変異体メラノサイト幹細胞からのマウス黒色腫開始の空間的および時間的制御

黒色腫は世界的に広く診断され、発生率が増加しています。これらのプロトコルは、黒色腫開始の初期段階を慎重に制御することを可能にし、その発達の研究を促進する。メラノサイト幹細胞の活性化の時間と位置を制御することにより、幹細胞集団内の変化とその新しい株黒色腫の開始を識別する能力を有する。

この手順のデモンストレーションは、研究室の大学院生であるダヒム・キムとルイ・アンです。処置を開始する2〜3日前に、電気トリマーを使用して、各麻酔付き7週間のマウスから後ろ肌を剃ります。実験当日は綿棒を使用して、露出した皮膚に脱毛クリームの薄い層を塗布します。

クリームを均等に塗布したら、清潔な綿棒を使用してクリームを取り除き、湿った布で穏やかに拭いて残留クリームを取り除きます。その後、完全な回復まで監視して、ホームケージに各マウスを戻します。UV-B照射の場合は、所望の領域のみが露出するように、UV-B保護材料で後面皮膚を覆い、UV耐性の蓋でUVチャンバーを覆います。

次に、UV-Bランプをオンにして、マウスを適切な実験期間に照射してから、完全に回復するまで監視してマウスを空のケージに戻します。皮膚サンプルを分離するには、電気トリマーを使用して安楽死させた照射マウスの後部皮膚領域から毛髪を除去し、露出した皮膚を糸くずのない組織で軽くブラッシングして領域をクリアする。尾の基部のすぐ上に鋭いはさみで小さな切開を行い、皮下結合組織を分離するために切開に大きな鈍いはさみを挿入します。

鋭利なはさみを使用して、目的の皮膚領域の端に沿って慎重に切断し、組織サンプルを分離し、切除された皮膚組織をきれいなペーパータオルの上に置きます。その後、鈍い鉗子を使用して皮膚を伸ばし、タオルに付着し、緊張するようにします。すべてのサンプルが収穫されたら、折り目のすぐ隣にある折り畳まれたろ過紙にスキンサンプルとペーパータオルをバッキングし、サンプルが滑らかで折りたたんだりくしゃくしゃにしたりしないように注意してください。

フィルターペーパーの側面をステープルで閉じ、用紙をトリミングします。その後、10%中性緩衝ホルマリンでサンプルを室温で3〜5時間完全に水没させ、脱イオン水に5分間の洗浄を2回洗浄して組織を洗浄します。2回目の洗浄後、皮膚組織から残留物質を慎重に取り除き、ギザギザしないようにサンプルの縁をトリミングします。

次に、各サンプルに3つの矢状カットを行い、ストリップの幅が5ミリメートル以下になるようにし、サンプルの幅が20ミリメートル以下になるように横切りカットを行います。最適な切断温度またはOCT培地を含むクライオモールドを縦向きに配置し、OCTの上に4〜5個の皮膚を配置します。すべてのピースが配置されている場合は、2組の細かい鉗子を使用して、各スキンの長いエッジをクライオモールドの底に持ち込み、サンプルがOCT内で垂直になり、金型の底部に垂直になるようにします。

次に、2 番目のリップに追加の OCT で金型を充填し、フォースを使用して、必要に応じてブロックが凍結し始めると、転送中にシフトした可能性のあるスキンピースを調整するために、ドライアイスの平らな表面に金型を配置します。マウスが出生後7週間である場合、背部皮膚は四色状態にある。四色細胞の間、毛包およびメラノサイト幹細胞は静止した休息状態にあることは知られており、皮膚は剃った後に有意な毛髪の成長を示すべきではない。

しかし、化学的脱毛は、毛包幹細胞の活性化を誘発し、関心領域内で有意な毛髪成長を誘発する。化学的脱毛は毛包およびメラノサイト幹細胞の両方の活性化を有意に誘導することができるので、活発な状態で黒色腫を起こしやすいメラノサイト幹細胞は、腫瘍を形成し、化学的脱毛の2週間以内に観察することができる。UV-B照射はまた、静止、腫瘍が起こりやすいメラノサイト幹細胞からの腫瘍開始を誘導することができる。

重要なことに、UV-Bは、卵胞性幹細胞ニッチから卵胞間表皮へのメラノサイト幹細胞の直接転位を誘導する。さらに、UV-Bは、濾胞性表皮全体にわたって、メラノサイト幹細胞由来の皮膚黒色腫形成を誘導することができる。皮膚の後部と同様に、UV-B誘発性黒色腫の開始は、耳の皮膚などの他の皮膚領域で顕著に観察され得る。

実際、UV耐性布で覆われたコントロール耳の皮膚と比較して、UV-Bに曝露された耳の皮膚は、黒色腫の開始の負担が高いため、より高い色素沈着を示している。UV-Bの異なる用量は、マウスの皮膚およびメラノサイト活性に異なる効果を有し得る。したがって、実験を開始する前に照射量を決定し、最適化することが重要です。