Name: マウスの心不全を誘発するイソプロテレノールミニポンプの移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 学ぶマウス心不全モデル構築法。浸透圧ポンプによるイソプロテレノール慢性投与で、心機能評価と組織学的解析を可能にする。手技が簡便で外科的専門性を要さず、多くの研究者が利用できる有用な手法である。

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著者らは、資金援助のためのNIH K08 HL133491を認めます。

このプロトコルは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物ケアガイドライン(ARCプロトコル#2010-075)に準拠しています。読者は、手順のマウスケアと鎮鎮薬管理は機関固有である可能性があるため、独自のIACUC承認プロトコルに従うことをお勧めします。
1. イソプロテレノール浸透圧ポンプの調製
注:この手順は、100以上の交配マウス株から18+gの重量を量る9+週齢の雌マウス、ならびに株のサブセットの雄マウスに正常に適用されました。この手順には、体重の上限はありません。治療の年齢が心不全発症に対するイソプロテノール誘発感受性に影響を与えるかどうかは不明であるとして、常に年齢に一致するコントロールを含む。
<ol><li>各マウスの体重を計量し、記録します。</li>
	<li>各マウスのイソプロテレノールの適切な量と濃度を計算します (表 1を参照してください。;補足ファイル)。 注:この実験で使用される浸透圧ポンプ(材料の表)は100 μLの貯留体積を持ち、28日間の連続的な流量で薬物を提供するように設計されている。ポンプのローディング中に充填チューブの体積損失を考慮するために、ポンプあたりのイソプロテレノール溶液の余分な20 μLを準備します。</li>
	<li>分析バランスを用いて適量のイソプロテレノール(表1)を計量し、無菌0.9%NaCl溶液の120μLに溶解させる。ピペットは、イソプロテレノールを完全に可溶化するために1分間、激しくまたは渦を作る。 注:実験室のバイオセーフティキャビネットに浸透圧ポンプを準備します。ポンプは外科手袋で扱われるべきである。滅菌技術は浸透圧ポンプの調製および外科的注入プロシージャの間に推薦される。</li>
	<li>空の浸透ポンプをフローモデレータと一緒に計量して記録し、フローモデレータを取り外します。</li>
	<li>1.0 mLシリンジにイソプロテレノール溶液の120 μLを吸引し、浸透圧ポンプで提供される27ゲージの鈍い先端充填管を取り付けます。 注:注射器と充填チューブに気泡がないことを確認してください。</li>
	<li>ポンプを直立した位置に保持しながら、充填管の先端がポンプ貯蔵所の底部付近に座るまで、上部のポンプ開口部を通して充填管を挿入します。</li>
	<li>イソプロテレノール溶液がポンプ開口部まで満たされるまで、シリンジプランジャーをゆっくりと押して浸透ポンプをロードします。</li>
	<li>充填チューブを慎重に取り外し、余分な溶液を拭き取ります。</li>
	<li>フローモデレータを挿入してポンプを閉じ、余分な溶液を拭き取ります。</li>
	<li>浸透ポンプを再計量して、貯水池の体積の90%以上が充填されたことを確認します。 注:制御ポンプは無菌0.9%NaCl溶液でポンプ貯蔵所を満たすことによって同じ方法で調製される。</li>
</ol>2. 手術器具の準備
<ol><li>光ファイバーOリング光顕微鏡照明器、2つの鉗子、針ホルダー、ホットビーズ滅菌器、ガラスビーズ、およびはさみを含むすべての外科器具をきれいにする(材料の表)。</li>
	<li>手術前に器具を殺菌するために30分間121°Cのオートクレーブ手術器具。</li>
</ol>3. イソプロテノール浸透圧ポンプ外科移植
<ol><li>95%O2および5%のCO2で3%のイソファルランを持つ誘導室にマウスを置くことによって麻酔を誘発する。2%のイソファルランで麻酔を維持します。</li>
	<li>鎮鎮鎮鎮鎮薬のために肩甲骨の間の首の擦り傷に5 mg/kgのカルプロフェンs.c.を投与する。</li>
	<li>角膜脱水を防ぐために眼の目に眼のチントを置きます。</li>
	<li>呼吸数、つま先ピンチ反射、粘膜の色をモニタリングして麻酔の深さを確認します。</li>
	<li>加熱されたパッドの上にマウスを置きます。下腹部から毛髪を取り除き、ベタジンまたはクロルヘキシジンで皮膚を消毒する。 注:術後の感染を最小限に抑えるには、外科用フィールドにインシデントヘアがないことを確認してください。</li>
	<li>外科用はさみを使用して、長さ1cmの中線皮膚切開を切り取ります。鈍い終わりのはさみを使用して、下の腹膜壁から皮膚を慎重に解剖します。 注:ポンプのサイズを収容するために、経皮内送達が好ましい。</li>
	<li>鉗子で下の腸から下腸壁を引き離し、細かい外科はさみを使用して根間壁に0.8センチメートルの穴を切ります。</li>
	<li>浸透圧ポンプをフローモデレータの端部で下垂部器内腔に挿入します。</li>
	<li>中断された方法で5.0吸収性縫合糸を使用して、口内壁のホールドを閉じます。6.0非吸収性縫合糸を使用して、皮膚切開を中断した方法で閉じます。</li>
	<li>マウスを専用のインキュベーターに入れ、回復時に温めて乾燥させます。正常な呼吸および動きの復帰のために最初の2時間で30分ごとにマウスを監視することによって麻酔からの回復を評価する。</li>
	<li>マウスが麻酔から完全に回復したら、それを日常的なハウジングに戻します。毎日3日まで合併症の動物を監視し続け、その後2~3日ごとに実験が終わるまで続ける。 注:動物は、術後の痛みや感染症、体重減少の兆候、運動能力の欠如、異常な姿勢、新郎の失敗、切開部の過度の舐めまたは噛み付きの証拠を監視する必要があります。</li>
	<li>必要に応じて、24時間ごとに24時間ごとに5mg/kg s.c.を48時間まで投与し、その後投与する。</li>
	<li>外科部位感染を防ぐために、飲料水中に0.25 mg/mLアモキシシリンを5日間投与する。</li>
	<li>7~10日後に吸吸収性の縫合糸を取り除きます。</li>
</ol>4. 麻酔下の心エコー評価
注:心エコー評価は、数週間にわたって連続的な心臓リモデリングを監視するために繰り返し行うことができます。3週間にわたって毎週の間隔で心エコー測定を行いました。
<ol><li>イソファルランの1.25%から1.5%で誘導室で麻酔を誘発する。適切に鎮静したら、マウスをテープで心エコー検査プラットフォームに固定し、マウスが鼻コーンを通して麻酔を受け続けられるようにします。</li>
	<li>過剰老化の負のクロノートロピックおよびイノートロピック効果を最小限に抑えるために、1%の維持投与量にイソファランを減少させる。研究全体を通して呼吸と心拍数に注意し、必要に応じてイソフラン投与量を調整します。.</li>
	<li>脱毛ローションで胸毛を取り除き、毛のない胸を拭きます。</li>
	<li>胸に超音波ゲルを配置し、心臓を画像化する超音波プローブを配置します。</li>
	<li>B モードでは、パラスタール長軸ビューで左心室 (LV) をイメージします。心エコー検査プラットフォームを調整して、超音波ビームの平面に大動脈弁とLV頂点を合わせます。</li>
	<li>心エコー検査プラットフォームを傾けて、LV長軸を超音波ビームに90度、LV最大径を画像の中心に配置します。</li>
	<li>超音波プローブを90度回してLV短軸を画像化します。</li>
	<li>Mモードでは、LV壁の厚さと内部寸法を測定します。</li>
	<li>マウスをケージに戻します。正常な呼吸および自発的な身体の動きの復帰のためのモニター。</li>
</ol>

<ol><li>Hartupee, J., Mann, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurohormonal+activation+in+heart+failure+with+reduced+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Neurohormonal activation in heart failure with reduced ejection fraction.</a> Nature Review Cardiology. 14 (1), 30-38 (2017).</li>
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<li>Hohimer, A. R., Davis, L. E., Hatton, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+daily+injections+and+osmotic+pump+infusion+of+isoproterenol+cause+similar+increases+in+cardiac+mass+but+have+different+effects+on+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Repeated daily injections and osmotic pump infusion of isoproterenol cause similar increases in cardiac mass but have different effects on blood pressure.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 83 (2), 191-197 (2005).</li>
<li>Cross, H. R., Murphy, E., Koch, W. J., Steenbergen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+and+female+mice+overexpressing+the+beta%282%29-adrenergic+receptor+exhibit+differences+in+ischemia%2Freperfusion+injury%3A+role+of+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Male and female mice overexpressing the beta(2)-adrenergic receptor exhibit differences in ischemia/reperfusion injury: role of nitric oxide.</a> Cardiovascular Research. 53 (2), 662-671 (2002).</li>
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</ol>

著者は何も開示していない。

我々は、慢性βアドレナリン刺激2、13に起因する心臓の結果を評価するために、100以上のヒトマウスの100以上の株にこの方法を適用しました。イソプロテレノールに対する感受性の有意な差は、マウス株の間に存在することが知られており、必要に応じて関心の株にカスタマイズされてもよい16。これは、マウス株17間のβアドレナリン受容体機能の変動、自律神経系活性16における株依存性の相違、β-アドレナリン受容体(β-AR)密度および/または結合17に起因する可能性がある。株間の他の遺伝的違い。生体内の連続心エコー検査と、ISOの有無にかかわらず、細胞プロセス、細胞外マトリックスから炎症に至る慢性イソプロテレノール治療は顕著な違いを誘発した。応答2,<sup class="xre...

排出率の低下した心不全(HFrEF)は、心血管恒常性1を維持するために交感神経系の十分に認識された代償応答を伴う。血行力学的ストレスと心臓および循環に対する有害な影響は、慢性的な活性化で観察された。これらは、心不全に対する現代の薬物療法の基礎となり、心不全の進行および神経ホルモン系1の治療的拮抗作用における重要なメカニズムである。
心不全の基本的な調査のためにいくつかのマウスモデルが利用できる。遺伝モデルは、分子療法を探索し、シグナル伝達経路を調べると魅力的です。しかし、これらのモデルは、心不全の一般的な形態に関連しない場合があります。他の一般的なモデルは、左前降下(LAD)動脈結血、経動脈収縮(TAC)、およびイソプロテノール(ISO)を含み、それぞれが異なる病理学的病因2、3、4、5を目指す 、6.LAD動脈ライゲーションは、このように虚血性心筋症に特有のモデルを作成する前壁心筋梗塞を誘発する。TACは急性圧力過負荷を誘発し、心不全の高血圧モデルを作成する。圧力勾配は測定できるが、肥大の層化を可能にするが、高血圧の急性発症は直接的な臨床的関連性4を欠いている。LADおよびTACモデルは両方の実行するために高レベルの外科的専門知識を要求する。心不全の急性ISOモデルは、急性心筋梗塞を模倣する左心室におけるカテコールアミンおよび活性の著しい増加を特徴とする、ストレス誘発性心筋症(タコツボ病とも呼ばれる)を模倣する7、 8.対照的に、心不全の慢性ISOモデルは、高度な心不全の症状特性を示し、カテコールアミン1の慢性的に上昇したレベルを持つ。慢性ISOモデルの利点は、高度な心不全を模倣する慢性アドレナリン刺激を提供し、比較的容易に作成することです。研究者は、関心のある病理を最もよく要約するモデルを選択する必要があります。
この方法の全体的な目標は、心不全患者1で見つかった慢性交感神経活性化を模倣するためにISOを連続的に放出する移植されたミニポンプを使用してマウスの心不全を誘導することです。この方法はシンプルで再現性があります。マウス株間には明らかなばらつきがあるが、30mg/kg/日で3~4週間にわたって投与されたISOは、ほとんどのマウスで心臓リモデリングを誘導するのに十分である。具体的には、ISOは第1週の間に肥大型補償期を導き、その後、壁の間引き、心室拡張および収縮期機能の第2週および第3週2による減少を引き起こす。ISOモデル作成の成功は、肥大、拡張、心室機能不全を示す連続心エコー検査、ならびに心膜内採取心臓組織の組織学的および分子的評価を介して生体内で評価することができる。脂質蓄積、線維症、ERストレス、アポトーシス、および遺伝子発現9、10、11、12.

<table><tbody><tr><td>Alzet</td><td>モデル1004</td><td>の所定の位置に流れの減速子が付いているマイクロ浸透圧ポンプ</td><td>満ちる管、流れの減速子およびポンプ本体を含んで</td></tr><tr><td>いる(-)-イソプロテレノールの塩酸塩</td><td>ΣAldrich</td><td>16504-1G</td><td>(-)-イソプロテレノールの塩酸塩は-20°Cで保存される必要がある粉である。</td></tr><tr><td>1 ml滅菌シリンジ</td><td>VWR</td><td>BD309602</td><td></td></tr><tr><td>30 W LED 光ファイバーOリング光学顕微鏡イルミネーター</td><td>AmScope</td><td>SKU: LED-30WR</td><td></td></tr><tr><td>5-0 コーティングされたアクリル(ポリグラクチン910) 縫合</td>糸 <td>Ethicon</td><td>J303H</td><td>5-0、吸収性</td></tr><tr><td>ファインハサミ - シャープ</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>FST</td><td>18000-46</td><td></td></tr><tr><td>ホットビーズ滅菌器</td><td>FST</td><td>18000-50</td><td></td></tr><tr><td>虹彩鉗子</td><td>WPI</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>シャーポイント 6-0、18インチ ブラック ナイロン モノフィラメント縫合</td>糸 <td>AA-2176</td><td>6-0、非吸収性</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>WPI</td><td>15926</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水、0.9% NaCl</td><td>フィッシャー</td><td>89167-772</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの心不全を誘発するイソプロテレノールミニポンプの移植

Implantation of an Isoproterenol Mini-Pump to Induce Heart Failure in Mice

イソプロテレノール(ISO)は、非選択的βアドレナリン作動性アゴニストであり、マウスにおける心臓損傷を誘導するために広く使用されている。急性モデルはストレス誘発性心筋症を模倣するが、浸透性ポンプを介して投与される慢性モデルは、ヒトにおける高度な心不全を模倣する。記載されたプロトコルの目的は、移植されたミニポンプを使用してマウスにおける慢性ISO誘発心不全モデルを作成することである。このプロトコルは、100株以上のヒトマウスの心不全を誘導するために使用されている。外科ポンプ移植に関する技術は詳細に説明され、マウスで心不全モデルを作成することに興味がある人に関連する可能性があります。さらに、各株の心エコーパラメータに基づく毎週の心臓リモデリングの変化と、モデル開発までの予想時間を紹介します。要約すると、この方法はシンプルで再現可能です。3〜4週間にわたって埋め込まれたミニポンプを介して投与される連続ISOは、心臓のリモデリングを誘発するのに十分である。最後に、ISOモデル作成の成功は、肥大、心室拡張、および機能不全を示す連続心エコー検査によって生体内で評価されうる。

我々の以前に発表された研究では、我々は105ハイブリッドマウスダイバーシティパネル(HMDP)株2、13を横切る浸透圧ポンプを介して21日間にわたって30 mg/kg/dのISO投与量を投与した。ISO治療のベースライン、第1週、第2週、第3週で行われた心エコー検査を用いて結果を評価した(図1)。著者が23匹のマウス株14の間でイソプロテレノールの影響を研究した以前の研究と同様に、心エコーパラメータ間の顕著な間ひずみ変動を観察した。心エコーパラメータに基づく毎週の変化の概要とモデル開発までの予想時間の概要 (図 2および図 3)2,15.マウス株間で変動が観察されたが、平均して、エ...

移植された浸透性ポンプを介したイソプロテレノールの慢性投与は、マウスの高度な心不全を模倣するために広く使用されている。ここでは、3週間にわたる連続イソプロテレノール投与に対する外科的ミニポンプ移植の詳細な方法と、モデル作成に成功するための心エコー評価について説明する。

Isoproterenol (ISO), is a non-selective beta-adrenergic agonist, that is used widely to induce cardiac injury in mice. While the acute model mimics ...

浸透圧ポンプを介したイソプロテレノールの慢性投与は、マウスにおける進行した心不全の変化を再現するために広く使用されてきた。この方法は簡単で、LADやTACなどの他のモデルよりも少ない外科的専門知識を必要とします。この手順のデモンストレーションは、イビン・ワン博士の研究室の研究科学者であるヴィンセント・レン博士です。各マウスの体重を秤量して記録した後、各動物に対してイソプロテレノールの適量と濃度を計算し、イソプロテレノールを120マイクロリットルの無菌0.9%塩化ナトリウムに溶解する。イソプロテレノールを完全に可溶化するために1分間徹底的に混ぜ、マウスごとにフローモデレーターの有無にかかわらず、1つの空の浸透圧ポンプの重量を計量して記録します。浸透性ポンプを備えた27ゲージの鈍い先端の充填管を取り付け、120マイクロリットルのイソプロテレノール溶液を1本の1ミリリットルのシリンジに1本積み込みます。ポンプを直立した位置に保持し、充填管の先端がポンプ貯蔵所の底付近に位置するまでポンプ開口部を通して充填管を挿入し、イソプロテレノール溶液がポンプ開口部に充填されるまでシリンジプランジャーをゆっくりと落ち込ませる。ポンプが積み込まれたら、充填管を慎重に取り外し、余分な溶液を拭き取ります。フローモデレータを挿入してポンプを閉じ、余分な溶液を拭き取ります。その後、ポンプを再計量して、貯水池の体積の90%以上が満たされていることを確認します。マウスを熱いパッドの上の位置に置き、下腹部から空気を取り除きます。手術用浸透圧ポンプの移植では、麻酔をかけマウスのつまみつまみへの応答の欠如を確認し、動物の目に軟膏を塗布する。適切な消毒剤で露出した皮膚をきれいにし、1センチメートルの中線皮膚切開を行います。鈍い終わりのはさみを使用して、下層壁から皮膚を慎重に解剖し、鉗子を使用して腹膜壁を下の腸から引き離します。細かいはさみを使用して腹壁の0.8センチメートルの穴を切断し、浸透性ポンプフローモデレータの端を最初に腹腔に挿入します。ポンプが設置されている場合は、5-0吸収性縫合糸を中断して腹壁の穴を閉じ、6-0の非吸収性縫合糸を使用して皮膚を閉じます。その後、動物を自宅のケージに戻す前に、完全な債務まで監視する専用のインキュベーターにマウスを置きます。ここでは、選択した心エコーパラメータとモデル開発までの予想時間に基づく週次変化の概要を示す。マウス株間の変動は観察されるが、平均して、最後の直径収縮時の脳室中隔壁厚さ、および最初の週の分数短縮の増加が、後の時点で減少する。末端の左心室内径は、左心室質量は3週間にわたって増加する。さらに、マウスの心臓は、イソプロテレノールの下で目に見えて大きな左心室の寸法を示すだけでなく、生理活性を処理したコントロールに対する線維症の量が多い。術後の感染と罹患

implantation-an-isoproterenol-mini-pump-to-induce-heart-failure

Research

JoVE Journal

Medicine

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このプロトコルの目的は、段階的に説明するマウスにおける低侵襲横大動脈狭窄 (TAC) の技術。挿管や一般的に使用される標準的な手順に必要な換気の除去、TAC...

左室肥大の誘導マウスにおける低侵襲の横大動脈狭窄のテクニック

ここでは、右心室不全のメカニズムを研究するための有用なアプローチを提供する。肺動脈収縮へのより便利で、有効なアプローチは、社内で作られた手術器具を使用して確立されます。さらに、心エコー検査およびカテーテル法によるこのアプローチの品質を評価する方法が提供される。...

肺動脈収縮による右心室障害の誘導とマウスにおける右心室機能の評価

このプロトコルは、心不全をモデル化する梗塞マウスの心外膜に3Dバイオプリントパッチを移植することを目的としている。麻酔、手術胸部開口部、左前下降(LAD)冠動脈の永久結紮、心臓の梗塞領域へのバイオプリントパッチの適用に関する詳細が含まれています。...

心筋梗塞のマウスモデルにおける3次元バイオプリントパッチの移植

組織のクリアの精製方法が開発され、成体マウスの心臓に適用された。この方法は、遺伝的レポーター戦略に起因する標識された線維芽細胞蛍光を維持しながら、緻密な自己蛍光心臓組織をクリアするように設計された。...

健康で負傷したマウス心臓における三次元線維芽細胞組織のための精製されたCLARITYベースの組織クリアリング

本プロトコルは、下行大動脈狭窄を使用して駆出率を維持した心不全のミニブタモデルを確立するための段階的な手順を記述する。また、この疾患モデルの心臓の形態、組織型、および機能を評価する方法も紹介します。...

チベットミニブタの駆出率が保たれた心不全の外科的モデル

マウスの心筋梗塞部位周辺の超音波ガイド下細胞送達は、安全で効果的で便利な細胞移植方法です。...

心筋梗塞マウスにおける超音波ガイド下多能性幹細胞由来心筋細胞移植術

本プロトコルは、心エコー検査ガイダンスの下でのウイルスの直接心筋内注射によるラットおよびマウス心臓における導入遺伝子発現の方法を記載する。孤立したランゲンドルフ灌流心臓のプログラムされた電気刺激による心室性不整脈に対する心臓の感受性の評価方法もここで説明されています。...

げっ歯類の心臓におけるウイルス導入遺伝子発現と心不整脈リスクの評価

本プロトコルは、ブタモデルにおいて心活性治療薬を投与する3つの方法を記述する。雌の在来種豚は、(1)開胸術と経心的心内膜注射、(2)カテーテルベースの経心内膜注射、または(3)頸静脈浸透圧ミニポンプ による...

ブタ心筋梗塞モデルにおける心役活性治療薬の送達

本プロトコルは、自作リトラクターを用いた低侵襲横断大動脈狭窄(TAC)手順を伴う修正され単純化された技術を記述する。この手順は人工呼吸器や顕微鏡なしで行うことができ、圧力過負荷を引き起こし、最終的には心肥大または心不全につながります。...

マウスにおける横行大動脈狭窄の修正技術

本プロトコルは、心不全のマウスモデルにおける拡張期機能の評価における貴重なツールとして役立つ経食道ペーシングによる圧力と体積の関係の取得について記述している。...

マウス心不全モデルにおける心拍数依存性拡張期機能の評価のためのペーシング制御手順

このプロトコルは、駆出率が維持された高脂血症誘発性心不全(HFpEF)のマウスモデルを再現するための詳細なアプローチを示しています。このデザインは、アデノ随伴ウイルス9-心筋トロポニンT-低密度リポタンパク質受容体(AAV9-cTnT-LDLR)とポロキサマー-407(P-407)の投与を組み合わせたものです。...

駆出率を維持した高脂血症誘発性心不全のマウスモデル

学ぶマウス心不全モデル構築法。浸透圧ポンプによるイソプロテレノール慢性投与で、心機能評価と組織学的解析を可能にする。手技が簡便で外科的専門性を要さず、多くの研究者が利用できる有用な手法である。

マウスの心不全を誘発するイソプロテレノールミニポンプの移植

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