Name: インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 学ぶ インビトロ転写RNAベースのルシフェラーゼアッセイを用いたポックスウイルス感染細胞における翻訳調節の研究方法。mRNAの5'UTRや3'UTRなどのシス要素による翻訳制御を解析し、ウイルス感染機構の理解に貢献する。

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このプロジェクトは、国立衛生研究所 (AI128406 www.nih.gov) が ZY に、また一部はジョンソンがん研究センター (http://cancer.k-state.edu) によって、大学院生の夏期給付の形で PD に資金を提供されました。

1. PCR による In Vitro転写用 DNA テンプレートの作成
<ol><li>PCR によって DNA テンプレートを調製するために、設計プライマー。プライマーの設計に際しては、プライマー長、アニーリング温度 (Tm)、GC 含有量、G や C などの 3 ' 末端などの重要な特性を考慮してください。 注:これらの文献25、26、27に詳細に論じた。</li>
	<li>設計プライマーは、5 ' 〜 3 ' 方向に以下の元素を含む PCR アンプリコンを生成する: T7 プロモーター、ポリ (A) リーダー、ホタルルシフェラーゼ ORF およびポリ (A) 尾を T7_12A-Fluc として以下に記す。鋳型 DNA に存在しないすべての追加要素を包含するようにプライマー (前方および後方) を設計する (図 2a)。 注:すべての要素の順序は表1で見つけることができます。
</li>
	<li>いくつかの余分なヌクレオチドを前方プライマー (5 '-3 ')28に含み、続いて T7 プロモーター、ポリ (A) リーダーまたは所望の 5 '-UTR 配列および約20ヌクレオチドを、Tmに基づいて調整し、レポーター遺伝子の 5 ' 末端に対応するOrf。プライマー内の対応する領域が遺伝子のセンス鎖 (+ 鎖) と同一であることを確認します。 注:長い 5 '-UTR の場合、2つの DNA 断片を合成します: T7 プロモーターを持つ1つは長い 5 '-UTR、レポーター遺伝子の ORF と2番目です。オーバーラップ拡張 PCR29を使用してこれらの2つのフラグメントを結合します。</li>
	<li>設計逆プライマー (5 ' − 3 ') は、ポリ (A) 尾と約20ヌクレオチドを含むように、Tmに基づいて調整し、レポーター遺伝子の ORF の 3 ' 末端に対応する。プライマー内の対応する領域が遺伝子のアンチセンス鎖 (−ストランド) と同一であること、およびフレーム内停止コドンがポリ (A) テールの前に存在していることを確認する。 注:ポリ (A) リーダーまたはポリ (A) テールにおける A の所望の長さは、プライマーにおいてカスタマイズすることができる。例えば、ポリ (A) テールに 50 A のを追加するには、リバースプライマーは 50 T を伴うべきです。同様に、ポリ (A) リーダーに 20 A を追加するには、フォワードプライマーは 20 A を伴う必要があります。</li>
	<li>内部制御のために、5 ' 〜 3 ' 方向に以下の要素を含む別のプライマーのセットを設計する: T7 プロモーター、Kozak 配列を含むランダム 5 '-UTR コード配列、レニラルシフェリンルシフェラーゼ ORF およびポリ (a) 尾として以下に記す T7_Kozak-Rluc。</li>
	<li>PCR チューブでは、試薬を次の順序で追加します: DNase の自由な水、2x 高忠実度の DNA ポリメラーゼ、プライマー、および配列確認されたルシフェラーゼテンプレート DNA (表 2)。 注:混合物中の個々の成分の量は、反応量に応じて調整されるべきである。</li>
	<li>表 3に示すように、標準の3ステップ (変性、アニーリング、エクステンション) PCR サイクルを使用して、DNA テンプレートを生成します。 注:アニーリング温度 X ° c は、使用されているプライマーセットによって異なり、延長時間 T min は PCR アンプリコンサイズおよび使用される DNA ポリメラーゼによって異なります。</li>
	<li>Pcr 反応の 5-10% を、市販の分子量標準とともに 1% のアガローストリス-アセテート-EDTA (エチジウム) ゲル電気泳動 (0.1 μ g/ml の臭化) で実行することによって検出します。UV イルミネータの下でゲルを視覚化して、PCR 産物のサイズを決定します。</li>
	<li>PCR 産物の正しいサイズを決定した後、T7_12A-Fluc のための〜 1.7 kb、T7_Kozak-Rluc のための〜 1.0 kb、市販の PCR 精製キットを使用してそれを精製する。100μ l のヌクレアーゼ自由水を使用して DNA を溶出します (図 2b)。</li>
	<li>一旦精製した後、分光光度計を用いて DNA の濃度を確認し、A260/A280 比 (〜 1.8-2.0 が許容される) を決定する。</li>
	<li>精製された DNA を-20 ° c で保存するか、またはインビトロ転写に使用してください。</li>
</ol>2. インビトロ転写による mRNA の生成
<ol><li>
PCR 産物からインビトロで RNA を合成し、in vitro 転写キット (図 3a) を使用する。 注: T7_12A-Fluc および T7_Kozak-RLUC DNA テンプレートは、それぞれ 12a-Fluc および Kozak-Rluc mRNAs を合成するために使用されます。<ol>
<li>これを行うには、マイクロ遠心チューブを取り、次の順序で試薬を加えてください: DNase 自由水、NTP バッファミックス、キャップアナログ、テンプレート PCR 産物、T7 RNA ポリメラーゼ混合物 (表 4)。 注:他のキャッピングシステムはまた、製造業者の指示に従ってインビトロ転写後に RNA を順次キャップするために使用することができる。</li>
		<li>十分に混合し、2 h のための37° c で孵化しなさい。</li>
		<li>RNA 精製キットを用いて合成された RNA の精製に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>精製された RNA を 1.5% のアガローストリス-ホウ酸-EDTA (TBE) ゲル (0.5 μ g/mL エチジウムを含む) で泳動し、RNA を検査します。UV 照明器の下のゲルを視覚化します (図 3b)。</li>
	<li>分光光度計を使用して RNA の濃度を確認し、A260/A280 比 (〜 1.8-2.0 が許容される) を決定します。</li>
	<li>精製 RNA をアリコート、-80 ° c で保存します。</li>
</ol>3. 細胞への mRNA のトランスフェクト
<ol><li>種子 HeLa 細胞を24ウェルプレートに (約 80-90% コンフルエントである次の日)、5% の CO2で37° c のインキュベーター内で一晩インキュベートします。</li>
	<li>複数の感染の多重度 (MOI) でのワクシニアウイルス (VACV) を細胞に感染するか、または感染していない HeLa 細胞を比較します。 注:MOI は、細胞当たりの感染性ウイルス粒子の数です。</li>
	<li>の MOI X = {[(細胞数× X)/ウイルス力価] * 1000} μ l 1 mL 培地あたり。</li>
	<li>
所望の h ポスト感染 (hpi) (本実験では 10-12 hpi) の後、トランスフェクト mRNA (24 ウェルプレートの1ウェルあたりの全 mRNA の 500 ng) をカチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いて図 3cに示す。
	<ol>
<li>24ウェルプレートの1つのウェルについて、1つの Rluc チューブ中に 480 ng の12A 配列の Fluc (12A-2-2) mRNA および 20 ng の Kozak 配列レニラルシフェリンルシフェラーゼ (Kozak-マイクロ遠心) mrna を混合する。別のマイクロ遠心チューブで、カチオン性脂質トランスフェクション試薬の1.1 μ l を添加する。</li>
		<li>両方の管の減らされた血清の媒体の55μ l を加えなさい。混合し、室温で5分間インキュベートします。</li>
		<li>5分間のインキュベーションの後、チューブを含有する mRNA 中に減少した血清培地を含む55μ l カチオン性脂質トランスフェクション試薬を加える。</li>
		<li>優しく、十分に混合し、室温で15分間インキュベートします。</li>
		<li>インキュベーションの間、細胞培養培地を除去し、24ウェルプレートのウェルあたりの減少した血清培地400μ l を加えた。</li>
		<li>インキュベートした後、24ウェルプレートの1つのウェルに滴下して均等に100μ l の混合物を加えます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ルシフェラーゼ活性の測定
<ol><li>12A-Fluc および Kozak-Rluc mRNA の5時間の再トランスフェクションは、2つのレポーターアッセイ (例えば、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイキット) を行うことができるルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼ活性を測定します。</li>
	<li>減少した血清培地を除去し、150μ l 1x 溶解バッファーを加えて細胞を溶解し、ルシフェラーゼ測定キットの成分とする。</li>
	<li>室温で10分間インキュベートした後、細胞を廃棄することによって溶解物を回収し、マイクロ遠心管に移す。</li>
	<li>溶解液を4° c で10分間 12000 x gで遠心分離し、細胞デブリをペレットにします。</li>
	<li>不透明な壁の96に30μ l の上澄みを加え、しっかりとした底を有する白色アッセイプレート。</li>
	<li>ルシフェラーゼアッセイキットとマルチモードプレートリーダールミノメーターを使用して、二重発光を測定します。</li>
	<li>表 5に記載されている設定を使用して、動力学関数 (ウェル単位) を使用して測定を実行します。 注:読書はまた手動ルミノメーターを使用して取ることができる。キュヴェットの Fluc のための等量の溶解物および基質を加えなさい。2秒待ってから、ルミノメーターを使用して10秒間測定します。Fluc 測定の後、すぐにルミノメーターからキュベットを取り出し、手動で Rluc のために同じ体積の基板を追加します。もう一度、2秒待って、ルミノメーターを使用して 10 s のために測定して下さい。</li>
	<li>発光読み取りデータを望ましいファイル形式にエクスポートします。</li>
	<li>非感染および VACV に感染した HeLa 細胞において、Fluc 値を内部制御 Rluc 値で割ることにより、Fluc mRNA からの相対移動率を求めます。 注:補足図 1は、相対的な Fluc アクティビティを取得するための生データのステップごとの分析を示しています。</li>
</ol>

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著者は、競合する金銭的利益を宣言したいと思います。

全ての4コアステップは、in vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイの成功にとって重要である。プライマーの設計、特に T7 プロモーター配列には特別な注意が払われるべきである。T7 RNA ポリメラーゼは、5 '-UTR 配列の前に追加された T7 プロモーターにおいて下線が付いた最初の G (gGG-5'-UTR-AUG-) からの転写を開始する。転写開始部位 (TSS) は、5 ' 末端で最初の G から開始するが、T7 プロモーター領域では G の3未満の数を減少させることは、RNA の収率/出力を in vitro 転写から減少させた。実験の間、RNA の収量と質の両方が低かったので、ゲル精製 DNA 産物はインビトロ転写に最適ではなかったことが観察された。1% のアガロースゲル電気泳動で 5-10% の PCR 反応を実行し、サイズを決定し、残りの 90-95% を精製し、PCR 精製キットを使用してインビトロ転写に使用しました。PCR からの非特異的増幅の場合、ゲルから所望のサイズのバンドを切断し、ゲル精製した DNA 断片を使用することが推奨されます。収率が低い可能性があるの...

セントラルドグマによると、遺伝情報は DNA から RNA へ、そして最終的にタンパク質1,2に流れます。この遺伝情報の流れは、mRNA 翻訳3,4を含む多くのレベルで高度に調節されている。遺伝子発現の調節を測定するレポーターアッセイの開発は、このプロセスに関与する規制メカニズムの理解を容易にします。ここでは、ポックスウイルスに感染した細胞において、in vitro 転写 RNA ベースのルシフェラーゼを用いた mRNA 翻訳を研究するためのプロトコールについて述べる。
ポックスウイルスは、多くの非常に危険なヒトおよび動物病原体5を含む。他のすべてのウイルスと同様に、ポックスウイルスはタンパク質合成6、7、8のための宿主細胞機械に独占的に依存しています。ウイルスは、ウイルスタンパク質を効率的に合成するために、ウイルス mRNAs7,8の翻訳にリダイレクトするために細胞翻訳機械をハイジャックする多くの戦略を進化させました。ウイルスによって一般的に採用されているメカニズムの1つは、 cisの作用する要素をトランスクリプトに使用することです。顕著な例には、内部リボソーム進入部位 (IRES) およびキャップ非依存性翻訳促進剤 (引用)9、10、11が含まれる。これらのシス元素は、ウイルス転写物を多様なメカニズム12,13,14を介して翻訳機械を誘致することによって翻訳優位にレンダリングする。100以上のポックスウイルス mRNAs は、5 '-非翻訳領域 (5 '-UTR) において進化的に保存されたシス作用素子を有する: これらの mRNAs15,16の非常に 5 ' 末端の 5 '-ポリ (a) リーダー。これらの 5 '-ポリ (A) リーダーの長さは不均一であり、転写17,18の間にポックスウイルスで符号化された RNA ポリメラーゼの滑りによって生成される。我々、および他の人は、最近、5 '-ポリ (A) リーダーがワクシニアウイルス (VACV) に感染した細胞の mRNA に翻訳優位を与えることを発見し、ポックスウイルス19,20のプロトタイプメンバーである。
In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染19,21の間の mRNA 翻訳における 5 '-ポリ (A) リーダーの役割を理解するために最初に発達しました。プラスミド DNA 系ルシフェラーゼのレポーターアッセイは広く使用されていますが、ポックスウイルスに感染した細胞では結果の解釈が複雑になる欠点がいくつかあります。まず、プラスミドは、VACV 感染細胞22で複製することができる。第2に、不可解な転写は、しばしばプラスミド DNA18、23、24から生じる。第3に、VACV プロモーター駆動転写は、不均一な長さのポリ (A) −リーダーを生成し、その結果、いくつかの実験18においてポリ (a) −リーダーの長さを制御することを困難にする。インビトロ転写された RNA ベースのルシフェラーゼは、これらの問題を回避し、データの解釈は簡単です。
この方法には、(1) ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の4つの主要なステップがあり、in vitro 転写のための DNA テンプレートを生成します。(2) mRNA を生成するインビトロ転写;(3) 細胞内に mRNA を送達するトランスフェクションおよび (4) 変換の指標としてのルシフェラーゼ活性の検出 (図 1)。得られた PCR アンプリコンは、5 ' 〜 3 ' 方向に以下の元素を含有する: T7 プロモーター、ポリ (A) リーダー、または所望の 5 '-UTR 配列は、ホタルルシフェラーゼオープンリーディングフレーム (ORF) に続いて、ポリ (A) テールを有する。PCR アンプリコンは、T7 ポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって mRNA を合成する鋳型として使用される。In vitro 転写の間、m7G キャップまたは他のキャップアナログは、新たに合成された mRNA に組み込まれる。証明された転写物は未感染または VACV 感染細胞にトランスフェクトします。.細胞溶解物をトランスフェクション後の所望の時間に収集し、トランスフェクトされた mRNA からのタンパク質産生を示すルシフェラーゼ活性を測定します。このレポーターアッセイは、5 '-UTR、3 '-UTR、またはその他の mRNA の領域に存在するシス要素による翻訳調節を研究するために使用することができます。さらに、in vitro 転写された RNA ベースのアッセイは、キャップ依存性の開始、キャップ非依存の開始、再開始および IRES のような内部開始を含む翻訳開始の異なるメカニズムを研究するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 マスターミックス</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0492</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA キャップ構造アナログ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td>ス <td>S1411L</td><td>アンチリバースキャップアナログまたは ARCA</td></tr><tr><td>コーニング 96 ウェルハーフエリア 白色平底ポリスチレンマイクロプレート</td><td>コーニング</td><td>3693</td><td>不透明な壁 96 ウェル ソリッドボトム</td></tr><tr><td>の白色プレートデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>デュアルルシフェラーゼアッセイキット (DLAK)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. サイクルピュアキット</td><td>OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td><td>PCR purification kit</td></tr><tr><td>GloMax Navigator マイクロプレート ルミノメーター</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>マルチモードプレートリーダー ルミノメーター</td></tr><tr><td>HiScribe T7 クイックハイイールドRNA合成キット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E2050S</td><td>体外転写キット</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>11668019 カチオン性脂質トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-2000</td><td>DNAおよびRNA濃度の測定に使用</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31985070</td><td>還元型血清培地</td></tr><tr><td>ピュアリンクRNAミニキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12183018A</td><td>RNA精製キット</td></tr><tr><td>ワクシニア キャッピング システム</td><td>ニュー イングランド バイオラボ</td><td>M2080</td><td>キャッピング システム</td></tr></tbody></table>

インビトロ転写される rna ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

ウイルス DNA 複製後に転写されるすべてのポックスウイルス mRNA は、5 '-UTR において進化的に保存された、非テンプレート 5 '-ポリ (A) リーダーを有する。ポックスウイルス感染時の mRNA 翻訳における 5 ' ポリ (A) リーダーの役割を分析するために、in vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼのレポーターアッセイを開発しました。このレポーターアッセイは、4つのコアステップで構成されています:(1) PCR 法転写のための DNA テンプレートを増幅します。(2) T7 RNA ポリメラーゼを用いて mRNA を生成する in vitro 転写;(3) インビトロで転写した mRNA を細胞内に導入するトランスフェクション。(4) 翻訳の指標としてのルシフェラーゼ活性の検出ここで説明した RNA ベースのルシフェラーゼレポーターアッセイは、ポックスウイルス感染細胞におけるプラスミド複製の問題と、プラスミドからの不可解な転写を回避します。このプロトコルは、ポックスウイルス感染細胞以外の系で 5 '-UTR および 3 '-UTR を含む mRNA 中のシス要素による翻訳調節を決定するために用いることができる。さらに、この方法を使用して、キャップ依存性、キャップ非依存、再開始、および内部開始などのさまざまな変換開始モードを調べることができます。

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼの4つのステップは、レポーターアッセイ: in vitro 転写のための DNA テンプレートを生成するために、インビトロで、mRNA を生成する転写、mRNA トランスフェクション、およびルシフェラーゼ測定、スケマティックダイアグラムで見ることができます (図 1)。DNA テンプレート (Fluc および Rluc) の両方のためのプライマーの設計および突出部延長 PCR の一般的なスキームが概略図に示されている (図 2a)。PCR の後、適切なサイズの PCR 産物が、タエアガロースゲル電気泳動によって検出されました (図 2b)。続いて、インビトロで RNA を合成するための鋳型として PCR 産物を使用し (図 3a)、これを精製し、TBE ゲル電気泳動で実行してサ...

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼを使用してポックスウイルスに感染した細胞で mRNA 翻訳調節を研究するためのプロトコールを提示します。このアッセイは、5 '-非翻訳領域 (UTR) および 3 '-UTR を含む、mRNA のシス要素による翻訳調節を研究するために使用することができます。この方法を使用して、異なる翻訳開始モードを調べることもできます。

インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

インビトロ転写RNAベースのルシファーゼアッセイのプロトコルは、ポックスウイルス感染細胞の翻訳調節を研究するのに役立ちます。さらに、ポリ(A)リットルのカスタマイズされた長さは、翻訳に対するその規制の影響を研究することができます。この技術の主な利点は、mRNAおよび翻訳開始の広いスペクトルにおける5'UTRおよび3'UTRのようなCis要素による翻訳調節の研究を可能にすることです。インビトロ転写されたRNAベースのルシファーゼレポーターアッセイは、キャップおよびその他の修飾に修飾を組み込み、翻訳に対する効果をテストするために使用するように調整され得る。まず、前方および逆プライマーを設計して、5〜3'方向に次の要素を含むPCRアンプリコンを生成する:T7-プロモーター、ポリ(A)リットル、T7_12A-Flucと呼ばれるポリ(A)尾部のホタルルシファーゼORFは、前方プライマーにいくつかの余分なヌクレオチドを含み、その後にT7プロモーターポリ(A)リットルまたは所望ましい5'UTR配列および約20ヌクレオチドを含むレポーター遺伝子のORFの5'末端に対応する溶融温度に基づいてプライマー長を調整し、プライマー内の対応する領域が遺伝子のセンス鎖と同一であることを確認します。次に、ポリ(A)尾と約20ヌクレオチドを含むようにリバースプライマーを設計します。レポーター遺伝子のORFの3'末端に対応する溶融温度に基づいて調整し、プライマーの対応する領域が遺伝子のアンチセンス鎖と同じであり、フレーム内停止コドンがPoly(A)尾の前に存在することを確認します。内部制御の場合は、5'~3'方向に次の要素を含むプライマーの別のセットを設計します:T7-プロモーター、コザック配列、レニラルシファーゼORF、およびポリ(A)テールを含むランダムな5'UTRコードシーケンスは、T7_Kozak-ルクと呼ばれます。反応をセットアップするには、PCRチューブに次の順序で試薬を加えます:DNaseフリーウォーター、2X高忠実度DNAポリメラーゼ、プライマーおよび配列確認されたルシファーゼテンプレートDNA。標準的な3段階PCRサイクルでDNAテンプレートを生成した後、分子量標準と共に1%アガロースTAEゲル電気泳動でPCR反応の5〜10%を実行してPCR産物を検出します。PCR産物のサイズを決定するには、UVイルミエータの下でゲルを視覚化します。PCR産物の正しいサイズを決定した後、100マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を使用して市販のPCR精製キットを使用して、DNAを溶出させます。分光光度計を用いて精製したDNAの濃度を確認し、すぐにインビトロ転写に使用するためにマイナス20°Cで保存します。PCR産物からRNAを合成するには、マイクロ遠心分離管に次の試薬を加えます:DNase-RNaseフリーウォーター、NTPバッファーミックス、キャップアナログ、PCR製品テンプレート、およびIn vitroトランスクリプションキットからT7-RNAポリメラーゼミックス。よく混ぜます。37°Cで2時間インキュベートし、RNA精製キットを使用して合成されたRNAの精製に進みます。精製されたRNAを確認するには、RNAを70度で5分間加熱し、二次構造を除去し、1.5アガロースTBEゲルで実行します。次に、UVイルミエーターの下でゲルを視覚化します。分光光度計を用いて精製したRNAの濃度を確認します。アリコートはそれをし、マイナス80度で保存します。24ウェルプレートにHeLa細胞を播種して翌日80~90%の合流を達成し、5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーターで一晩インキュベートします。5の感染の多重度でヒラ細胞をワクシニアウイルスに感染させ、比較のために感染していないHeLa細胞を保つ。その後、10〜12時間5%の二酸化炭素で37度のプレートをインキュベートします。感染後の所望時間の後、ホタルルシファーゼmRNAを含む12A配列の480ナノグラムと1つのマイクロ遠心チューブにレニラルシファーゼmRNAを持つコザック配列の20ナノグラムを混合する。別のマイクロ遠心分離チューブに、カチオン性脂質トランスフェクション試薬1.1マイクロリットルを加える。両方のチューブに55マイクロリットルの減らされた血清培地を加え、室温で5分間混合してインキュベートします。次に、減らされた血清培地を含む55マイクロリットルのカチオン性脂質トランスフェクション試薬を、チューブをmRNAに加える。ピペットと軽く、しかし十分に混ぜ、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション中に、細胞から細胞培養培地を取り出し、1ウェルあたり400マイクロリットルの減らされた血清培地を加える。インキュベーションが完了したら、24ウェルプレートのウェルごとに100マイクロリットルの混合物を加えます。12A FlucとKozak Rluc mRNAとの共トランスフェクション後5時間、細胞から還元された血清培地を除去し、ルシファーゼアッセイキットから150マイクロリットル1Xの溶菌バッファーを2つのレポーターアッセイを行うことができる。室温で10分間インキュベートした後、ゴムと滅菌シリンジを使用して細胞を掻き取り、マイクロ遠心チューブに移します。ペレット細胞の破片に、摂氏4度で10分間12,000回gのリセートを遠心分離する。不透明な壁の96ウェルのウェルあたり30マイクロリットルの上澄み物を固体底とよく白いアッセイプレートに移す。ルシファーゼアッセイキットとマルチモードプレートリーダールミノ計を使用して、原稿に記載されているように、キネティクス機能を使用して二重発光を測定します。発光読み取りデータを望ましいファイル形式にエクスポートした後、Fluc値を内部コントロールRluc値で割ることにより、感染していないHeLA細胞およびVACV感染HeLA細胞の12A Fluc mRNAからの相対翻訳速度を決定する。このアッセイは、感染していない細胞およびVACV感染細胞に5'Poly(A)リットルを含むFluc mRNAの翻訳効率をテストするために使用された。感染していない細胞とVACV感染細胞の両方がFlucおよびRluc mRNAとの共感染に成功した。FlucをRlucで分割すると、細胞内のRNA安定性におけるトランスフェクション効率が正常化した。mRNAを含む5'ポリ(A)リットルは、未感染細胞と比較して、VACV感染時に翻訳上の利点を有する。これは、MRNAトランスフェクションの5時間後に未感染細胞とVACV感染細胞においてRNAレベルが類似していたため、差動トランスフェクション効率またはmRNA安定性によるものではなかった。プライマーを設計する際には、PCR反応効率だけでなく、増幅DNAを必要とするすべての下流プロセスにも影響を与える可能性がありますので、特別な注意を払ってください。この方法は、Cis要素による翻訳調節を迅速にテストするための重要なアッセイです。可能であれば、この方法は他の相補的な実験によって裏付けられるべきです。ワクシニアウイルスを使用している間は予防措置を講じ、臭化エチジウムやフェノールなどの化学物質への暴露を避けるべきです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

本手法では、Gaussiaルシフェラーゼ（GLuc）遺伝子を含む線状化プラスミドから、キャップ付きおよびキャップなしの両方のmRNAを高収量でin...

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

このビデオでは、組換えルシフェラーゼと蛍光タンパク質発現バイレポーターのインフルエンザAウイルスを使用して、マウスモデルでウイルス感染を追跡する方法を示します。この方法により、in vivo と ex vivo...

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アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

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学ぶ インビトロ転写RNAベースのルシフェラーゼアッセイを用いたポックスウイルス感染細胞における翻訳調節の研究方法。mRNAの5'UTRや3'UTRなどのシス要素による翻訳制御を解析し、ウイルス感染機構の理解に貢献する。

インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

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