Name: サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 学ぶ デジタルPCRを用いたサルモネラ菌のフィットネスハイスループット分析法。ゲノムDNAバーコードで混合菌群から正確に定量し、株間の競争適応性を比較評価できます。

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この出版物で報告された研究は、ジョージ・F・ハディックス学長の教員研究基金と国立衛生研究所(NIH)の賞番号GM103427の下で国立一般医学研究所によって支援されました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

<ol><li>Beuzón, C. R., Holden, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mixed+infections+with+Salmonella+strains+to+study+virulence+genes+and+their+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo.</a> Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).</li>
<li>Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+mutations+in+invA+and+lpfC+on+the+ability+of+Salmonella+typhimurium+to+cause+murine+typhoid%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).</li>
<li>Vital, M., Hammes, F., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+of+Escherichia+coli+O157+with+a+drinking+water+bacterial+community+at+low+nutrient+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations.</a> Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).</li>
<li>Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+combining+immunofluorescence+and+flow+cytometry+for+improved+understanding+of+competitive+interactions+between+lactic+acid+bacteria+%28LAB%29+and+methicillin-resistant+S.+aureus+%28MRSA%29+in+mixed+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture.</a> Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Becker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Salmonella+metabolism+limits+possibilities+for+new+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials.</a> Nature. 440 (7082), 303(2006).</li>
<li>Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitness+cost+of+the+green+fluorescent+protein+in+gastrointestinal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria.</a> Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).</li>
<li>Santiviago, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pools+of+targeted+Salmonella+deletion+mutants+identifies+novel+genes+affecting+fitness+during+competitive+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice.</a> PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477(2009).</li>
<li>Ahmer, B. M., Gunn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Salmonella+spp.+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 101(2011).</li>
<li>Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+resistance+functions+in+Pseudomonas+aeruginosa+using+Tn-seq%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq.</a> MBio. 2 (1), (2011).</li>
<li>Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nature Methods. 6 (10), 767(2009).</li>
<li>van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome%E2%80%90wide+fitness+and+genetic+interactions+determined+by+Tn%E2%80%90seq%2C+a+high%E2%80%90throughput+massively+parallel+sequencing+method+for+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms.</a> Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).</li>
<li>Mutalik, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-barcoded+shotgun+expression+library+sequencing+for+high-throughput+characterization+of+functional+traits+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria.</a> Nature Communications. 10 (1), 308(2019).</li>
<li>Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR-based+competitive+index+for+high-throughput+screening+of+Salmonella+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors.</a> Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li>
<li>Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+redox+balance+by+the+stringent+response+regulatory+protein+promotes+antioxidant+defenses+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).</li>
<li>Poteete, A. R., Fenton, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%BB+red-dependent+growth+and+recombination+of+phage+P22%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">λ red-dependent growth and recombination of phage P22.</a> Virology. 134 (1), 161-167 (1984).</li>
<li>McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+SPI2+transcription+by+nitric+oxide-producing%2C+IFN%CE%B3-activated+macrophages+promotes+maturation+of+Salmonella+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).</li>
<li>Shaw, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+has+three+transketolase+enzymes+contributing+to+the+pentose+phosphate+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).</li>
<li>Freter, R., O'Brien, P., Macsai, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemotaxis+in+the+association+of+motile+bacteria+with+intestinal+mucosa%3A+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies.</a> Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).</li>
<li>Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+phoA+gene+fusions+to+identify+a+pilus+colonization+factor+coordinately+regulated+with+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).</li>
<li>Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethidium+monoazide+for+DNA-based+differentiation+of+viable+and+dead+bacteria+by+5%27-nuclease+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5'-nuclease PCR.</a> Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).</li>
<li>Nocker, A., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approaches+toward+preferential+detection+of+viable+cells+using+nucleic+acid+amplification+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques.</a> FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).</li>
<li>Nocker, A., Cheung, C. -Y., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+propidium+monoazide+with+ethidium+monoazide+for+differentiation+of+live+vs.+dead+bacteria+by+selective+removal+of+DNA+from+dead+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells.</a> Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).</li>
<li>Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+detection+of+live+bacteria+combining+propidium+monoazide+sample+treatment+with+microarray+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology.</a> Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).</li>
<li>Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+monitoring+of+disinfection+efficacy+using+propidium+monoazide+in+combination+with+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR.</a> Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).</li>
<li>Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+propidium+monoazide+for+live%2Fdead+distinction+in+microbial+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).</li>
<li>Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alternative+Electron+Acceptor+Tetrathionate+Supports+B12-Dependent+Anaerobic+Growth+ofSalmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+on+Ethanolamine+or+1%2C+2-Propanediol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol.</a> Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).</li>
<li>Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E.+coli+host+strains+significantly+affect+the+quality+of+small+scale+plasmid+DNA+preparations+used+for+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677(1993).</li>
<li>Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+disruption+in+Escherichia+coli%3A+Tc+R+and+Km+R+cassettes+with+the+option+of+Flp-catalyzed+excision+of+the+antibiotic-resistance+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.</a> Gene. 158 (1), 9-14 (1995).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

微生物を正確に定量化する能力は微生物学の研究にとって最も重要であり、初期混合集団からユニークな株を列挙する能力は、細菌。しかし、これを実現する技術は、分子生物学の近代的な発展に伴って進歩していません。Sを含む多くの細菌の染色体を容易に改変する技術である。Typhimuriumは、ほぼ二十年14のために利用可能であったが、この能力は、ユニークなDNA配列を有する分子タグ付け株のためにほとんど利用されていない。細菌染色体に挿入されたユニークで最小限に抑えたDNAバーコードに基づいて容易に識別可能な株を作成する能力を利用することにより、これらの分子識別子を検出し、定量する最先端の技術と組み合わせる(すなわち、デジタルPCR)は、細菌の多様な集団内で個々の株を容易に定量するための絶妙な感度、特異性、精度、精度を提供するシステムを作成しました。
上記のように、CIとCOIを計算することは、細菌染色体に対して適切な改変を正確に行う能力に依存する。すべての変更は、ランダムな突然変異が発生していないことを確認するために、Sanger...

病原性生物の適合性とウイルス性を評価することは、微生物学研究の基本的な側面である。これは、株間または変異生物間の比較を可能にし、研究者が特定の条件下で特定の遺伝子の重要性を決定することを可能にします。伝統的に、ウイルス評価は、異なる細菌株を使用して感染の動物モデルを利用し、感染した動物の結果を観察する(例えば、感染性線量50、致死用量50、死亡時間、症状重症度、欠如症状など)。この手順は、ウイルスの貴重な説明を提供しますが、野生のタイプからの変化を検出するために結果にかなりの違いを引き起こす株が必要です。さらに、疾患の進行と症状の重症度は時間の経過とともに主観的に定量化することができるが、野生型に比べてウイルスの解釈はより質的である(すなわち、より多く、より少ない、または同様に悪性である)ので、結果は半定量的である。動物感染性アッセイを行う一般的な代替手段は、競合指数(CI)を生成する、混合感染1における野生型の対応する株の適合性またはウイルス性を直接比較する値を生成する。この技術は、野生型株に対するウイルス性を標準化し、減衰の程度を反映する定量化可能な値を決定することにより、感染の従来の動物モデルに対して多くの利点を有する。この技術はまた、取り消された競争指数(COI)2を決定することにより、細菌における遺伝子相互作用を分析するために適応することができる。変異した生物のグループのCOIを計算することで、研究者は2つの遺伝子が独立して病因に寄与しているのか、それとも同じウイルス経路に関与し、互いに依存しているのかを判断することができます。さらに、CIを計算するには、生物の病因に関する貴重な洞察を提供できる細菌の列挙が必要です。また、CIとCOIは、臨床疾患を引き起こさないが、まだフィットネスの違いを持っているアビリント株をアセスすることを可能にします。この技術は、株を同定するために従来の抗生物質耐性マーカーを使用することによって制限され、それによって入力株の数を一度に1つまたは2つだけに制限する。この制限により、大量の実験グループと反復が必要となり、人件費や材料費の増大に加えて、実験条件の変動や不正確な結果の機会も増加します。(ウイルス、フィットネス、遺伝子相互作用を研究するために混合感染症を使用することの利点とアプリケーションの徹底的なレビューについては、C.R.BeuzónとD.W.ホールデン1を参照してください)
フローサイトメトリー3、4、5を介して定量した蛍光標識細胞の使用など、この限界を克服する試みがなされている。この技術は、1)標識抗体をプノーティピックマーカーまたは2)内因性に産生した蛍光タンパク質を用いて細胞を定量する。標識抗体の使用は、1,000細胞/mLの検出の限界を有するため、3を分析するために多数の細胞を必要とする。蛍光タンパク質を発現する細胞は生理学を変化させ、高タンパク質発現に起因するフィットネス変化の影響を受けやすい6.いずれの方法も、フローサイトメトリーを用いて検出可能な蛍光マーカーの数によって制限される。分子定量の進歩は、マウスモデル7における1,000株以上の初期混合感染から120株の減衰を検出するマイクロアレイ技術の開発によって達成された。この技術は、変異株からのRNAのマイクロアレイ分析を利用し、結果にかなりのばらつきをもたらす。 それにもかかわらず、混合感染症の大きなプールは有用なツールであり、敏感な検出技術を利用することによって、細菌のウイルス性の違いを同定できることを確立しました。次世代シーケンシングの開発により、Tn-seqはトランスポゾン変異の有用性を拡大し、ランダムに変異した細菌を定量する強力な方法を可能にし、8、9、10、 11.トランスポゾンの必要性を排除し、代わりにDNAバーコードを使用してゲノムの変化とフィットネス12への影響をより簡単に特定および追跡する代替プロトコルが最近開発されました。この技術は大きな進歩ですが、ゲノムバーコードの挿入はまだランダムなプロセスです。これまでの実験のランダム性を克服するために、ユンらは細菌13の染色体上の正確な位置に挿入されたユニークなDNAバーコードを用いてサルモネラ菌株のCIを計算する方法を開発した。ユニークなバーコード株は、各一意のバーコードに固有のSYBRグリーンおよびプライマーを用いたqPCRベースの方法を用いて検出された。この技術は、プライマー効率の違いや感度の低さなど、qPCRによって課される制約によって制限され、qPCRの前に入れ子になったPCRの必要性が証明された。それにもかかわらず、このアプローチは、標的ゲノム修飾が複数の細菌株のプールを検出し、潜在的に定量化するために利用できることを実証した。
以下のプロトコルでは、高感度なデジタルPCR技術を用いて正確な定量を行い、混合無分病の大きなプールで細菌競合実験を行う新しい方法論を説明する。このプロトコルは、染色体の無害な領域に挿入されたユニークなDNAバーコードを用いた細菌株を遺伝的に標識することを含む。この改変により、従来のシリアル希釈、レプリカめっき、および表現力マーカーに依存するコロニー形成ユニット(すなわち抗生物質耐性)の代わりに、現代の分子技術を使用して迅速かつ正確に定量することができます。).この修飾により、単一のプールされた接種における多くの株の同時評価が可能であり、すべての株が全く同じ条件にさらされるため、実験的変動の可能性を実質的に減少させる。さらに、この技術はサルモネラ・エンテリカ・セロバー・タイフィムリウムで開発されましたが、遺伝的に可鍛性の高い生物や、正確な細菌数が必要なほぼすべての実験計画に非常に適応性が高く、新しい以前の方法によって課された制約なしで微生物学の実験室の正確さおよび効率を高めるための用具。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL微量遠心チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>22600028</td><td>任意のメーカーから調達</td></tr><tr><td>16 mL培養チューブ</td><td>MidSci</td><td>8599</td><td>任意のメーカーから調達</td></tr><tr><td>5-200 &mu;Lピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>30389241</td><td>製造品質に基づいて慎重に代替チップブランドを調達</td></tr>する <tr><td>5-50 &mu;L マルチチャンネルピペット</td><td>レイニン</td><td>17013804</td><td>代替マルチチャンネルピペットは注意して使用してください</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP160-500</td> メーカー<td>を問わず調達</td></tr><tr><td>ブラスト分析</td><td>NCBI</td><td>N/A</td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>C1000 タッチサーモサイクラー 96ディープウェル 反応モジュール付き</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1851197</td><td>ddPCR用品はバイオ・ラッドから調達する必要があります。代替品はまだありません。</td></tr><tr><td>化学的に有能なDH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td>任意のメーカーから調達するか、ご自身で準備</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP904-100</td><td>任意のメーカーから調達</td></tr><tr><td>Cytation5 マイクロプレートリーダー</td><td>BioTek</td><td>CYT5MF</td><td>任意のメーカーから調達し、DNAを正確に定量できる任意のシステムを使用</td></tr><tr><td>データ解析ソフトウェア (QuantaSoft および QuantaSoft Data Analysis Pro)</td><td>Bio Rad</td><td>N/A</td><td>バイオ・ラッドからddPCR用品を調達する必要があります。代替品はまだありません。</td></tr><tr><td>ddPCR 96ウェルプレート</td><td>バイオ・ラッド</td><td>12001925</td><td>ddPCR用品はバイオ・ラッドから調達する必要があります。</td></tr><tr><td>ddPCR Droplet Reader Oil</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>Bio Rad から ddPCR 用品を調達する必要があります。</td></tr><tr><td>プローブ用ddPCR Supermix (No dUTP)</td><td>Bio Rad</td><td>1863024</td><td>Bio RadからddPCR用品を調達する必要があります。</td></tr><tr><td>DG8 カートリッジ QX200/QX100 Droplet Generator</td><td>Bio Rad</td><td>1864008</td><td>Bio Rad から ddPCR 用品を調達する必要があります。</td></tr><tr><td>DG8 QX200/QX100液滴発生器用ガスケット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1863009</td><td>バイオ・ラッドからddPCR用品を調達する必要があります。</td></tr><tr><td>プローブ用液滴生成オイル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1863005</td><td>バイオ・ラッドからddPCR用品を調達する必要があります。代替品はまだありません。</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP906-5</td> メーカー<td>を問わず調達</td></tr><tr><td>ルリア・ベルタニ寒天</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1425-2</td><td>寒天、トリプトン、酵母消化物、NaClからメーカーごとに調達するか、自分で作る</td></tr><tr><td>ルリア・ベルタニブロス サー</td><td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1426-2</td><td>メーカーを問わず調達するか、トリプトン、酵母消化物、NaClから自分で作ることができます</td></tr><tr><td>PCRプレートヒートシール、ホイル、ピアス可能な</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>Bio RadからddPCR用品を調達する必要があります。</td></tr><tr><td>PCRチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>951010022</td><td>どのメーカーからでも調達</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>FB0875712</td><td>どのメーカーからでも調達</td></tr><tr><td>pPCRスクリプトカム SK+</td><td>Stratagene/Agilent</td><td>211192</td><td>販売終了</td></tr><tr><td>プライマー/プローブデザイン</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index</td></tr><tr><td>pSKAPおよびpSKAP_Barcodes</td><td>Addgene</td><td>プラスミド番号 122702-122726</td><td></td></tr><tr><td>www.addgene.org PX1 PCRプレートシーラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1814000</td><td>バイオ・ラッドからddPCR用品を調達する必要があります。</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generator</td><td>Bio Rad</td><td>1864002</td><td>Bio Rad から ddPCR 用品を調達する必要があります。</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Reader</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>Bio Rad から ddPCR 用品を調達する必要があります。</td></tr><tr><td>サルモネラチフス菌株 ATCC 14028s</td><td>ATCC</td><td>ATCC 14028s</td><td>www.atcc.org</td></tr><tr><td>Take3 マイクロボリュームプレート</td><td>BioTek</td><td>TAKE3</td><td>どのメーカーからでも調達でき、DNAを正確に定量できる任意のシステムを使用</td></tr><tr><td>Thermo Scientific FastDigest BamHI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERFD0054</td><td>どのメーカーからでも調達</td></tr><tr><td>Thermo Scientific FastDigest DpnI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERFD1704</td><td>任意のメーカーから調達</td></tr><tr><td>Thermo Scientific FastDigest HindIII</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERFD0504</td><td>任意のメーカーから調達</td></tr><tr><td>Thermo Scientific GeneJet ゲル抽出および DNA クリーンアップ マイクロキット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FERK0832</td><td>任意のメーカーから調達</td></tr><tr><td>Thermo Scientific GeneJet Miniprep キット</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>FERK0503</td><td>任意のメーカーから調達</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F534L</td><td>任意のメーカーから調達</td></tr><tr><td>Thermo Scientific T4 DNA リガーゼ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FEREL0011</td><td>任意のメーカーから調達</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Bio Rad</td><td>1861096</td><td>任意のメーカー</td></tr><tr><td>から調達UVP Visi-Blue トランスイルミネーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>UV95043301</td><td>またはDNAの可視化を可能にするその他のトランスイルミネーター</td></tr><tr><td>水、分子生物学グレード</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP28191</td><td>どのメーカーからでも調達できます</td></tr></tbody></table>

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルpcrベースの競争指数

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

競争力のある指標は、細菌の適合性および/またはウイルス性を評価するために使用される一般的な方法です。このアプローチの有用性は、野生型生物に多くの株の適合性を標準化するその容易さと能力によって例示される。しかし、この技術は、利用可能なプチピックマーカーと同時に評価できる株の数によって制限され、多数の反復実験の必要性を生み出す。多数の実験と並行して、フェノティピックマーカーに基づいて細菌を定量するための労力および材料コストは重要ではない。これらの負の側面を克服しつつ、細菌染色体に遺伝子マーカーをエンジニアリングした後、微生物を直接定量化する分子ベースのアプローチを開発しました。ユニークな、25塩基対DNAバーコードは、サルモネラ菌の野生型および変異株の染色体上の無害な遺伝子座に挿入された。インビトロ競技実験は、プールされた株からなるイノキュラを用いて行った。競争の後、各株の絶対数はデジタルPCRを使用して定量化され、各株の競合指数はそれらの値から計算された。我々のデータは、サルモネラ菌を定量化するこのアプローチは、非常に豊富な(高い適合性)微生物と希少な(低フィットネス)微生物の両方を検出するための非常に敏感で正確で正確であることを示しています。さらに、この技術は、改変が可能な染色体を持つほぼすべての生物や、微生物の絶対定量を必要とする様々な実験計画に容易に適応可能です。

この方法論を使用するには、ターゲットDNAを同定するために使用される各プローブの感度と特異性を検証するために適切な制御反応が実行される必要があります。この代表的な実験では、8つの固有のDNAバーコードを同定するための8つの対応するプローブで検証した。8つのプローブはすべて、NTCと陰性対照反応の両方で偽陽性の割合が低かった(表3)。各条件の感度を評価するために、一意のバーコードを含むgDNAを、残りの7つのバーコード配列のそれぞれを含むgDNAの一定の背景で連続的に希釈した。上記のアプローチでは、デジタルPCRは、ほぼ200万の類似DNA配列の背景にgDNAのコピーを2部も区別することができました(表3)。
各プローブとDNAバーコード配列の感度と特異性を決定することに加えて、検証研究で行われた希釈により、結果のデータからシミュレートされた競合指数を計算することができました。この実験に...

細菌の適合性を決定するためのこの分子ベースのアプローチは、デジタルPCRを介して定量化されたユニークなゲノムDNAバーコードを使用して微生物の正確かつ正確な検出を容易にします。プロトコルは、サルモネラ株の競争力指数の計算について説明します。しかし、この技術は、遺伝的に可鍛性の生物の絶対的な定量を必要とするプロトコルに容易に適応可能である。

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

この技術は、迅速かつ高スループットの分子ベースの技術を使用して、非常に類似性の高い株の混合集団からの微生物の正確かつ正確な定量を可能にする。最終的には、株間でのフィットネスの比較を可能にする。単一のプールで多くの菌株を同時に評価する能力は、すべての菌株が正確に同じ条件にさらされるため、ウェル・ツー・ウェルまたは生物から生物への変動を実質的に減少させます。この技術の適応性は、ほぼすべての遺伝的に可鍛性の生物と微生物の正確な定量を必要とするほぼすべての実験設計に使用することを可能にする。テキストプロトコルに記載されているように、細菌染色体に遺伝子マーカーのエンジニアリングを開始します。1つを除くすべてのバーコードを含むゲノムDNAのプールを作成します。このプールを希釈剤として使用し、単一残りのバーコードを含むゲノムDNAを有する希釈系列を行う。プローブベースの化学用に設計されたデジタル PCR スーパーミックスを使用するためのメーカーの推奨事項に従って、重複したデジタル PCR の反応を準備します。プールされたゲノムDNAをテンプレートDNAとして使用します。また、テキストプロトコルに記述されているように、20 Xプライマープローブマスターミックスを追加します。メーカーの推奨に従って、デジタル PCR の反復制御反応を準備します。各プローブミックスの制御反応は、テンプレートコントロールなし、負のコントロール、および正のコントロールで構成されている必要があります。バーコード化されたゲノム DNA サンプルごとにデジタル PCR 反応を作成するには、これらの手順を繰り返します。メーカーの指示に従って、液滴発生器を使用して各反応条件の液滴を生成します。新しく作成された液滴を適切な96ウェルプレートに移します。5~50マイクロリットルのマルチチャネリングピペットに200マイクロリットルピペットチップを使用してください。すべての液滴が生成され、転送された後、ホイルプレートシーラーでプレートを密封します。サイクリング条件を実行するには、製造元が推奨するサーマルサイクラーを使用してください。サーモサイクリングが実行されている間、サンプル名、実験タイプ、使用するスーパーミックスなどのプレート設定情報を使用してデータ解析ソフトウェアをプログラムします。また、ターゲット 1 名とターゲット 1 の種類、ターゲット 2 名とターゲット 2 の種類も含めます。サーモサイクリングが完了したら、完成した反応を液滴リーダーに移し、メーカーの指示に従って読み取りプロセスを開始します。すべての井戸が読み取られ、実行が完了したら、データ分析ソフトウェアを使用してQLPデータファイルを開きます。同じプライマープローブMastermixを使用するすべてのウェルを選択します。[液滴]タブで、正と負の両方の液滴を含む各ウェルで分析された液滴の数を調べます。10,000個未満のウェルを分析から除外します。[1D 振幅]タブに移動し、正と負の液滴の振幅を調べます。2つの異なる集団を含んでいることを確認してください。ソフトウェア内で、しきい値機能を使用して、使用されたプローブごとに正の液滴と負の液滴の間のカットオフを行います。適切な閾値がすべてのウェルに適用されると、ソフトウェアは各反応のDNAコピー数を計算します。データをスプレッドシートにエクスポートして、さらに分析を行うことができます。これらの値を使用して、サンプル内の各固有のゲノムバーコードの初期コピー数を計算します。陰性対照反応から偽陽性率の平均値を求め、実験反応で得られた値からこの値を減算します。各実験の設定時に実行された希釈値に基づいて、必要に応じて値を乗算します。今度は、競合指数を計算して生物の相対的な適合性を決定するか、バーコード化された株のデジタルPCRベースの定量化から競合指数を取り消した。すべての時間ポイントで、バーコード化された各ひずみに対してこのステップを実行します。AAバーコードを含むゲノムDNAを、他のすべてのバーコードゲノムDNAの背景で希釈した。チャネル 1 は AA バーコードの FAM プローブを表し、チャネル 2 は AO バーコードの HEX プローブを表します。各プローブの結果は、選択されたウェル内のすべての液滴の蛍光強度の周波数を表す個々の液滴蛍光振幅とヒストグラムの両方として提示される。各条件について、正および負の液滴は2つの異なる集団を形成する必要があります。正および負の液滴を定義するために、閾値機能を使用して母集団を分離する必要があります。しきい値は使用されたプローブによって異なりますが、同じプローブミックスを使用するすべてのウェルのしきい値は同じである必要があります。希釈されたAAの場合、正の液滴は負の液滴によって実質的に上回るので、ヒストグラムは単一の集団のみを描写しているように見える。しかし、左パネルの蛍光振幅を調べることで、2つの異なる集団が依然として見える。AAバーコード化ゲノムDNAを希釈すると、陽性の液滴が減少し、陽性AO液滴の数は一定のままである。適切な閾値がすべてのウェルに適用されると、ソフトウェアは各反応のDNAコピー数を計算します。研究の一環として PCR を日常的に実行する場合は、この手法を実行してモデル生物の適合性を評価できます。この手順は、通常、上流の実験の終了結果を決定するために使用されます。その真の有用性は細菌の定量に依存するあらゆる実験のための容易さおよび多様性を促進することである。私たちは、感染のマウスモデルにおけるサルモネラフィットネスを評価するために、この技術を使用しています。また、この技術は、当研究室の他の病原微生物との併用に適応されています。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

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