Name: 腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶ マイクロRNA標的の同定と検証プロトコル。SRBアッセイ、リアルタイムPCR、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、がん細胞増殖におけるmiRNA機能を評価する方法です。

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本研究は、文部科学省の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)を通じて基礎科学研究プログラム(2017R1D1A3B03035662)の支援を受けた。とハリム大学研究基金, 2017 (HRF-201703-003).

<ol><li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nature Reviews Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li>
<li>Park, J. K., Doseff, A. I., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+Targeting+Caspase-3+and+-7+in+PANC-1+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs Targeting Caspase-3 and -7 in PANC-1 Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Park, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs-103%2F107+coordinately+regulate+macropinocytosis+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs-103/107 coordinately regulate macropinocytosis and autophagy.</a> Journal of Cell Biology. 215 (5), 667-685 (2016).</li>
<li>Henry, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-199a-3p+targets+CD44+and+reduces+proliferation+of+CD44+positive+hepatocellular+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">miR-199a-3p targets CD44 and reduces proliferation of CD44 positive hepatocellular carcinoma cell lines.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 403 (1), 120-125 (2010).</li>
<li>Hoefert, J. E., Bjerke, G. A., Wang, D., Yi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family+coordinately+regulates+cell+adhesion+and+proliferation+in+hair+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family coordinately regulates cell adhesion and proliferation in hair morphogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 217 (6), 2185-2204 (2018).</li>
<li>Anfossi, S., Fu, X., Nagvekar, R., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%2C+Regulatory+Messengers+Inside+and+Outside+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs, Regulatory Messengers Inside and Outside Cancer Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1056, 87-108 (2018).</li>
<li>Khoshinani, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+miR-155%2FFOXO3a+and+miR-222%2FPTEN+in+acquired+radioresistance+of+colorectal+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Radiology%22%5BJournal%5D)">Involvement of miR-155/FOXO3a and miR-222/PTEN in acquired radioresistance of colorectal cancer cell line.</a> Japanese Journal of Radiology. 35 (11), 664-672 (2017).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-155+increases+colon+cancer+chemoresistance+to+cisplatin+by+targeting+forkhead+box+O3%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-155 increases colon cancer chemoresistance to cisplatin by targeting forkhead box O3.</a> Oncology Letters. 15 (4), 4781-4788 (2018).</li>
<li>Catanzaro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+miR-107%2C+miR-181c+and+miR-29a-3p+Promote+Activation+of+Notch2+Signaling+in+Pediatric+High-Grade+Gliomas+%28pHGGs%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Loss of miR-107, miR-181c and miR-29a-3p Promote Activation of Notch2 Signaling in Pediatric High-Grade Gliomas (pHGGs).</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), (2017).</li>
<li>Akbari Moqadam, F., Pieters, R., den Boer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hunting+of+targets%3A+challenge+in+miRNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The hunting of targets: challenge in miRNA research.</a> Leukemia. 27 (1), 16-23 (2013).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+RNA+extraction+from+tissues+for+microRNA+and+target+gene+expression+analysis%3A+not+all+kits+are+created+equal%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Total RNA extraction from tissues for microRNA and target gene expression analysis: not all kits are created equal.</a> BMC Biotechnology. 18 (1), (2018).</li>
<li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Molecular Cell. 46 (6), 893-895 (2012).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Park, J. K., Seo, J. S., Lee, S. K., Chan, K. K., Kuh, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Antitumor+Activity+of+Oxaliplatin+with+Epigenetic+Modifying+Agents%2C+5-Aza-CdR+and+FK228%2C+in+Human+Gastric+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Antitumor Activity of Oxaliplatin with Epigenetic Modifying Agents, 5-Aza-CdR and FK228, in Human Gastric Cancer Cells.</a> Biomolecules & Therapeutics. 26 (6), 591-598 (2018).</li>
<li>Xia, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+miR-301a-3p+sensitizes+pancreatic+cancer+cells+to+gemcitabine+treatment+via+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Downregulation of miR-301a-3p sensitizes pancreatic cancer cells to gemcitabine treatment via PTEN.</a> American Journal of Translational Research. 9 (4), 1886-1895 (2017).</li>
<li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+MicroRNA+miR-107+regulates+cyclin-dependent+kinase+6+expression+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of MicroRNA miR-107 regulates cyclin-dependent kinase 6 expression in pancreatic cancer.</a> Pancreatology. 9 (3), 293-301 (2009).</li>
<li>van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Research Notes. 8, 47(2015).</li>
<li>Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+MTT+and+MTS-based+assays+for+measurement+of+antiproliferative+activity+of+green+tea+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols.</a> PloS One. 5 (4), e10202(2010).</li>
<li>Wu, L., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let+me+count+the+ways%3A+mechanisms+of+gene+regulation+by+miRNAs+and+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Let me count the ways: mechanisms of gene regulation by miRNAs and siRNAs.</a> Molecular Cell. 29 (1), 1-7 (2008).</li>
<li>Jin, Y., Chen, Z., Liu, X., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+microRNA+targeting+sites+by+luciferase+reporter+gene+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the microRNA targeting sites by luciferase reporter gene assay.</a> Methods in Molecular Biology. , 117-127 (2013).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+binds+to+AKT+and+promotes+cancer+cell+survival+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein binds to AKT and promotes cancer cell survival and proliferation.</a> Tumour Biology. 37 (11), 14999-15005 (2016).</li>
<li>Pan, Z. Z., Bruening, W., Giasson, B. I., Lee, V. M., Godwin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+promotes+cancer+cell+survival+and+inhibits+stress-+and+chemotherapy+drug-induced+apoptosis+by+modulating+MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (38), 35050-35060 (2002).</li>
<li>Martinez-Sanchez, A., Murphy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Target+Identification-Experimental+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Target Identification-Experimental Approaches.</a> Biology (Basel). 2 (1), 189-205 (2013).</li>
<li>Lee, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+profiling+identifies+microRNA+signature+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression profiling identifies microRNA signature in pancreatic cancer.</a> International Journal of Cancer. 120 (5), 1046-1054 (2007).</li>
<li>Nuovo, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+methodology+for+the+combined+in+situ+analyses+of+the+precursor+and+mature+forms+of+microRNAs+and+correlation+with+their+putative+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A methodology for the combined in situ analyses of the precursor and mature forms of microRNAs and correlation with their putative targets.</a> Nature Protocols. 4 (1), 107-115 (2009).</li>
<li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44 (1), 31-38 (2008).</li>
<li>Diederichs, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+argonautes+in+microRNA+processing+and+posttranscriptional+regulation+of+microRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression.</a> Cell. 131 (6), 1097-1108 (2007).</li>
<li>Orellana, E. A., Kasinski, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+B+%28SRB%29+Assay+in+Cell+Culture+to+Investigate+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocol%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine B (SRB) Assay in Cell Culture to Investigate Cell Proliferation.</a> Bio Protocol. 6 (21), (2016).</li>
<li>Lawrie, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Reviews%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in hematological malignancies.</a> Blood Reviews. 27 (3), 143-154 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nature Protocols. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Xing, Z., Li, D., Yang, L., Xi, Y., Su, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and anticancer drugs.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 46 (3), 233-239 (2014).</li>
<li>Moeng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-107+Targets+IKBKG+and+Sensitizes+A549+Cells+to+Parthenolide%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-107 Targets IKBKG and Sensitizes A549 Cells to Parthenolide.</a> Anticancer Research. 38 (11), 6309-6316 (2018).</li>
<li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+combination+studies+and+their+synergy+quantification+using+the+Chou-Talalay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method.</a> Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).</li>
<li>Flamand, M. N., Gan, H. H., Mayya, V. K., Gunsalus, K. C., Duchaine, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-canonical+site+reveals+the+cooperative+mechanisms+of+microRNA-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A non-canonical site reveals the cooperative mechanisms of microRNA-mediated silencing.</a> Nucleic Acids Research. 45 (12), 7212-7225 (2017).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

miRNAの複数の役割を理解するためには、関心のあるmiRNAの機能を有するボナ・フィドmiRNA標的の決定のための戦略が不可欠である。miRNA標的遺伝子の同定は、細胞内のmiRNAによって調節された細胞シグナル伝達事象を解釈するためのガイドラインでありうる。miRNAの機能的に重要な標的遺伝子の発表は、がんにおけるmiRNAベースの治療法を開発するための基礎知識を提供することができます。
マイクロアレイ、小さなRNAライブラリーシーケンシング、深いシーケンシング、その場PCRにおける逆転写酵素、およびノーザンブロッティングなどのいくつかの方法は、細胞株および組織から単離された総RNAを用いてmiRNA発現レベルを探索するために適用することができる24、 25、26.miRNAの高スループットプロファイリングは、がん発症の遺伝的基盤に関する貴重な洞察を提供します。プローブベースのmiRNAアッセ...

マイクロRNA(miRNA)は、主にボナフィード標的遺伝子1の3'非翻訳領域(3'UTR)に反応することにより、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳および分解のプロセスを調節する小さな調節RNAです。miRNAの発現は、転写および転写後のメカニズムによって調節することができる。このような調節機構の不均衡は、癌2を含む多数の疾患において制御不能で特徴的なmiRNA発現レベルをもたらす。単一のmiRNAは、多様なmRNAとの複数の相互作用を持つことができます。それに応じて、個々のmRNAは様々なmiRNAによって制御することができる。したがって、細胞内シグナル伝達ネットワークは、生理的障害および疾患が開始され、悪化することができる特徴的に発現したmiRNAによって複雑に影響され、2、3、4、5,6.miRNAの発現の変化は様々な種類の癌で観察されているが、miRNAと共に癌細胞のマナーを調節する分子機構は依然としてほとんど知られていない。
蓄積された証拠は、miRNAの発癌または腫瘍抑制の役割が癌の種類に依存することを示している。例えば、フォークヘッドボックスo3(FOXO3)を標的とすることにより、miR-155は、大腸癌7、8の細胞増殖、転移、および化学耐性を促進する。対照的に、神経膠腫細胞侵襲の制限は、神経原性遺伝子座ノッチホモログタンパク質2(NOTCH2)発現9の調節を介してmiR-107によって誘導される。miRNA機能に関連するmiRNA標的相互作用の評価は、miRNAが健康な状態と病気状態の両方で様々な生物学的プロセスを調節する方法をよりよく理解するために不可欠な部分です 10.さらに、miRNAのボナ・フィデス・ターゲットの発見は、様々な抗癌剤を用いてmiRNAベースの治療に対する微調整された戦略をさらに提供することができる。しかし、miRNAの分野における主な課題は、miRNAの直接標的の同定です。ここで、miRNA標的遺伝子決定に対する再現可能な実験的アプローチとして詳細な方法を提示する。miRNA標的同定のための実験設計の成功には、様々なステップと考慮事項が含まれます(図1)。腫瘍細胞および正常細胞における成熟したmiRNAレベルの比較は、目的のmiRNAを選択する一般的な手順の1つでありうっていう(図1A)。細胞増殖に対するmiRNAの効果を検出するために選択されたmiRNAの機能的研究は、目的とするmiRNAの最良の候補標的のリストを絞り込む必要がある(図1B)。miRNAの実験的に検証された機能に基づいて、miRNA標的予測プログラムを用いた文献とデータベースの系統的レビューが、遺伝子機能に関する最も関連性の高い情報を検索する必要がある(図1C)。目的とするmiRNAの実際の標的遺伝子の同定は、遺伝子の3'UTRのクローニング、リアルタイムPCR、およびウェスタンブロッティング(図1D)と共にルシフェラーゼアッセイなどの実験を実施することによって達成することができる。現在のプロトコルの目的は、主要な実験の包括的な方法を提供することです, プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応 (PCR), スルフォルホダミンB (SRB) アッセイは、miRNA模倣トランスフェクションに続く, 用量応答曲線生成,遺伝子の3'UTRのクローニングと共にルシフェラーゼアッセイ。現在のプロトコルは、個々のmiRNAの機能と癌治療におけるmiRNAの意味をより良く理解するのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>SPL Life Sciences</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>6x DNA ローディング色素</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>RD006</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>8キャップストリップ</td><td>適用バイオシステム</td><td>N8010535</td><td>cDNA合成用</td></tr><tr><td>8チューブストリップ</td><td>応用バイオシステム</td><td>ズ N8010580</td><td>cDNA合成用</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>ファルコン</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ</td><td>A6283-1L</td><td>1 L</td></tr><tr><td>アガロース A</td><td>バイオベーシック</td><td>D0012</td><td>500 g</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0290S</td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bio basic Canada Inc</td><td>AB0028</td><td>25 g</td></tr><tr><td>AriaMx 96 チューブストリップ</td><td>Agilent Technologies</td><td>401493</td><td>リアルタイム PCR 用</td></tr><tr><td>AriaMx リアルタイム PCR システム</td><td>Agilent Technologies</td><td>G8830A</td><td>qPCR 増幅、検出、データ解析</td></tr><tr><td>AsiSI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0630</td><td>10,000 units/mL</td></tr><tr><td>CAPAN-1 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-79</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フード</td><td>Labtech</td><td></td><td>モデル:LCB-1203B-A2</td></tr><tr><td>Vスラッシュ付きカウンティングチャンバー</td><td>Paul Marienfeld</td><td>650010</td><td>細胞カウンター</td></tr><tr><td>CutSmartバッファー</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>B7204S</td><td>10倍濃度</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>DNAゲル抽出キット</td><td>バイオニクス</td><td>DN30200</td><td>200 prep</td></tr><tr><td>DNA ladder</td><td>NIPPON Genetics EUROPE</td><td>MWD1</td><td>1 Kb ladder</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td>100 units</td></tr><tr><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>100 アッセイ</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HIT competent cells</td><td>リアルバイオテック株式会社(RBC)</td><td>RH617</td><td>コンピテントセル</td></tr><tr><td>HPNE細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-4023</td><td></td></tr><tr><td>LB寒天培液</td><td>バイオベーシック</td><td>SD7003</td><td>250 g</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>0.75 mL</td></tr><tr><td>リポフェクタミン RNAiMax</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td>0.75 mL</td></tr><tr><td>ルミノメーター</td><td>Promega</td><td></td><td>モデル:E5311</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>TECAN</td><td></td><td>Infinite F50</td></tr><tr><td>miRNA control mimic</td><td>Ambion</td><td>4464058</td><td>5 nmole</td></tr><tr><td>miRNA-107 mimic</td><td>Ambion</td><td>4464066</td><td>5 nmole</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>50 prep</td></tr><tr><td>Mupid-2plus (電気泳動システム)</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>モデル: AD110</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189</td><td>20,000 units/mL</td></tr><tr><td>オリゴエクスプローラープログラム</td><td>GeneLink</td><td></td><td>プライマーデザイン用</td></tr><tr><td>光学チューブストリップキャップ (8x ストリップ)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>401425</td><td>リアルタイム PCR</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>500 Ml</td></tr><tr><td>PANC-1 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水</td><td>Gibco</td><td></td><td>14040117 1000 mL</td></tr><tr><td>プラスミド DNA miniprep S&Vキット</td><td>バイオニクス</td><td>DN10200</td><td>200 プレップ</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA ポリメラーゼ</td><td>TaKaRa</td><td>R050A</td><td>250ユニット</td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>TECAN</td><td></td><td>シェーキングプラットフォーム</td></tr><tr><td>シェーキングインキュベーター</td><td>Labtech</td><td></td><td>モデル: LSI-3016A</td></tr><tr><td>Sigmaplot 14 ソフトウェア</td><td>Systat Software Inc</td><td></td><td>用量反応曲線生成用</td></tr><tr><td>スルフォロダミン B粉末</td><td>Sigma</td><td>S1402-5G</td><td>5 g</td></tr><tr><td>SYBR グリーンマスターミックス</td><td>Smobio</td><td>TQ12001805401-3</td><td>dsDNA</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td>用結合蛍光色素 <td>TaKaRa</td><td>2011A</td><td>25,000 U</td></tr><tr><td>TaqMan マスターミックス</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td>200 反応、AmpErase なし</td></tr><tr><td>UNG TaqMan microRNA assay (has-miR-107)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>アッセイ ID:000443 (50RT, 150 PCR rxns)</td></tr><tr><td>TaqMan microRNA assay (has-miR-301)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4427975</td><td>Assay ID: 000528 (50RT, 150 PCR rxns)</td></tr><tr><td>TaqMan miR RT kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366597</td><td>1,000 reactions</td></tr><tr><td>Thermo CO2 incubator (BB15)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>37 &deg;C および 5% CO2 インキュベーション</td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸</td><td>Sigma</td><td>91228-100G</td><td>100 g</td></tr><tr><td>トリズマベース</td><td>Sigma</td><td>T4661-100G</td><td>100 g</td></tr><tr><td>超純水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Veriti 96 well サーマルサイクラー</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>DNA(または cDNA)の増幅用</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146</td><td>20,000単位/mL</td></tr></tbody></table>

腫瘍細胞におけるマイクロrnaレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

マイクロRNA(miRNA)は、癌を含むいくつかの疾患において多数の細胞内シグナル伝達経路を調節することが認識されている小さな調節RNAです。これらの小さな調節RNAは、主に標的メッセンジャーRNA(mRNA)の3'非翻訳領域(3'UTR)と相互作用し、最終的にはmRNAの復号プロセスの阻害および標的mRNA分解の増強をもたらす。発現レベルおよび細胞内機能に基づいて、miRNAは発癌性および腫瘍抑制性mRNAの調節因子として機能することができる。計算的に予測された数百または数千の標的の中でmiRNAのボナフィード標的遺伝子を同定することは、目的とするmiRNAの役割と基本的な分子機構を識別するための重要なステップです。可能なmiRNA-mRNA相互作用を検索するために、様々なmiRNA標的予測プログラムが利用可能です。しかし、最も困難な問題は、目的とするmiRNAの直接標的遺伝子を検証する方法です。このプロトコルは、miRNAの機能に関連するmiRNA標的を同定する方法に関する主要な方法の再現可能な戦略を説明する。このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイを用いてmiRNAレベル、機能、および関連する標的mRNAを明らかにするステップバイステップの手順に関する実用的なガイドを提示します。、用量応答曲線生成、およびルシフェラーゼアッセイは、個々のmiRNAの役割を適切に理解するために必要な遺伝子の3'UTRのクローニングと共に。

miRNAレベルの正常かつ正確な確認は、疾患の発症および進行におけるmiRNAの予想される役割に基づいてmiRNAの分類が可能なデータの解釈にとって重要である。miRNA-107およびmiRNA-301のレベルを、プローブベースの定量PCRを用いて3つの膵臓細胞株で測定した。特定のmiRNAと同じ反応における参照遺伝子の両方のcDNの合成は、データの再現性を高めることができる。PANC-1およびCAPAN-1はヒト膵管腺癌細胞株であり、HPNEはヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)遺伝子を抱えるレトロウイルス発現ベクターでトランスネクトされた不死化膵管細胞株である。miRNA-107はHPNE細胞と比較してPANC-1およびCAPAN-1細胞において有意に減少した(図2C)。miRNA-301のレベルは、HPNE細胞と比較してPANC-1およびCAPAN-1細胞において有意にアップレギュレートされた。これらの結果は、miRNA-107が膵臓癌細胞においてエピジェネティックに不活性化され、miRNA-301レベルが正常な膵管管細胞よりも膵管腺癌細胞において高いという以前の報告に従って、16、<sup ...

このプロトコルは、プローブベースのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、スルフォルホダミンB(SRB)アッセイ、3'未翻訳領域(3'UTR)クローニング、および目的のmiRNAの標的遺伝子を検証し、miRNAの機能を理解するためにルシフェラーゼアッセイを使用します。

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

マイクロRNA機能とのニューラルマイクロRNA標的相互作用にアクセスするには、MicroRNAが健康な状態と病気状態の両方で様々な生物学的プロセスをどのように調節するかを理解することが重要です。このプロトコルは、マイクロRNAの直接標的の検証が困難であるため、マイクロRNA標的および機能的マイクロRNAを同定する戦略を通じて再現を記述する。当社のプロトコルは、個々のマイクロRNAの機能と癌治療におけるマイクロRNAの影響に関する洞察を提供することができます。半最大阻害濃度の計算は、マイクロRNA研究だけでなく、他の抗癌薬の有効性評価のための重要な方法です。我々のプロトコルは、細胞内のマイクロRNAのレベルを理解するための基本的な方法を説明したので、新しい研究者に役立ちます。プロトコルを開始するには、セル カウンタを持つセルをカウントします。96ウェルプレートに細胞をプレートします。翌日、マイクロRNA制御模倣の複数の最終濃度で細胞をトランスフェクションするトランスフェクション混合物のセットを調製し、マイクロRNA-107を模倣する。25マイクロモルマイクロRNA対照模倣、またはmicroRNA-107模倣のストックから、マイクロ遠心チューブ中のトランスフェクション試薬と共に還元血清培地にミミックまたはマイクロRNA-107を希釈して追加します。マイクロピペットを用いてオリゴ含有混合物を軽く混ぜる。細胞培養フードに10分間インキュベーションした後、オリゴ含有混合物をもう一度軽く混ぜ、50マイクロリットルの混合物を各ウェルに加えます。トランスフェクトした細胞を細胞培養インキュベーターに保管してください。プレートの各ウェルに細胞培養培地を慎重に吸引し、速やかに100マイクロリットルの100マイクロリットルのトリクロロ酢酸(TCA)を各ウェルに充填します。10%TCAを含むプレートを摂氏4度で1時間保ちます。次に、水道水で浴槽に浸してプレートを数回洗います。水が残らなくなるまでプレートをタップして、井戸の中から余分な水を取り除き、プレートを乾燥させます。ピペット50マイクロリットルの0.4%SRB溶液は、ブランクウェルを含む各ウェルに。0.4%SRB溶液がウェルの底部を均等に覆うまでプレートをそっと振ります。その後、プレートを40〜60分間インキュベートする。インキュベーション後、非結合色素が完全に洗い流されるまで1%酢酸でプレートを洗います。ピペット100マイクロリットルの10ミリモルトリスベース溶液は、ブランクウェルを含む対応する井戸に。プレートをシェーカーの上に10分間置いておきます。492ナノメートルで吸光度を測定します。SRBアッセイの吸光度値を用いて、各群の平均吸光度と標準偏差の割合を計算します。処理濃度、平均吸光度、標準偏差などの生データを、データを垂直方向に整列させることでソフトウェアにインポートします。[グラフの作成] タブをクリックし、[単純な散布図のエラー バー] を選択します。[ワークシートの列] を [シンボルの値] として選択し、[次へ] をクリックします。[データフォーマット]パネルで、[X-Yペア]を選択し、[次へ]をクリックします。[データの選択] パネルで、対応するデータ列を選択します。[完了]をクリックしてプロットを作成します。X 軸をダブルクリックして、軸のスケールの種類を変更します。スケールの種類を線形から対数に変更します。開始範囲と終了範囲の番号をそれぞれ 0.01 と 200 に変更します。散布図を右クリックし、[カーブ フィット]を選択して、[ユーザ定義]サブカテゴリに移動します。線量応答曲線を選択します。次のボタンをクリックし、[完了] をクリックします。レポート タブに移動し、n、k、および R の値を確認します。付属のテキスト プロトコルで詳細に説明されているように PCR を実行します。次に、制限酵素Exo1とNot1を含む反応混合物をチューブに組み合わせて二重消化に移ります。37°Cの水浴で3〜4時間混合物をインキュベートします。1%アガロースゲルで二重消化製品を実行します。その後、UV光の下でバンドをカットします。二重消化PCR産物と切除バンドからのルシファーゼベクターを精製します。DNAリガーゼを含む20マイクロリットルのライゲーション反応混合物を調製することにより、PCR産物のルシファーゼベクターへのライゲーションを継続する。チューブを10〜15秒間短く遠心分離します。サーマルサイクラーを使用して、一晩摂氏16度で結紮をインキュベートします。翌日、管轄細胞を含むチューブにライゲーション混合物を加えて変換を行う。チューブを軽くタップし、氷の上に20分間置きます。30秒から1分間、42°Cのヒートブロックにチューブを素早くそっと移します。熱ショックの後、チューブを氷の上に20分間置きます。LB寒天プレート上の有能な細胞を広げます。一晩摂氏37度でインキュベーターで有能な細胞を成長させます。翌日、個々のコロニーを摘み取り、超純水を含む8ストリップチューブの1つに大腸菌を再中断し、このステップを繰り返して4個から8個の無作為に選択されたコロニーから大腸菌を再中断する。25マイクロリットルの大腸菌懸濁液を別の8ストリップチューブセットに移します。大腸菌懸濁液を用いてコロニーPCRを行う。ルシファーゼアッセイを24ウェルプレートで調製します。各ウェルに対して500マイクロリットルの細胞培養培地中の4つの細胞に1~2倍の10を加える。一晩インキュベーションした後、50ナノグラムのルシファーゼベクターを、トランスフェクション試薬を用いて、コントロールミミックまたは特異的マイクロRNA模倣を用いて細胞内に入る。翌日、リン酸緩衝生理食塩を使用してウェルの内側を2回洗います。200マイクロリットルのライシス試薬をウェルに塗布し、ルシファーゼ活性を測定する前に細胞ライシスを十分に行います。プレートを少なくとも15分間振っておいてください。5~10マイクロリットルの細胞溶解液を新しいチューブに移し、100マイクロリットルの試薬を1個加え、すぐにピペット処理で溶液を混合します。その後、イルミノメーターを使用してホタルルシメラーゼ活性を10〜15秒間読み取ります。同じチューブに100マイクロリットルの試薬2を加え、2回ピペットで混ぜます。最後に、イルミナメーターを使用して10〜15秒間レニラルシファーゼ活性を読み取ります。RTPCRは、HPNE細胞と比較してマイクロRNA-107およびPANC-1およびCAPAN-1細胞の有意な減少を示す。マイクロRNA-301のレベルは、HPNE細胞と比較して、PANC-1およびCAPAN-1細胞において有意にアップレギュレートされた。この研究のSRBアッセイは、PANC-1細胞の増殖がマイクロRNA-107模倣トランスフェクションに続いて減少したことを明確に示している。microRNA-107の11の潜在的な予測標的のスクリーニングは、腫瘍細胞増殖の正の調節因子であるシヌクレインガンマ(SNCG)のみがmicroRNA-107およびPANC-1細胞と直接相互作用することを明らかに示し、microRNA-107がSNCG発現を調節することによってPANC-1細胞の増殖を否定的に調節できることを示している。テトラヒドロレム系エンティティおよびCFSEを用いる成体細胞増殖アッセイは、細胞タイプに応じてマイクロRNA模倣などの効果をスクリーニングするために適用可能である。マイクロRNAの実験的に検証された機能に基づいて、ルシファーゼアッセイの前に候補標的のリストを絞り込むために、データベースとターゲット予測プログラムの体系的な見直しが必要です。抗癌薬とのマイクロRNAの併用効率の評価のために、組合せ指数の評価のための我々のプロトコルに基づいて調整されたIC値を計算することが有利である。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ターゲットIDのライブラリは、miRNAのターゲットを識別するために使用されるクローニングされたcDNAのプラスミドベースのゲノムワイドなコレクションです。ここでは、その使用してアプリケーションを示しています。...

ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）は、腫瘍サンプル中の様々なマイクロRNA（miRNA）分子の発現レベルを調査するために迅速かつ高感度な方法です。異なるmiRNA分子の何百ものこのメソッド式を使用して、増幅定量化し、同じcDNAをテンプレートから分析することができます。...

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

このビデオは、同所性マウスモデルにおける腫瘍増殖に対する治療薬としてのmiRNA阻害剤のin...

miRNA阻害剤による腫瘍内治療のモデリング:マウスモデルにおけるmiRNA阻害剤の腫瘍増殖への影響を分析する方法

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。...

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

miRNAを用いた乳がん組織におけるmiRNA発現の臨床病理学的解析<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

このレポートでは、高速かつ信頼性の高い携帯電話の miRNAs の mRNA ターゲットの検証方法について説明します。合成ビオチン化核酸 LNA のロックを用いた miRNA を模倣をキャプチャする使用していた方法は、mRNA をターゲットします。プルダウンにストレプトアビジン コートした磁気ビーズを採用するその後、ターゲット mRNA qPCR...

ビオチン ベース プルダウン法検証 mRNA をターゲットの携帯電話の miRNAs

がん患者からの血漿サンプル マイクロ Rna (Mirna) の循環の表現のレベルを評価するためのプロトコルを提案します。特に、マイクロ Rna 抽出および逆のトランスクリプションを循環させるため市販のキットを使用しました。最後に、斑点を付けられた前のリアルタイム プローブ カスタム プレートを使用して 24 選択した Mirna...

転移性大腸癌患者における循環マイクロ Rna カスタム パネルの検出

このプロトコルは、ヒト甲状腺腫瘍形成の異種移植片およびオルコトピックマウスモデルを、マイクロRNAベースの阻害剤治療を試験するプラットフォームとして説明する。このアプローチは、非コードRNAの機能と新しい治療標的としての可能性を研究するのに理想的です。...

マウスの腫瘍増殖を減少させるマイクロRNAの生体内阻害

miRNA の治療には、癌の進行を調節する重要な可能性があります。ここに示す解析的アプローチ、組合せ miRNA...

組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析

ここで説明する、生物学的に相乗的なmiRNAとその組み立てモジュールを短いトランス遺伝子に特徴付けるプロトコルであり、遺伝子治療用途に対する同時過剰発現を可能にする。...

神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶ マイクロRNA標的の同定と検証プロトコル。SRBアッセイ、リアルタイムPCR、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、がん細胞増殖におけるmiRNA機能を評価する方法です。

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

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