Name: インビタルイメージングと固定組織解析を用いた癌細胞播種に伴う転移戸管媒介血管透過性の腫瘍微小環境の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶ 転移腫瘍微小環境（TMEM）における血管透過性の評価法。インビタルイメージングと固定組織解析を用いて、高分子デキストランを使ったがん細胞播種に伴う血管透過性の動的変化を測定する手法を解説します。

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アルバート・アインシュタイン医科大学の分析イメージング施設(AIF)に対し、イメージング支援を行ってくださったことに感謝します。この研究は、NCI(P30CA013330、CA150344、CA100324、CA216248)、SIG 1S10OD019961-01、グラスリッパーバイオフォトニクスセンターとその統合イメージングプログラム、モンテフィオレのルース・グラント・グラント・グラント・グラントの助成金によって支えられた。腫瘍微小環境の研究のため(CA200561)。

GSKは原稿を共同執筆し、図1Cおよび3Bのイメージングを行い、固定組織分析プロトコルを開発し、すべてのデータを分析および解釈した。JMPは原稿を共同執筆し、図1B、2C及び3Aの手術及びインビタルイメージングを行った。LB & ACは、図 2B の手術とバイタルイメージングを行いました。RJは図2Aの手術およびインビタルイメージングを行った。JSCは原稿を共同執筆し、すべてのデータを分析・解釈した。MHOは原稿を共同執筆し、すべてのデータを分析し、解釈しました。DEは図2Dの手術とインビタルイメージングを行い、原稿を共同執筆し、固定組織解析とインビタルイメージングプロトコルを開発し、すべてのデータを分析および解釈した。

著者らは利益相反を明らかにしていない。

ここでは、TMEM出入り口に存在し、血管タイトおよび接着接合部の破壊に関連する特定のタイプの血管透過性を可視化および定量化するために適用できる2つのプロトコルを概説する。このタイプの血管透過性は、上述の5として、三者TMEM細胞複合体によって一過性および制御される。TMEM関連血管透過性を同定し定量する能力は、転移性癌細胞微小環境の評価、ならびに腫瘍に対する従来の細胞傷害療法の効果を調べる前臨床研究にとって重要である。微小環境だけでなく、標的および非標的療法の抗転移の可能性。重要なことに、我々は、この評価が固定組織におけるインビタルイメージングまたは免疫蛍光のいずれかによって行うことができることをここで実証した。どちらの方法にも長所と短所があります。イントラビタルイメージングは、血管透過性の動的プロセスを直接可視化することができますが、専門的な機器とトレーニングが必要です。一方、固定組織で行われる免疫蛍光は静的な画像のみを提供しますが、ほとんどの実験室で日常的に行うことができます。
癌患者は一般的に何らかの形の全身療法で治療され、全身...

がん転移に関する我々の理解の最近の進歩は、上皮間葉転移(EMT)と移動性/侵襲性癌細胞の細胞下集団の誘導は、それ自体では、発散性の普及に十分ではないことを明らかにした。1.確かに、腫瘍新生物は、癌関連内皮の全体を通して転移する癌細胞は、しばしば低膜球カバレッジによって特徴付けられ、そのように、非常に透過性が高いと考えられていた。不安定な2,3,4.腫瘍内の欠陥機能を非常に示唆しているが、発癌中の血管修飾は、腫瘍細胞が容易かつ制御不能な方法で血管に浸透できるという証拠をそれ以上に提供しない。腫瘍細胞が蛍光タグ付きで、血管系が蛍光プローブ(デキストランや量子ドットなど)の静脈注射によって標識されるインビタルイメージング(IVI)研究からの洞察は、腫瘍血管が均一である一方で、そのことを示している。低分子量デクトランス(例えば70kD)、高分子量デキストランス(155kD)および腫瘍細胞に透過可能であり、血管分岐点5に優先的に位置するイントラバセーションの特殊部位でのみ内皮を横切ることができる。6,7.動物モデルとヒト患者由来材料を用いた免疫組織化学(IHC)分析は、これらの部位が血管透過性を調節することに特化した「出入り口」であることを示している。移動/浸潤性癌細胞が循環に入る機会。これらの出入り口は「転移の腫瘍微小環境」または「TMEM」と呼ばれ、その密度は乳癌患者8,9の転移性疾患を発症するリスクの増加と相関する。 10.
各TMEM出入口は、3つの異なるタイプの細胞で構成されています:血管間マクロファージ、アクチン調節タンパク質哺乳動物を過剰発現する腫瘍細胞(Mena)、および内皮細胞は、すべて互いに直接物理的に接触し、1、 5,9,10,11,12,13.TMEMをイントラバゼーションの出入り口として機能させる重要な事象は、血管内皮成長因子(VEGF)が血管皮下マクロファージ14によって基礎血管に局所的に放出される。VEGFは、内皮細胞間の同質接合部を破壊することができる15,16,17,18,19,一過性血管漏出をもたらす現象, また、IVI研究5で説明されているように「破裂」透過性として知られています。TMEMマクロファージは、VEGF媒介TMEM機能およびこれらのマクロファージの発現に必要なチロシンキナーゼ受容体TIE2を発現することが示されている5,20,21,22.癌細胞の播種および転移を調節することに加えて、TIE2+マクロファージは腫瘍血管新生の中心調節因子であることが示されている21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31.したがって、TIE2+マクロファージは、腫瘍微小環境および転移カスケードの主な調節管の重要な構成要素を表す。
TMEM媒介血管透過性(すなわち「破裂」)をより概念化するためには、内皮細胞接合部の溶解に関連しない他の血管透過性のモードと区別することが非常に重要である。無傷の内皮(接合部と接合部が破壊されないもの)では、(a)ピノサイトシスは、摂取された物質の経血症と結合してもよいし、そうでないかもしれない、という3つの主要なタイプがある。(b) 内皮フェネストレーを介した材料の輸送;(c)内皮タイトジャンクション15,16,17,18,19,32によって調節される前細胞経路を介した物質の輸送,33歳,34.多くの腫瘍で調節が緩やかであるが、前述の血管透過性の様式は、主に正常組織生理学および恒常性の文脈において説明されてきたが、その極端なは、透過性が制限された組織である(例えば、血液脳関門、血液精巣関門、または豊富な透過性(例えば、腎臓糸球体装置の毛細血管をフェネストした)34、35、36、37。
多光子インビタルイメージングと多重免疫蛍光顕微鏡を用いて、TMEM媒介血管透過性(「破裂」)と乳房腫瘍における血管透過性の他のモードを区別することができる。これを達成するために、我々は、マウスで高分子量、蛍光標識プローブの単一の静脈注射を行う。自発的な破裂イベントは、生きたマウスのインビタルイメージングを使用して捕捉することができます。あるいは、プローブの散用は、免疫蛍光顕微鏡を用いて血液血管系(例えばCD31+またはエンドムチン+)およびTMEM出入口との共局在研究によって定量化することができる。ここで説明するプロトコルは、これらの手法の両方について説明しています。

<table><tbody><tr><td>抗ウサギIgG(Alexa 488)</td><td>ライフテクノロジーズコーポレーション</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>抗ラットIgG(Alexa 647)</td><td>ライフテクノロジーズコーポレーション</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミンフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸塩</td><td>エンジニアリングサイエンティフィックインク</td><td>9770</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラススリップ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72296-08</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>ヘンケル接着剤</td><td>1647358</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1490</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン-テトラメチル-ローダミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Endomucin (一次抗体)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td></td></tr><tr><td>エンロフロキサシン</td><td>バイエル</td><td>84753076 V-06/2015</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>魚皮 ゼラチン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>イソフルオラン</td><td>ヘンリー シャイン</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>CB40234</td><td>人工細胞外マトリックス</td></tr><tr><td>針(30 g)</td><td>ベクトン、ディキンソン</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>、リン酸緩衝生理食塩水、</td><td>ライフサイエンステクノロジーズコーポレーション</td><td>、PBS</td><td></td></tr><tr><td>、ポリエチレンチューブ、</td><td>サイエンティフィックコモディティーズインク</td><td>、BB31695-PE / 1</td><td></td></tr><tr><td>、パルスオキシメータ、</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>マウスオックス</td><td></td></tr><tr><td>、プラルーベ、獣医軟膏、</td><td>デクラNDC</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Quantum Dots</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>Q21561MP</td><td></td></tr><tr><td>Rubber</td><td>McMaster Carr</td><td>1310N14</td><td></td></tr><tr><td>TMR (一次抗体)</td><td>Invitrogen</td><td>A6397</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biologicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>184835</td><td></td></tr></tbody></table>

インビタルイメージングと固定組織解析を用いた癌細胞播種に伴う転移戸管媒介血管透過性の腫瘍微小環境の評価

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

癌関連死亡率の最も一般的な原因は転移であり、原発性腫瘍から二次部位への癌細胞の普及を必要とするプロセスである。近年、原発性乳癌および肺の転移部位における癌細胞の播種は、転移の腫瘍微小環境(TMEM)と呼ばれる出入り口でのみ起こることを確立した。TMEM出入口数は、乳癌患者における転移性疾患の遠隔再発について予後である。TMEM出入口は、これらの細胞の両方が血液に密着しているTIE2およびVEGFの高レベルを発現する前血管異性マクロファージと直接接触してアクチン調節タンパク質メナを過剰発現する癌細胞で構成されています。血管内皮細胞。癌細胞は、TMEM関連マクロファージおよびTMEM関連メナ発現癌細胞の関節活性によって調整された一過性血管透過性のためにTMEM出入口を通ってイントラバサテることができる。本原稿では、TMEM媒介過渡血管透過性の評価のための2つの方法について、インビタルイメージングと固定組織免疫蛍光について述べた。どちらの方法にも長所と短所がありますが、この2つを組み合わせることで、TMEM媒介血管透過性の最も完全な分析と、TMEM機能の微小環境前提条件が提供される可能性があります。乳癌における転移過程、およびおそらく他のタイプの癌は、TMEM出入口を介した癌細胞の普及を伴うので、TMEM出入り口活動の分析のために十分に確立された方法を採用することが不可欠である。ここで説明する2つの方法は、がん細胞を予防する薬剤の前臨床試験において最も重要である、ナイーブまたは薬理学的に処置された動物におけるTMEM出入り口活動の分析に対する包括的なアプローチを提供する。TMEMを通じて普及しています。

このプロトコルの記事で説明する実験手順を簡単に要約し、図 1A-Cに示します。
TMEM媒介血管透過性(「破裂活性」)を測定し、血管透過性の他のモードからの実験ノイズを低減するために(すなわち、細胞間および細胞間細胞を横断的に、導入で説明したように)、静脈内(すなわち)を行った。155 kDa Dextranのような高分子量プローブの注入は、テトラメチルロダミンに結合した。低分子量デクトランスは、血管透過性の3つのモードを区別しなかった。我々の以前の経験は、155 kDa TMR-Dextranの全身循環が、乳腺および肺のような正常組織の両方の血管系を効率的に標識したことを示している(図2A,B)。肺の原発性乳癌および乳癌転移(図2C,D)。また、事前研究によって確認<...

マウスにおける高分子量(155kDa)デキストランの静脈注射を用いて、転移(TMEM)戸口機能および癌細胞イントラバシスの腫瘍微小環境に関連する一過性血管透過性を評価する2つの方法について述べた。この方法には、生きた動物におけるインビタルイメージングと免疫蛍光を用いた固定組織分析が含まれる。

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

これらの相補的な技術は、高分子量デキストランを用いて腫瘍血管系の透過性を評価および測定する。固定組織プロトコルはより大きい腫瘍の適用範囲を提供し、高い効率、そして多光子のイメージ投射装置を要求しない。一方、生体内イメージングプロトコルは、転移またはTMEMの腫瘍微小環境における細胞の動態、機能、および動的相互作用に関するリアルタイム情報を提供する。そこで、ここで提示されるプロトコルは、がん細胞の普及と強く相関するTMEM依存性血管透過性の直接測定を可能にし、したがってこれらのプロトコルは腫瘍の転移電位を評価するために使用することができる。移植に適した腫瘍組織の断片を生成するには、テキストプロトコルに記載されているように腫瘍を持つマウスの安楽死から始める。DMEM/F12細胞培養培地を入れたペトリ皿をフュームフードの氷の上に置きます。マウスをヒュームフードに持ち込み、70%エチルアルコールでマウスの腹部を消毒します。滅菌手袋と外科用ツールを使用して、腫瘍を取り除き、ペトリ皿に入れます。ペトリ皿の中にいる間、壊死部分を捨てて、腫瘍を小さく切り取ります。腫瘍片をレシピエント宿主に移植するために、テキストプロトコルに記載されているように、遺伝子操作された、蛍光標識されたマクロファージで育てられたマウスを麻酔する。麻酔を約3%イソフルオランに減らし、マウスの目に眼科軟膏を塗布して乾燥を防ぎます。マウスの4番目の乳腺の上から髪を取り除きます。防腐剤で肌を洗浄した後、滅菌器具を使用して、4番目の乳首よりわずか2〜3ミリメートルの小さな切開を行います。乳腺脂肪パッドが露出するまで解剖します。ペトリ皿から腫瘍片を取り、人工細胞外マトリックスでコーティングします。第4乳腺脂肪パッドの下に移植腫瘍.シアノアクリル酸接着剤を使用して切開を閉じます。最後に、動物の飲料水にエンロフロキサシン抗生物質を1ミリリットル加えます。マウスを麻酔し、テキストプロトコルに記載されているように尾静脈カテーテルを挿入します。性器よりも直ちに優れた長手方向の正中線切開を行い、4番目の乳腺の優れた側面のレベルまで切開を運びます。切開横断を第4乳腺の優れた側面に持ち歩く。この時点で血液供給を損なうことを避けることは重要です。2×2センチメートルの硬質ゴムをフラップの皮膚側に貼り付け、皮膚フラップを安定させます。腫瘍は、ゴムによって安定化される領域の中心にあるべきです。カスタムメイドのイメージングウィンドウフレームの外縁にシアノアクリルの小さなフィルムを適用します。今度はカバーガラスの中央にPBSの小さな液滴を適用します。シアノアクリル酸の早期重合を避けるために、窓枠のシアノクリレートとガラス上のPBSとの間の接触を避けてください。周囲のフラップ組織を実験室で拭いて乾かします。小さな画像化窓を透明開口の中心に腫瘍を有する組織フラップに貼付する。麻酔をしたマウスと尾静脈カテーテルを顕微鏡ステージに移します。尾静脈カテーテルが脱落しないように細心の注意を払ってください。この時点で、テキストプロトコルおよび以前のJoVE出版物に記載されているように、長期的なインビタルイメージングを行います。より高いスループット分析およびより大きな腫瘍被覆のために、固定組織の免疫蛍光を使用して、TMEM媒介血管透過性を評価する。免疫蛍光染色を行うために、まずテキストプロトコルに記載されているようにサンプルを調製し、次に沸点に近いクエン酸に沈んだ部分を20分間加熱して抗原検索を行う。試料を室温まで15~20分間冷ました後、各洗浄を2分間PBSで3回洗浄します。ブロックは、ブロッキングバッファーで60〜90分間、エンドゥシンとテトラメチルロダミンをそれぞれ標的とする一次ラットと迅速な抗体の混合物でサンプルをインキュベートします。インキュベーションに続き、サンプルをPBSTでそれぞれ2分間3回洗浄します。ラットIgGと急速IgGに対する二次ロバ抗体の混合物でサンプルをインキュベートし、次いでサンプルをPBSTでそれぞれ2分間洗浄します。グリセロールフリーのハードマウント媒体を用いて、定期的なDAPI染色を行い、スライドを取り付けます。スキャンするまで暗い場所にサンプルを保管してください。最適な結果を得るには、デジタル全体スライド スキャナでスライドをスキャンします。画像解析を行うために、デジタル病理学に適したソフトウェアを使用して、ケースごとに10の高出力フィールドをキャプチャします。エンドゥシンとTMRチャンネルをTIFFとして別々に保存します。ImageJ を使用して TIFF ファイルをアップロードし、8 ビット イメージに変換します。8ビット画像を負のコントロールのレベルまでしきい値し、エンオブシンとTMRマスクを示す2つの二項化画像を生成する。バイナリツールから、エンドゥシンマスクの穴を埋めるを選択します。しきい値 Dextran イメージを生成し、Dextran ROI として保存します。また、閾値エンドロチン画像を生成し、血管ROIとして保存し、逆エンドゥシン画像を生成し、血管外ROIとして保存します。次に、交差する血管外ROIとデキストランROI画像を生成し、血管外デキストランROIとして保存します。最後に、画像全体を腫瘍ROIとして保存します。腫瘍ROI領域で血管外デキストランROI領域を分割し、100を掛けて、腫瘍全体で血管外デキストランがカバーするパーセント領域を生成する。1ケースあたり10〜20の高出力フィールドに対してこのプロセスを繰り返し、各ケースに平均血管外デキストランを生成します。ここに示されているのは、トランスジェニック動物内で健康で発達している乳腺の画像です。血管系はTMRデキストランによって赤で標識され、乳腺管内皮は緑色で蛍光タンパク質dendra2によって標識され、マクロファージはシアン蛍光タンパク質によって標識される。対照的に、移植されたdendra2標識された侵襲性性腺癌は、標識されたマクロファージおよび血管を有する動物に示されている。健康な肺組織は、標識された血管系を有するマウス内の肺イメージングウィンドウを介して視覚化された。肺癌転移は、標識されたマクロファージおよび血管系を有するトランスジェニック動物への腫瘍細胞の注入後に明らかである。ここに示されているのは、移植されたdendra2標識された乳房の侵襲性癌内の高分子量デキストラン標識ネオ血管形成血管の経時過ぎのインビタルイメージング映画からの静止画である。黄色の点線は、漏れイベントの前後、中、および後の一過性血管漏れ領域の輪郭を示します。TMEMの出入り口はライブのイメージ投射で捕獲される。多チャネル免疫蛍光は、エンドーミン、高分子量デキストラン、DAPIと共にそれらのマージされた画像、ならびに対応する閾値血管および血管外デキストランマスクを示す。TMEM免疫検査の対応する逐次部も示されている。TMEMから離れた血管プロファイルは非漏出血管プロファイルとして現れるのに対し、TMEM関連血管プロファイルは漏出血管プロファイルとして現れる。腫瘍の外科的暴露の間に腫瘍を供給する血管を切断することを避けることは非常に重要である。ここで説明する方法論は、薬剤治療と組み合わせることができ、TMEM機能を阻害することと同じ、血管透過性を予防すること、あるいは腫瘍血管系を正常化してそれらの影響および有効性を測定する。このプロトコルを用いて、化学療法は血管透過性および癌細胞の普及を促進し、実際にこれらの転移前の変化はTMEM機能の阻害剤の共投与によって回避できることを実証した。

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JoVE Journal

Cancer Research

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トランスレーショナルがん研究における生体内顕微鏡検査と磁気共鳴画像法の併用のための背側Skinfold Window Chamber腫瘍マウスモデル

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