を確実にするために、この混合物をさらに均質化してください。ホモジュネートを摂氏4度の遠心分離機で2,000倍Gで10分間遠心分離する。これは、下流の免疫沈降反応を妨げる可能性のある核および大きな細胞破片をペレット化する。DHPCおよびCA-630脂質を前の遠心分離工程から上清に加えます。これらの脂質は、タンパク質の相を他の細胞内成分から分離するのに役立ちます。懸濁液を氷の上に5分間置き、座るようにします。13,000倍Gで10分間溶解物を遠心分離し、任意の可溶性物質をペレットする。将来のステップのために明確なlysateの15%を保ちます。抗GFP抗体結合ビーズを細胞の上清に加え、エンドオーバーエンド回転で摂氏4度で30分間インキュベートします。そこで抗GFP抗体がGFPタグリボソームを結合し、RNAをこれらのリボソームからさらに分離することができます。あなたの磁気ラックにビーズを収集し、分離を開始する前に準備した高塩ポリソーム洗浄バッファーを使用してビーズを5回洗います。すぐに次のステップに進み、RLT バッファにビーズを配置します。全速力で3分間のリセートを遠心分離し、上清を慎重に取り除き、新しいマイクロフュージチューブに移します。70%エタノールの1つのボリュームをクリアしたライセートに加え、ピペット処理ですぐに混ぜます。形成した可能性のある沈殿物を含むサンプルの最大700マイクロリットルを2ミリリットルの採取チューブに配置されたスピンカラムに移す次のステップに直ちに進みます。8,000倍Gを超える時に15秒間のリセートを遠心分離し、スピンカラム膜を洗浄する。フローを破棄して、次の手順に進みます。350マイクロリットルのバッファーRW1をスピンカラムに追加します。遠心分離機は8,000回Gを超える15秒間、スピン柱膜を洗浄し、流れを通して廃棄する。次のステップに進む前に、バッファRW1の別の350マイクロリットルを使用してこのステップを繰り返します。500マイクロリットルのバッファRPEをスピンカラムに追加します。遠心分離機は8,000倍Gを超える場合に15秒間、スピンカラム膜を洗浄した。流れを破棄し、スピンカラムに500マイクロリットルのバッファRPEを追加してこのステップを繰り返します。このとき、遠心分離機を8.000倍Gより多くで2分間、スピンカラム膜を洗浄した。流れを破棄し、新しい2ミリリットルの回収チューブにスピンカラムを入れ、フルスピードで1分間遠心分離機に進み、スピンカラムに存在する残留バッファを取り除きます。流れを捨てて、スピンカラムを新しい1.5ミリリットルの回収チューブに入れます。スピンカラム膜にRNaseフリーウォーターの30〜50マイクロリットルを直接加えます。遠心分離機は8,000倍Gを超える1分間、スピンカラム膜からRNAを溶出させる。この時点で、あなたのRNAはRNaseの自由水に溶解し、1年までマイナス80°Cで貯えられるかもしれない。分光光度計を使用して、単離したRNAの純度を定量し、確認します。RNAを含む核酸である260ナノメートルのピークを探しています。量は、画像の右下の部分に、マイクロリットル当たりのナノグラムで描かれている。品質は、画面の右下の部分の数量の上に1項目を示している260 230比によって推測することができます。我々のアプローチは、特に心臓組織または以前に凍結した組織からmRNAを精製した場合、低いRNA収量を示した。したがって、我々は、収量を増加させるために条件を最適化する必要があります。しかし、EC特異的CD-36欠損マウスでは、肺および心臓内皮両方においてエフルリンB2およびDLL4のレベルが有意に増加し、対照と比較して観察した。これらの結果は、RNAの品質が下流の分析に十分であることを示唆する、我々の以前のin vitro研究と一致していた。私たちのワークスペースの厳しい条件のために収量は低かった。この制限を克服するためには、RNaseフリー作業ゾーンを設置し、RNaseに汚染され得る作業面や機器を除染し、品質のRNAを抽出して収量を増やすために手袋を頻繁に交換することが重要です。また、アフィニティーマトリックス中の適切なGFP抗体濃度を見つけ、組織のリシスバッファーに適切な濃度のRNase阻害剤を使用し、標的組織の内皮リボソームからのRNA抽出にRNaseフリーのプラスチック製品および試薬を使用することも重要です。

translating-ribosome-affinity-purification-trap-for-rna-isolation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ペプチジル- tRNAの初期段階を含むリボソームの生化学的解析への大きな障害は、同じサンプル中の他のリボソーム、解析対象の特定のmRNA配列の翻訳に関与していないリボソームの存在となっています。我々は、排他的に、興味の発生期のペプチジル-...

機能と構造解析のためにペプチジル- tRNAを含む翻訳リボソームの分離

このビデオでは、mRNAのアデニル酸ウリジル酸リッチエレメント(ARE)配列と相互作用するRNA結合タンパク質(RBP)を同定するためのin vitro...

アフィニティー抽出による RNA-Binding Protein の単離のための RNA-Protein プルダウンアッセイ

Translating Ribosome Affinity Purification...

のレア細胞集団からのTRAP-RC、翻訳リボソームアフィニティー精製<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

この原稿は、特定のオリゴヌクレオチド指向濃縮を介して真核細胞で形成された選択された同族RNPを単離するアプローチを説明しています。DHX9/RNAヘリカーゼAで構成されるレトロウイルス5'非翻訳領域に結合した同族RNPを単離することにより、このアプローチの適用性を実証します。...

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

内生的に形成された mRNA 蛋白質複合体の回復のためのタンデムの RNA 分離手順 (旅行) を説明します。具体的には、RNA 蛋白質の複合体は、生体内で架橋 polyadenylated Rna ランダムプライマー ビーズ抽出物から分離された、特定の Mrna が変更された RNA アンチセンス オリゴヌクレオチドでキャプチャされます。イムノブロット解析による蛋白質の Mrna...

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

リボソームアフィニティ精製(TRAP)の翻訳により、細胞型特異的翻訳mRNAの迅速かつ効率的な単離が可能になります。ここでは、肝再集団とTRAPのマウスモデルにおける流体力学的尾静脈注射を組み合わせた方法を示し、再入発性肝細胞の発現プロファイルを調べる。...

マウス肝臓における細胞型特異的遺伝子発現プロファイリング

ここでは、リボタグシステムを用いた成人男性マウス生殖細胞の選択集団からリボソームおよび関連RNAの免疫沈降について説明する。戦略的な繁殖と慎重な免疫沈降は、細菌細胞の翻訳を知らせ、変異型のメカニズムに関する洞察を提供するクリーンで再現可能な結果をもたらします。...

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

生きた酵母や哺乳動物細胞におけるホルムアルデヒド架橋を用いた翻訳(タンパク質生合成)複合体を迅速に安定化させる技術を紹介する。このアプローチにより、一過性の中間体と動的RNA:タンパク質相互作用の解剖が可能になります。架橋された複合体は、深いシーケンシングベースのプロファイリング方法、顕微鏡、質量分析など、複数のダウンストリームアプリケーションで使用できます。...

真核細胞からのトランスレーショナル複合体の迅速な インビボ 固定と分離

共翻訳相互作用は、新生鎖修飾、標的化、折り畳み、およびアセンブリ経路において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、 in vivo、モデル真核生物...

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

このプロトコルは、NuTRAPマウスモデルを使用して細胞型特異的翻訳リボソームmRNAを単離することを目的としています。...

細胞ソーティングなしでスナップ凍結された不均一な組織サンプルから細胞種特異的RNAを単離(英語)

AviTag特異的位置制限照明強化ビオチニル化(ALIBi)は、リボソームの細胞内集団を標識し親和性を精製し、下流のシーケンスおよびプロテオーム解析のために開発された新しいオプトジェネティック活性化法です。...

組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離

学ぼう、マウスの脳・肺・心臓組織から血管内皮細胞のリボソーム結合mRNAをEGFPタグを用いて精製するTRAP法。この手法は、血管新生における転写制御メカニズムの解明と心血管疾患研究への応用に有用です。

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

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