Name: コンカナバリンによる涙腺への注射によって誘発される水性欠損性ドライアイ病のウサギモデル:薬物有効性研究への応用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶコンカナバリンAによるウサギ涙腺への超音波誘導下注射による水性欠損性ドライアイ病モデル。急性・慢性両方の病態を再現し、薬物有効性評価や病態生理学研究に適した信頼性の高い非手術的手法です。

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すべての動物研究は、関連するすべての規制および制度上のガイドラインに従って完了しました。すべての研究は、ストーニーブルック大学の機関審査委員会によって承認され、眼科および視力研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行われました。
これらの研究は、ストーニーブルック大学医学部(グラント番号1149271-1-82502)からのターゲット研究機会助成金と、ニューヨーク州セタウケットのメディコン・ファーマシューティカルズ社からの研究助成金によって部分的に支持されました。著者はミケーレ・マクターナンの編集支援に感謝している。

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<li>Tan, L. L., Morgan, P., Cai, Z. Q., Straughan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+and+risk+factors+for+symptomatic+dry+eye+disease+in+Singapore%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Optometry%22%5BJournal%5D)">Prevalence of and risk factors for symptomatic dry eye disease in Singapore.</a> Clinical and Experimental Optometry. 98 (1), 45-53 (2015).</li>
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<li>Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Gray, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rabbit+model+for+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A new rabbit model for keratoconjunctivitis sicca.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (2), 225-228 (1987).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+lacrimal-lymphoid+mixed-cell+reactions+induce+dacryoadenitis+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Experimenal+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Autologous lacrimal-lymphoid mixed-cell reactions induce dacryoadenitis in rabbits.</a> Experimenal Eye Research. 71 (1), 23-31 (2000).</li>
<li>Burgalassi, S., Panichi, L., Chetoni, P., Saettone, M. F., Boldrini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple+dry+eye+model+in+the+albino+rabbit+and+evaluation+of+some+tear+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a simple dry eye model in the albino rabbit and evaluation of some tear substitutes.</a> Ophthalmic Research. 31 (3), 229-235 (1999).</li>
<li>Xiong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rabbit+dry+eye+model+induced+by+topical+medication+of+a+preservative+benzalkonium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (5), 1850-1856 (2008).</li>
<li>Heymann, F., Hamesch, K., Weiskirchen, R., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concanavalin+A+model+of+acute+hepatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">The concanavalin A model of acute hepatitis in mice.</a> Lab Animal. 49 (1 Suppl), 12-20 (2015).</li>
<li>Nagelhout, T. J., Gamache, D. A., Roberts, L., Brady, M. T., Yanni, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+tear+film+integrity+and+inhibition+of+corneal+injury+by+dexamethasone+in+a+rabbit+model+of+lacrimal+gland+inflammation-induced+dry+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Preservation of tear film integrity and inhibition of corneal injury by dexamethasone in a rabbit model of lacrimal gland inflammation-induced dry eye.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 21 (2), 139-148 (2005).</li>
<li>Honkanen, R. A., Huang, L., Xie, G., Rigas, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphosulindac+is+efficacious+in+an+improved+concanavalin+A-based+rabbit+model+of+chronic+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphosulindac is efficacious in an improved concanavalin A-based rabbit model of chronic dry eye disease.</a> Translational Research. 198, 58-72 (2018).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+phospho-non-steroidal+anti-inflammatory+drugs%2C+OXT-328%2C+MDC-22+and+MDC-917%2C+inhibit+adjuvant-induced+arthritis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The novel phospho-non-steroidal anti-inflammatory drugs, OXT-328, MDC-22 and MDC-917, inhibit adjuvant-induced arthritis in rats.</a> British Journal of Pharmacology. 162 (7), 1521-1533 (2011).</li>
<li>Mattheolabakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topically+applied+phospho-sulindac+hydrogel+is+efficacious+and+safe+in+the+treatment+of+experimental+arthritis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Topically applied phospho-sulindac hydrogel is efficacious and safe in the treatment of experimental arthritis in rats.</a> Pharmaceutical Research. 30 (6), 1471-1482 (2013).</li>
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</ol>

著者らは、メディコン・ファーマシューティカルズ社およびアピス・セラピューティクス(LLC)に株式を持つBRを除き、競合する利益を宣言していない。そして、株式会社アピス・セラピューティクスに株式を持つメディコン・ファーマシューティカルズ社の従業員であるLH。

ウサギはDEDの研究にとって非常に魅力的です。角膜と結膜は、マウスやラットと比較して、ヒトの表面領域に近い領域を有する。エステラーゼなどの薬物代謝酵素の補完、および涙腺の組織学はヒトの組織学に似ており、目は有益な薬物動態研究に十分な大きさである。豚やサルと比較して、彼らは同様の特徴を共有し、彼らはより少ない費用がかかり、彼らの実験的な操作が容易です。機械学的研究が考えられる場合、ウサギの相対的な欠点は、マウスと比較して、より少ない試薬(例えば、モノクローナル抗体)が利用可能であるということです。一方、ウサギは、個々の組織が容易に解剖され、分析作業に十分な大きさであり、「サンプルプーリング」を避けるため、薬物動態および生体分布研究のためのマウスよりもはるかに優れています。
重要な一般パラメータはウサギの順応期間です。動物は、多くの場合、適切な温度や湿度の輸送環境を確保しない条件下でベンダーから出荷されます。一部の動物は到着時に既にドライアイを開発している可能性があります。2週間の順応期間をお勧めします。同様に重要なのは、研究ウサギがビバリウムに収容されている空間の湿度と温度に細心の注意を払うことだ。どちらの状態の偏差は、彼らの目の状態に大きな変化を誘発することができます。バックアップ用の加湿器と除湿器を手元に持っています。セントラルシステムに障害が発生した場合は、バックアップ機器を使用して周囲の湿度を復元するために迅速に動作します。このような不幸な展開は、夏の間にはより一般的であることを覚えておいてください。しかし、ウサギのDEDを正常に誘導するための3つの最も重要なステップは、1)ILGを識別し、Con Aの注射を指示し、確認するために米国イメージングを巧みに使用する方法です。2)ILGとSLGの2つの部分の両方の注入を保証する。そして3)DEDのパラメータを確実かつ再現的にアッテで言う。
必要な実験スキルを開発することは些細なことではありませんが、深刻な研究者を抑止すべきではありません。学習曲線は 5 回の反復で完了することを期待してください。妥当な品質の米国のイメージングシステムが不可欠です。米国による解剖学的特徴の認識は重要であるため、研究者はウサギの解剖学を見直すべきである。古典、Davis25によるウサギの解剖学の優れた説明は、非常に役に立ちます。また、ILGのサイズの変動を念頭に置いてください。これに対する結果は、Con Aの成功は常にフォローアップイメージングで確認されなければならないということです。ウサギのグループにおけるCon Aへの応答の変動は、注射技術(注射に失敗または部分的に成功した)または涙の過剰産生で補うために残留涙腺組織の能力を無視することによることが最も多い。注射技術を習得したい人のために, 迅速な解剖解剖に続いてメチレンブルーを注入すると役立ちます;それは涙腺に達するか、隣接する組織にこぼれた場合、可視化が達成されます。現在までに、この注射法は、単一の合併症を伴わずに著者によって270回以上行われてきた。
上記のDEDの5つのパラメータを言うことは、臨床現場での決定と同じくらい難しいかもしれません。概日変動はいずれも正式に文書化されていないが、特に繰り返しアッセイを行い、互いに比較する場合に、同じ時刻(±1時間)にアッセイされるべきという、眼28におけるそのような現象の十分な背景証拠がある。これらのアッセイを行う上での一貫性は必須である。2人のチームが必要です。一部のステップでは厳密なタイミングが必要なため、同じ部屋の4人以上の調査官がアッセイに参加すると混乱を引き起こす可能性があります。適切で高品質な写真ドキュメントが示されている場合は、重要です。
このモデルは薬剤開発研究に理想的に適している。動物モデルとアッセイ技術の習得により、有効性および安全性試験の再現性19に優れた再現性を確保した。
これは、以前のモデルの交わし変動性を排除し、動物モデルを合理化し、本質的にDEDの5つのパラメータをアッテに標準化しているため、強力な実験的アプローチです。候補治療薬の研究にこのモデルの成功したアプリケーションは、新しい薬剤の絶望的な必要性とその病因のより深い理解の疾患のための有益な動物モデルとしての実用的な有用性を確認しています。

ドライアイ病(DED)は、有病率および罹患率が高い慢性疾患である1、2、3、4.炎症は、その病因5、6において重要な役割を果たす。DEDの病態生理学は、生産不足または涙の過剰蒸発のいずれかから導出されるとして概念化される。前者は水性欠乏性DED7としても知られています。シェーグレン症候群は、DEDの原型的原因を広く研究し、主に涙腺(LG)に影響を及ぼし、DEDの病因におけるその重要性の顕著な例である。DEDは、一時的な救済を提供する人工涙、または眼の炎症を抑制するシクロスポリンまたはリフィテグラストで治療されることが多い。DEDに利用可能な治療法のどれも最適ではなく、新しい薬剤8、9の開発を必要とする。
DEDの新しい治療薬の探索は、DEDの病態生理学的複雑さを考えるとわかりにくい薬物分子標的の欠如という3つの大きな課題によって妨げられている。有望な薬剤の格差;そして、DEDの主要な特徴を再現する動物モデルの欠如。
ほとんどの医薬品開発の取り組みと同様に、DEDの有益な動物モデルは、動物モデルが人間の病気を完全に再現していないという公理的な声明にもかかわらず、重要な調査ツールです。DEDのマウス、ラット、ウサギのモデルは最も一般的に使用され、犬や霊長類は10、11を使用しない。これまでに報告された12匹を超えるウサギDEDモデルのほとんどは、LGを除去するか、またはその機能12、13、14、15、16を妨害することによって、涙の産生を減らそうと試みる。そのようなアプローチには、ILGの外科的切除が含まれる。その排泄管の閉鎖;リンパ球、マイトジェン、ボツリヌス毒素、アトロピン、またはベンザルクロニウムの照射または注入によるLG機能の障害。これらの方法の主な制限は、それらの矛盾と涙の生産の頻繁な部分的な抑制です。
植物起源のレクチンであるコンカラバリンA(Con A)は、強力な刺激T細胞サブセットであり、肝炎17およびDED18の実験モデルで使用されている。元の Con A ベースのモデルは、相対的な単純性を含む重要な利点を提供すると報告されました。LGsにおける炎症性細胞の流入, シェーグレンのような疾患を模倣;炎症促進性サイトカインの刺激 IL-1β, IL-8, TGF-β1;涙液のクリアランスと涙液の破綻時間(TBUT)を測定することによってモニターされる涙機能の低下;抗炎症コルチコステロイドに対して示される薬物応答性。
この有望な方法を適用すると、その利点に加えて、その全体的な改訂と抜本的な改善を必要とする制限が特定されました。この方法の 3 つの重要な欠点が文書化されています。まず、モデルは急性モデルでした。約1週間後に誘導されたDEDが沈静化した。第二に、動物の応答は一貫性がなかった。実証されているように、下LG(ILG)への「盲目」経皮注射では、Con Aは標的腺に無作為にのみ送達された。ILGの解剖学の詳細な研究は、そのサイズがそのような注射を「ヒット・オア・ミス」の努力をする4倍の19まで変化する可能性があることを明らかにしました。最後に、ILGを注入しても、優れたLG(SLG)は頻繁に減少した涙流を補償し、モデルを問題にしました。
これらの重要な制限は、3つの改変を方法に導入することによって克服され、DEDの優れた動物モデルを生成した。まず、ILGへのコンAの注入は、超音波(米国)の指導の下で行われ、コンAが腺に入っていることを保証した。注射の成功は、図1に示すように、注射後のUS画像を得ることによって確認された。第2に、SLGの代償性涙液寄与を除去し、この腺のパルペブラル部分と眼窩部分の両方にコンAを注入した。最後に、DEDのこの急性モデルは、7-10日ごとにCon Aの繰り返し注射によって慢性モデルに変換された。2ヶ月の持続時間のDEDは、これらのウサギで容易に達成される。このアプローチの成功は十分に文書化されています19.
既に述べたように、DEDの動物モデルの重要な適用は、候補治療薬の有効性および安全性を決定することです。このモデルの有用性は、眼薬として投与される新規の抗炎症性低分子20,21であるホスホススリンダック(OXT-328)の研究によって実証された。その有効性は、DED19のパラメータのパネルに基づいて実証されました。このモデルの相対的なシンプルさと有益な性質はまた、ホスホススリンダックをDED、シクロスポリンおよびリフィテグラストの2つのFDA承認薬と並べて比較することができ、その強力な前臨床的優位性を実証した。

<table><tbody><tr><td>100 mm マクロレンズ</td><td>Canon EF 100mm f/2.8L IS USM</td><td>3554B002</td><td></td></tr><tr><td>26 ゲージ針 (5/8)</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ</td><td>305115</td><td>涙腺にConAを注入するための針</td></tr><tr><td>27ゲージの針 (5/8)</td><td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ</td><td>305921</td><td>涙腺にConAを注入するための針</td></tr><tr><td>Aceproinj (acepromazine)</td><td>ヘンリー・シャイン・アニマルヘルス、オハイオ州ダブリン</td><td>NDC11695-0079-8</td><td>0.1ml/kg ウサギの鎮静のための皮下注射</td></tr><tr><td>麻酔気化器</td><td>VetEquip、プレザントン、カリフォルニア州</td><td>アイテム #911103</td><td></td></tr><tr><td>ビショップ・ハーモン鉗子</td><td>バウシュ・ロム (ストルツ)、ブリッジウォーター、ニュージャージー</td>州 <td>E1500-C</td><td>組織鉗子</td></tr><tr><td>キャリパー</td>・<td>ボッシュ・ロム (ストルツ)、ブリッジウォーター、ニュージャージー州</td><td>E-2404</td><td>ConA注射中に針の長さを測定するために使用されるキャリパー</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma、セントルイス、ミズーリ</td><td>州 C2010</td><td>ウサギの涙腺への注射のためにPBSで5mg / mlを作る</td></tr><tr><td>DSLRカメラ</td><td>Canon EOS 7D DSLR</td><td>3814B004</td><td>デジタル一眼レフカメラ</td></tr><tr><td>フルオレセイン</td><td>アクロン、レイクフォレスト、イリノイ州</td><td>NDC17478-253</td><td>PBSで0.2%に希釈してTBUT</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>を測定するHenry Schein, Melville, NY</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Lactoferrin ELISA kit</td><td>MyBiosource, San Diego, CA</td><td>MBS032049</td><td>涙液ラクトフェリンレベルの測定</td></tr><tr><td>リドカイン</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>L5647</td><td>1% in PBS for anesthesia</td></tr><tr><td>agent macro/ring flash</td><td>Canon Macro Ring Lite MR-14EXII</td><td>9389B002AA</td><td></td></tr><tr><td>Osmolarity tips</td><td>TearLab Corp., San Diego, CA</td><td>#100003REV R</td><td>涙液浸透圧</td></tr><tr><td>PBS(リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>Mediatech, Inc. Manassas, VA</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit, New Zealand White or Dutch Belted (as described in text)</td><td>Charles River Labs, Waltham, MA</td><td>2-3 kg</td><td>Research animals</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO</td><td>NDC51801-004-40</td><td>1% in PBS, staine the eyeular surface</td></tr><tr><td>Schirmerストリップ</td><td>イーグルビジョン、カテナ製品。デンビル、ニュージャージー</td>州 <td>AX13613</td><td>涙液の生成を測定する</td></tr><tr><td>外科用ルーペ +1.50</td><td>ビジョン、ボヘミア、ニューヨーク</td>のデザイン <td>専門アイテム</td> 涙液の<td>分解を観察し、コンカナバリンA注射を行いながら、眼表面の壮大さを提供します。</td></tr><tr><td>TearLab Osmometer</td><td>TearLab Corp., San Diego, CA</td><td>Model #200000W REV A</td><td>涙液浸透圧の測定</td></tr><tr><td>超音波プローブ</td><td>VisualSonics Toronto, Ont</td><td>MX 550 S</td><td>Untrasonography-guide Con A 下涙腺への注射</td></tr></tbody></table>

コンカナバリンによる涙腺への注射によって誘発される水性欠損性ドライアイ病のウサギモデル:薬物有効性研究への応用

A Rabbit Model of Aqueous-Deficient Dry Eye Disease Induced by Concanavalin A Injection into the Lacrimal Glands: Application to Drug Efficacy Studies

ドライアイ病(DED)は、眼表面の多因子性炎症性疾患であり、世界中の人間の6人に1人に影響を及ぼし、生活の質と医療費に驚異的な影響を及ぼします。その主要な特徴を再現する有益な動物モデルの欠如は、DEDのための新しい治療薬の探索を妨げる。利用可能なDED動物モデルは限られた再現性および有効性を有する。ここでは、DEDがマイトゲンコンカナリンA(Con A)をウサギの眼窩涙腺に注入することによって誘導されるモデルを提示する。このモデルの革新的な側面は、劣った涙腺へのCon Aの最適かつ再現可能な注入を確実にするために超音波(米国)ガイダンスの使用である。涙の代償生産を制限するすべての眼窩涙腺へのCon Aの注入;そして、DEDの状態を不本に延長するコンAの定期的な繰り返し注射の使用。DEDおよび試験剤に対する応答は、涙液の生成、涙液膜の安定性、角膜および結膜粘膜の状態を評価するパラメータのパネルで監視される。彼らは涙の浸透モル濃度を含みます, 涙の解散時間, シルマーの涙のテスト, バラベンガル染色, 涙ラクトフェリンレベル.DEDの誘導とそのパラメータのモニタリングについて詳しく説明します。このモデルは、シンプルで堅牢で再現性があり、情報を提供します。この動物モデルは、DEDの涙液生理学および病態生理学の研究、ならびにDEDの治療のための候補薬剤の有効性および安全性の評価に適している。

Con A注射は、密なリンパ球浸潤を特徴とする涙腺で強い炎症反応を誘発した(図13)、涙液産生の減少を伴う。すべての破傷パラメータが著しく変更されました(表1および表2)。さらに、涙液ラクトフェリンレベルが抑制された(コントロール= 3.1±0.45対コンA注入= 2.7±0.02 ng/mgタンパク質(平均±SEM);p&lt;0.03)。最終的な結果は、角膜および結膜上皮を損ない、バラベンガル染色の増加によって証明された(図6)。
3つの軌道LG組織の注入は、以前の方法18、27によって達成された状態とは異なり、一貫した均一なDED状態を生じた。この結果の主な貢献者は、ILGの米国ガイド注入とOSLGの注入でした。表1は、この方法の顕著な結果をまとめたものである。すべての変更は、重大な DED と一致しています。
コン A 注射の単一のセットは、約 1 週間持続する DED を生成します。;すべての臨床パラメータは10日目(表2)によって正常化します。シーケンA注射は、約1週間離れてDEDの持続時間を延長します。たとえば、7 日目の 2 番目の Con A 注射では、2 週間の DED が維持されます。約5セットの注射後、DED状態は、多くの場合、さらなる注射を必要とせずに永久的になります。
コンA誘導DEDを有するウサギを新しい薬剤ホスホススリンダックで治療した際、この疾患を著しく抑制した。たとえば、 この薬剤TBUTによる1週間の治療に続いて、車両処理動物(43.6±4.0対12.2±2.8s;p&lt;0.001;平均±SEM、これらの値および以下の値)と比較して著しく増加し、涙の浸透度は正規化された(2944±4.6対311±2.0mM/L&amp;0;l2)。機械学的には、ホスホスリンダックは、IL-1β(8.4±1.2対21.2±6.6 pg/mgタンパク質;p&lt;0.03)およびIL-8(4.9±1.7対13.5±5.0 pg/mgタンパク質;p&lt;0.05)の2つの重要なインターロイキンのレベルを低下させる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig1a.jpg"> 図1:下涙腺の超音波画像。上部パネル:ILGは、円状のアーチの下に横たわるように軌道上でより深く移動します。破線は、米国のプローブがスイープされるスキン上の線を表します。ミドルパネル:ハンドピースがこの線を越えると、検査者は左の画像(矢印)に存在し、右側に消える頬骨エコーの損失を探します。下部パネル:コンAの注射前(左)と(右)注射後に撮影されたILGの画像は、腺内の大きな嚢胞腔の発達が適切な送達を確認する。許可を得て転載19.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig02.jpg"> 図2:ガスマスクの沈座。この写真は、イソフルランを用いて短い適度な沈食を提供するガスマスクを示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig3a.jpg"> 図3:nictating膜の除去。(A)リドカイン/エピネフリンの注射(B)ウェストコットはさみによる根元でのnictating膜の切り詰め。(C)眼表面は、刺激性膜を除去した後より容易に可視化した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig03.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig4a.jpg"> 図4:涙液の破断時間測定(A)フルオレセイン滴の塗布直後の青色光下の角膜表面の均一緑色涙液フィルム出現。(B)すでに顕著な分裂を受けている角膜表面は、フルオレセイン内の複数の暗い円と線筋によって証明される。最初の暗いスポットまたは線が発達するとすぐに、解散時間が記録されます。2つの水色の円は、角膜の光源の反射です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig5a.jpg"> 図5:シルマーの涙のテスト。(A)残存局所リドカイン溶液およびベースライン涙液を除去するために、下のフォルニックスにWeck-Celスポンジを適切に配置する。三角スポンジの後縁を下蓋のマージンの下に置くことによって、涙片の配置前に眼表面を乾燥させる非常に均一な技術を維持することができる。(B)A涙片は、グローブと下蓋(パルペブラル結膜)との間の下蓋の中間位置に適宜配置される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig06.jpg"> 図6:ローズベンガル染色アッパー:角膜表面の写真。左:コンAで治療する前にバラのベンガル染色は存在しない。右:拡散角膜および結膜染色は、注射後の上鼻象限(右上)に見られる。低い:上のバルバー結膜からの結膜印象細胞学。左:治療前に多数のゴブレット細胞が存在する。右:上皮細胞は存在するが、ゴブレット細胞は治療後に存在しない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig7a.jpg"> 図7:コンカナリン注射のためのウサギの調製。(A)小さなせん断を使って毛皮を除去し、ランドマークを容易に可視化して、眼窩上涙腺を識別できます。(B)ナイルは、せん断後に残っている毛を除去するために使用されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig07.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig8a.jpg"> 図8:椎間部涙腺の注射(A)前記パルペブラル涙腺は、上蓋の後側側頭部に球根状の高さとして現れる。2%のフルオレセインの滴を適用した後、この腺の表面から涙が流れているのが見られます。(B)ウサギが中程度の沈液を受けている間に、椎間体性涙腺が注入されている。ある調査員はまぶたを引き込み、腺の露出を最適化し、2人目の研究者が腺を注入する間にマスクを固定する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig08large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig09.jpg"> 図9:眼窩上涙腺の局在化皮膚輪郭の変化は、後部インシアルを突き抜けるOSLGの位置を示す。地球の内側の圧力を交互に(大きな矢印)すると、皮膚の小さな標高と見なされる上方眼球が脱出する。この標高は、圧力が加えられるたびにサイズが大きくなります (小さな矢印)。この腺の位置は、通常、後方軌道リムに沿った位置にあります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig09large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig10a.jpg"> 図10:眼窩上涙腺の注入(A) 図9のように脱がれた領域に細歯の鉗子を用いて頭蓋骨に優しい圧力を加える。頭蓋骨の薄いスリット状の開口部は触診することができます。鉗子が付く小さいくぼみマークを残すことは注射の間に針の配置を大いに助ける。(B)針は、インシデンを介して垂直に挿入されている。誤って配置された場合、その通路は骨の頭蓋骨によって停止されます。(C)針は、横方向カンサスに向かって角度を付けた最終位置にある。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig10.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig11a.jpg"> 図11:下涙腺の局在化(A)下蓋を通して見たILGの表面部分の顕著さ。曲線ペンマークは、腺の下の位置を示します。垂直線は、鼻辺縁部の下で、ILGが軌道内のより深い位置に遷移するおおよその位置を示し、米国の視覚的な参照として機能します。(B)垂直線の領域を横切る米国のハンドピース。米国のモニターは、ザイゴマティック骨がどこで終わるか、ILGが遷移する場所、およびCon A注射を与える必要がある場所(「注射部位」)を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig11large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig12.jpg"> 図12:下涙腺の注射ILGの注入は米国によって識別される場所で行われる。インジェクションの深さは、テキストに記述されているとおりに計算されます(ステップ5.8.6)。カリパー(針の後ろに見える)は、注射前に針が適切な深さに置かれていることを確認します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig12large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59631/59631fig13.jpg"> 図13:涙腺のヒストロジー。典型的なチューブーロ肺胞構造(A)およびCon A(B)の注射後の正常な下層涙腺の組織切片は、構造の浸透で顕著なリンパ球浸潤を示す。同様の炎症性浸潤は、上の涙腺に見られる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59631/59631fig13large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="3">射出方法</td>
			<td colspan="2">TBUT、秒</td>
			<td colspan="2">ティアオスモラリティ、オスム/L</td>
			<td colspan="2">STT, mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>ベースライン</td>
			<td>ポストインジェクション</td>
			<td>ベースライン</td>
			<td>ポストインジェクション</td>
			<td>ベースライン</td>
			<td>ポストインジェクション</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="6">平均値 ± SEM、 % 変化</td>
		</tr>
<tr>
<td>米国のガイダンスなしの ILG</td>
			<td rowspan="3">58.5 ± 1.5</td>
			<td>44.5 ± 7.7</td>
			<td rowspan="3">297 ± 4.9</td>
			<td>300± 3.8</td>
			<td rowspan="3">15.2 ± 0.9</td>
			<td>12.9 ± 2.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>%変更</td>
			<td>-23%</td>
			<td>1%</td>
			<td>-15%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p=0.05</td>
			<td>p=0.36</td>
			<td>p=0.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>米国ガイド付き ILG + PSLG</td>
			<td rowspan="3">59.4 ± 0.6</td>
			<td>11.4 ± 4.2</td>
			<td rowspan="3">296 ± 4.7</td>
			<td>326 ± 3.7</td>
			<td rowspan="3">15.1 ± 1.3</td>
			<td>10.7 ± 1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 変化率</td>
			<td>-81%</td>
			<td>10%</td>
			<td>-29%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p&lt;0.0001</td>
			<td>p&lt;0.0001</td>
			<td>p&lt;0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>米国ガイド付き ILG + PSLG + OSLG</td>
			<td rowspan="3">60 ± 0.0</td>
			<td>6.2 ± 1.3</td>
			<td rowspan="3">299 ± 2.9</td>
			<td>309 ± 2.8</td>
			<td rowspan="3">14.6 ± 0.9</td>
			<td>9.9 ± 1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 変化率</td>
			<td>-90%</td>
			<td>3%</td>
			<td>-32%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p&lt;0.0001</td>
			<td>p&lt;0.008</td>
			<td>p&lt;0.002</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="7">すべての値は、記載されている腺にCon Aを1回注射した後、6日目に測定した。すべての比較はベースラインに対して行われました。*ILG、下垂体涙腺;PSLG、上の涙腺のパルペブラル部分;OSLG、上の涙腺の軌道部分;米国、超音波。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:ドライアイ重症度に対する注射技術および注射部位の数の影響。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">ベースライン</td>
			<td>6日目</td>
			<td>13日目</td>
			<td>21日目</td>
		</tr>
<tr>
<td>1インジェクション</td>
			<td>2回の注射</td>
			<td>3回の注射</td>
		</tr>
<tr>
<td>TBUT、秒</td>
			<td rowspan="3">58.5 ± 1.5</td>
			<td>44.5 ± 7.7</td>
			<td>29.2 ± 7.8</td>
			<td>12.8 ± 3.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 変化率</td>
			<td>-24%</td>
			<td>-50%</td>
			<td>-78%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p=0.17</td>
			<td>p=0.001</td>
			<td>p&lt;0.0001</td>
		</tr>
<tr>
<td>オスム、オスム/L</td>
			<td rowspan="3">297 ± 4.9</td>
			<td>300±3.9</td>
			<td>308 ± 4.9</td>
			<td>313 ± 2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 変化率</td>
			<td>1%</td>
			<td>4%</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p=0.36</td>
			<td>p=0.04</td>
			<td>p=0.003</td>
		</tr>
<tr>
<td>STT, mm</td>
			<td rowspan="3">15.2 ± 0.9</td>
			<td>9.3 ± 1.6</td>
			<td>12.9 ± 1.6</td>
			<td>7.4 ± 1.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 変化率</td>
			<td>-39%</td>
			<td>-15%</td>
			<td>-51%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>p=0.17</td>
			<td>p=0.13</td>
			<td>p=0.008</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">ベースラインとの比較が行われました。</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:DEDの持続時間に対するILGへの繰り返しのCon A注射の効果。

この記事では、眼窩涙腺系のすべての部分にコンカナリンAを注入することによって、ウサギの急性または慢性ドライアイ病を誘発する方法の開発について説明します。この方法は、既に報告されているものよりも優れ、薬理剤の研究に適したドライアイの再現性、安定モデルを生成する。

Dry eye disease (DED), a multifactorial inflammatory disease of the ocular surface, affects 1 in 6 humans worldwide with staggering implications for ...

我々の方法は、すべての涙腺を注入し、注射を繰り返す我々の方法のおかげで急性または慢性することができるドライアイ病の不足している信頼性の高い動物モデルを提供します。この技術は、広く可変サイズの腺に超音波ガイダンスを使用して、この方法を完全なアプローチにする優れた涙腺まで、劣った涙腺にコンカナリンAを確実に提供する。このモデルは、水欠乏性のドライアイ病を誘発する、シンプルで最適化された非外科的手段を提供する。薬効や病態生理学の研究に適しています。後部の不安を特定し、超音波の局在化を利用することは、最初は困難な場合があります。すべての毛皮を取り除くことは、これらのステップの両方のための超音波の局在化を助けるために重要である。この手順を実演するのが、私の研究室の大学院生であるウェイ・ホアンです。耳葉が完全に直立しなくなったリラックスした頭部位置を観察することによって軽度の鎮静を確認した後、マイクロピペットを使用して25マイクロリットルの防腐剤を含まないリドカインを最初の目に塗布し、まぶたの間に柔軟なワイヤー蓋鏡を配置する。0.3鉗子を使用して、その頂点でニクタンス膜をつかみ、角膜の上にそれを伸ばします。26ゲージの鋭い針を使用して、リドカイン1%を1:100,000番目のエピネフリンの結合膜の基部に注入する。適度なブレは膜の上に形成されるべきである。その後、鏡を取り除き、左nictating膜に同じ注射を行います。約5分後、蓋鏡を仲間の目に戻し、0.3鉗子を使ってその頂点のニッキング膜を引き込みます。ウエストコットはさみを使用して、そのベースでニクタンス膜を切断し、鏡を取り除きます。その後、目に局所抗生物質軟膏を置きます。上皮腺注射のパルペブラル部分の場合、沈殿を確認した後、前眼窩および頭皮領域の毛皮を剪断し、脱毛クリームを使用して残留毛皮を完全に除去する。2分後にクリームを取り出し、適切な目に1%防腐剤を含まないリドカインの25マイクロリットルを塗布します。上まぶたをエグレットし、腺の手のひらの部分を示す突起が見えるまで後眼窩縁に穏やかな内側圧力を加える。細かい歯の鉗子と27ゲージ針を装備した結核シリンを使用して、 針を2ミリメートル進める経結膜アプローチで直接組織に侵入し、注射直後にコンカナバリンAまたはCon A.の500マイクログラム溶液の100マイクロリットルを注入し、地球に内側圧力を加えて軌道上の涙腺を後部から突き出させる。閉じた湾曲した鉗子を使用して、頭蓋骨の骨の開口部が感じられるまで領域をインデントし、鉗子でさらに控えめな圧力を加えて、針の配置のランドマークとして皮膚にくぼみを残します。約4分の1インチのインデントマークの上に皮膚に垂直な27ゲージ針を装備した結核注射器を挿入し、注射部位と骨軌道リムの中間点を目指す横カンサスに向かって後部および外部に針をリダイレクトする。針のハブに達したら、ゆっくりとILG注射のためのCon A.の1,000マイクログラム溶液の0.2ミリリットルを注入し、眼窩の下前部に沿ってILGの目立つ位置を見つけるために側面から動物を見る。外科用マーキングペンを使用して、ILG腺の表面的な部分がザイゴマ骨の表面的な休息場所から軌道上のより内側の位置に移行する皮膚に垂直線を引きます。垂直に保持された超音波プローブを皮膚のラインを横切って掃引し、ザイゴマ骨の端を特定する。ILG 遷移は、周囲の高響部の線から認識可能な内側の境界線のない線に腺のイメージが変化する場合に発生します。この変化が観察されたときに皮膚に描かれた線に対するハンドピースの相対位置は、注入部位となる。コンAをザイゴマチックアーチの骨の内側のポイントに腺に配置するには、必要な注入深さを、ザイゴマ骨超響信号の深さに加えて、針の既知の長さを1ミリメートル引いたものとして設定します。注射部位の腺に約12ミリメートルの針を挿入してから、身体外の露出針の長さが計算された差と等しくなるまでゆっくりと引き出します。その後、Con A溶液の1,000マイクログラムの0.2ミリリットルを注入し、超音波による注射の成功を確認する。ILGは、特徴的な超響性空間を示すべきである。A注射は涙液産生の減少を伴う密なリンパ性浸潤によって特徴付けられる涙腺の強い炎症反応を誘発する。涙ラクトフェリンレベルは抑制され、角膜および結膜上皮が損なわれ、ローズベンガル染色が増加する。3つの軌道LG組織の注入は、一貫した均一なドライアイ病状態を生成する。Con A注射の単一のセットは、10日目までにすべての臨床パラメータを正規化して約1週間続くドライアイ病を産生する。約1週間離れた連続的なCon A注射は、それに応じてドライアイ病の持続時間を延長する。約5セットの注射の後、ドライアイ病の状態は、多くの場合、さらなる注射を必要とせずに永久的になる。涙腺構造を最適に局所化することが最も重要である。頭蓋の解剖学と超音波を使用してスキルと一緒に毛皮の除去を含む細部への注意に精通して、すべての結果を向上させます。この簡単な技術はシャープの使用を必要とするので、調査は針刺しの怪我を防ぐために適切な予防措置を取る必要があります。

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