調節RNA結合タンパク質の結合部位を同定するための配列空間の探索

このプロトコルは、タンパク質結合部位の飽和変異生成に使用される。タンパク質結合部位が不明な場合は、このプロトコルを使用して同定できます。この技術は、疾患診断および治療に関連しています。

生物医学の可能性は、まだ十分に活用されていると思います。この方法は、望ましい分子が望ましくない分子から分離され得る任意のタンパク質または反応に広く適用することができる。ライブラリが適切にランダム化されていることを確認し、各結合および分離ステップの間に、所望の分子のフォールド濃縮が高いことを確認してください。

それは言葉で説明するのではなく、いくつかのステップと多くの詳細を含みます。このビデオを見た後、ランダムライブラリを準備し、開始RNAプールを合成し、高い親和性と特異的バインダーを得るために望ましい分子と望ましくない分子を分離する結合反応を行う方法に慣れるはずです。まず、DNAシンセサイザー上で化学合成によりフォワードプライマーとリバースプライマーを合成する。

また、31のランダム化された位置を用いてランダムライブラリオリゴヌクレオチドテンプレートを合成する。PCRチューブで、1マイクロモルDNAランダムライブラリテンプレートを混合し、 T7 RNAポリメラーゼプロモーターおよびリバースプライマーを含む1マイクロモルフォワードプライマー、pH8で20ミリモルトリス、1.5ミリモル塩化マグネシウム、50ミリモル塩化カリウム、1-ミリグラムのアセチル化ウシ血清アルブミン、タクポリメラーゼの2単位、および200マイクロモル各dNT5サイクルの変性、アニーリング、および延長ステップでPCRマシンを設定し、続いて1サイクルの延長を行い、プロモーターをDNAライブラリに取り付けます。

T7転写バッファー、1マイクロモルランダムライブラリプールDNA、5ミリモルDTT、2ミリモルGTP、ATP、CTP、およびUTPのそれぞれ1ミリモル、および2単位/マイクロリットルT7 RNAポリメラーゼを含む100マイクロリットル転写反応を設定します。今アクリルガラスの盾と手袋を着用してください。5マイクロリットル以下のα-32P UTPをオートラジオグラフィー用転写反応に添加して放射能を導入する。

反応混合物をマイクロ遠心チューブに37°Cで2時間インキュベートします。RNAをゲル化するために、10%変性ポリアクリルアミドゲルを調製する。サンプルをゲルのウェルにロードします。

ゲルをX線フィルムに露出させ、ゲル上の転写物の位置を特定し、ゲルスライスを切り取ります。ゲルスライスを遠心管に入れ、ホモジナイザーチップで小さく割ります。プロテイナーゼKバッファーを加えた後、ゲル片を浸します。

チューブを常温で少なくとも2時間は、ヌテレーターに置いたままにしておきます。次に、高速マイクロ遠心分離機を室温で5分間回転させ、ゲルデブリを取り除き、緩衝液を回収します。上清、渦、遠心分離機でチューブに等量のフェノールクロロホルムを加えます。

フェノールクロロホルムをもう一度、クロロホルムでもう一度抽出を繰り返します。次に、pH 5.2で酢酸3モルナトリウムの1/10容量、10マイクログラムのtRNAまたは20マイクログラムのグリコーゲン、およびマイナス20°Cで貯蔵されたエタノールの2〜3ボリュームとプロテナーゼKバッファーの水相を混合します。チューブをマイナス80度で1時間放置します。

マイクロ遠心分離機で摂氏4度で5〜10分間溶液を含むチューブを回転させます。上清を慎重に捨て、70%エタノールを加えてRNAペレットをすすきます。2~5分間スピンします。

エタノールを注意深く吸気し、RNAペレットを空気乾燥する。次に、DEPCで処理した50マイクロリットルの水を加え、RNAペレットを可溶化します。サンプルはマイナス20°Cに置いて保管してください。

100マイクロリットルの反応体積でタンパク質とRNAを結合するために、最初に50ミリモルカリウムクロリド、1ミリモルDTT、09マイクログラム/マイクロリットルウシ血清アルブミン、5単位/マイクロリットルRNAsin、15マイクログラム/マイクロリットル、15マイクログラムの1マイクロリットル、15マイクログラムを含むpH 7.5で10ミリモルトリス塩酸塩を調製する。次に、組換えタンパク質PTBの30マイクロリットルと適切なプールから10マイクロリットルのRNAを加えます。結合反応を含むチューブを温度ブロックに25°Cで約30分間入れます。

次に、結合したRNAを非結合RNAから4ラウンドの選択および増幅を分画します。まず、真空マニホールドに取り付けられたニトロセルロースフィルターを介して、室温で100マイクロリットルのサンプルをフィルター処理します。RNAタンパク質複合体は、フィルター上に残っています。

滅菌カミソリの刃で、フィルターを破片に刻み、遠心分離管に挿入します。フィルター片をプロテナーゼKバッファーに浸し、最低3時間または一晩タンブラーに置いてRNAを回収します。RNAサンプルを脱タンパク化するには、等量のフェノールクロロホルム、渦、そして室温で5分間高速で遠心分離機を加えます。

水相を得て、再びクロロホルムで抽出する。その後、pH5.2で酢酸3モルの1/10容量と絶対エタノールの2〜3ボリュームと上清を混合します。マイナス80度の冷凍庫に30分間チューブを残し、10分間高速で遠心分離します。

洗浄と乾燥の工程を70%エタノールで繰り返し、DEPC処理水にRNAを可溶化します。フィルター結合アッセイの第1ラウンド後、さらに3ラウンドを実施する。次に、2ラウンドの転写、結合、および増幅を行い、タンパク質結合RNA画分を非結合画分から分離する。

5x TBEバッファーに60対1のアクリルアミド-ビスアクリルアミド比を有する天然5%ポリアクリルアミドゲルをプレキャストする。次にRNA-タンパク質結合反応をセットアップします。5倍のTBEバッファーを充填した電気泳動装置にゲルを摂氏4度の冷たい部屋に入れます。

250ボルトを15分間塗布し、異なるウェルにピペットを結合反応させた。次に、250ボルトで1〜2時間電気泳動を行い、結合したRNAから結合したRNAをさらに分画する。次に、ゲルをX線フィルムに露出させ、オートラジオグラフィーを用いて結合RNAの位置を特定する。

結合RNAでゲルスライスを切り取り、チューブに挿入します。ゲルスライスを粉砕し、プロテナーゼKバッファー中で3時間または一晩インキュベートする。前述のようにフェノールクロロホルムとクロロホルムで抽出を繰り返します。

溶解したRNAからcDNAを合成する。20マイクロリットルの10x RTバッファー、2マイクロリットルのAMV逆転写酵素、1マイクロリットルの逆プライマー、5マイクロリットルの水、および10マイクロリットルの溶解RNAを含む20マイクロリットルの反応を調製します。摂氏42度で60分間インキュベートします。

前述のように20~25のPCRサイクルを使用してcDNAを増幅します。RNA合成、タンパク質結合、およびタンパク質結合および結合されていない分画の分離のプロセスを繰り返します。タンパク質結合を解析するには、ゲル移動性シフトアッセイまたはフィルター結合アッセイを使用して、各プール内の選択されたプールまたは個々の配列の結合親和性および特異性を決定します。

オートラジオグラフィーまたは蛍光体イメージャーを使用して、バインドされた分数と非結合分数のバンドを検出して定量化します。クローン作成とシーケンスのアライメントを使用して、プロトコルを続行します。本研究では、選択増幅が成功した。

哺乳類ポリピリミジントラクト結合タンパク質は300倍高いタンパク質濃度を有し、プールゼロ配列への結合はほとんど検出できないが、選択された配列プールに対する親和性が高いことを示す。選択増幅は、好ましいまたはコンセンサス結合部位を有するRNA結合タンパク質で同定に成功した。上流の3つの素数のスプライスサイトに結合する組換えPTBの付加は、代替または下流の3素数スプライスサイトの活性化をもたらす。

対照的に、組換えhnRNP Cを添加すると、両方の3素数スプライス部位の抑制が生じる。組換え一般スプライシング係数U2AF65の添加は、hnRNP C媒介三原性スプライス部位抑制を逆転させた。適切な無作為化ライブラリと、各バインドステップで高い倍の濃縮を与える適切なバインド条件が成功するために必要であることを覚えておくことが重要です。

適切な機能アッセイおよびインビボ試験を使用して、このアプローチの結果を検証することができます。遺伝子発現の分野では、この技術を用いて多くのタンパク質の機能が検討されている。ポリアクリルアミドや放射能を使用しながら、保護のために手袋と放射性シールを使用することが重要です。