Name: 原子間力顕微鏡を用いて植物細胞と植物組織の機械的特性とターゴール圧を測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡を用いた植物細胞の機械的特性とターゴール圧の測定法。非侵襲的な手法で細胞壁のヤング率を解析し、発生メカニズムの理解に貢献します。

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<ol><li>Du, F., Guan, C., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+leaf+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of leaf morphogenesis.</a> Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).</li>
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著者は何も開示していない。

植物の形状の出現は、主に時間と空間の間の成長の協調速度と方向によって決定されます。植物細胞は、それらを一緒に接着するポリサカリディックマトリックスで作られた硬質細胞壁に包まれています。その結果、細胞増殖は、細胞壁を引っ張るターゴール圧と、この圧力に抵抗する細胞壁の剛性との平衡によって制御される。発達の根底にあるメカニズムを理解するためには、特定の器官の異なる組織や細胞における細胞壁の機械的特性とターガー圧の両方を測定できることが重要です。このホワイト ペーパーで示すように、AFM はこのコンテキストで選択する方法です。
プロトコルにはいくつかの重要な手順があります。最初の1つは、脱水を避けるために十分に速くする必要がある組織製剤です。特にターゴ気圧を測定する場合、これは非常に重要です。非常に重要なのは、その基板へのサンプルの正しい固定です:不安定なサンプルは、光学的に簡単に検出できるマクロスコピック運動、または力曲線の強い変形のような非常に明白な効果につながる可能性があります。とにかく、サンプルの振動や曲げは、結果にアーティファクトを導入し、検出するために微妙なことができます。最後...

原子力顕微鏡(AFM)は、スキャンプローブ顕微鏡(SPM)ファミリーに属し、通常数ナノメートルの半径を持つ先端がサンプルの表面をスキャンします。表面の検出は、光学式または電子ベースの方法ではなく、先端とサンプル表面との相互作用力によって達成される。したがって、この技術は、サンプル表面の地形特性解析(数ナノメートルまで下がることができる3D解像度)に限定されるだけでなく、静電、ファンデルワールス、接触力などのあらゆるタイプの相互作用力の測定も可能です。さらに、先端は、生体試料の表面に力を加え、得られた変形、いわゆる「インデント」を測定し、その機械的特性(例えば、ヤングの係数、粘弾性特性)を決定するために使用することができる。
植物細胞壁の機械的特性は、発達過程1、2、3の基礎となるメカニズムを理解しようとする際に考慮することが不可欠である。実際、これらの特性は、細胞が成長することを可能にするために細胞壁軟化が必要とされるので、特に、発達中に厳密に制御される。AFMは、これらの特性を測定し、臓器、組織または発達段階の間で変化する方法を研究するために使用することができます。
本論文では,AFMを用いて細胞壁の機械的特性とターゴール圧の両方を測定する方法について述べた.これらの2つの適用は2つの異なったAFM顕微鏡で実証され、後でここで詳しく説明される。

<table><tbody><tr><td>ACMを作るために使用される成長培地</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000倍ビマチンストック溶液</td><td></td><td></td><td>、組成はStanislas et al., 2017を参照。オートクレーブ後、注ぐ前にACMに加えます。</td></tr><tr><td>1-N-ナフチルフタラム酸(NPA)</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>132-66-1</td>を<td>シロイヌナズナ培地、10 &mu;Mに加えます。</td></tr><tr><td>寒天</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>9002-18-0</td><td>シロイヌナズナ培地に添加、1% w/v.</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>メルクミリポア</td><td>9012-36-6</td>は<td>、固体ACM、0.8%w / vの製造に使用されました。</td></tr><tr><td>シロイヌナズナ medium</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>DU0742.0025</td><td>in vitroシロイヌナズナ培養用、11.82g/L。</td></tr><tr><td>硝酸カルシウム四水和物</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>13477-34-4</td>を<td>シロイヌナズナ培地2 mMに加えます。</td></tr><tr><td>ムラシゲ &SKOOG MEDIUM</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>M0221.0025</td><td>ACMの製造に使用される基礎塩混合物、2.2 g / L。</td></tr><tr><td>N6-ベンジルアデニン(BAP)</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>1214-39-7</td>は<td>、ACMの製造に使用され、555 nMです。オートクレーブ後、注ぐ前にACMに加えます。</td></tr><tr><td>オリザリン治療のためのオリザリン</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>19044-88-3</td><td>、10 &mu;g/mLです。</td></tr><tr><td>植物保存混合物(PPM)</td><td>ACMを作るために使用される植物細胞技術</td><td></td><td>、0.1% v/v.オートクレーブ後、注ぐ前にACMに加えます。</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>1310-58-3</td>は<td>、シロイヌナズナ培地とACM、両方のpH 5.8を作るために使用されます。</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>57-50-1</td><td>はACMを作るのに使用され、1%w / v。</td></tr><tr><td>Tools for AFM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioScope Catalyst BioAFM</td><td>Bruker</td><td></td><td>このプロトコルでは、膨圧測定に使用されるAFMです。</td></tr><tr><td>Nanowizard III + CellHesion</td><td>JPK(ブルカー)</td><td></td><td>機械的特性の測定に用いるAFMです。</td></tr><tr><td>Patafix</td><td>UHU</td><td>D1620</td><td></td></tr><tr><td>参照エラシティック構造</td><td>NanoIdea</td><td>2Z00026</td><td></td></tr><tr><td>Reprorubber-Thin Pour</td><td>Flexbar</td><td>16135</td><td>生体適合性接着剤。</td></tr><tr><td>球面AFMチップ</td><td>ナノアンドモア</td><td>SD-SPHERE-NCH-S-10</td><td>機械的特性の測定に使用するチップです。</td></tr></tbody></table>

原子間力顕微鏡を用いて植物細胞と植物組織の機械的特性とターゴール圧を測定

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

ここでは、原子組織をインデントし、その機械的特性を回復するための原子間力顕微鏡の使用を提示します。インデントモードで2つの異なる顕微鏡を使用して、弾性率を測定し、それを使用して細胞壁の機械的特性を評価する方法を示します。また、ターゴル圧力の評価方法についても説明する。原子間力顕微鏡検査の主な利点は、非侵襲的で比較的迅速な(5〜20分)であり、表面的に平坦な生きている植物組織の事実上あらゆるタイプが治療を必要とせずに分析できることである。解像度は、先端のサイズと単位面積あたりの測定値の数に応じて、非常に良好なことができます。この方法の 1 つの制限は、表面的なセル層への直接アクセスのみを与える場合です。

図1Aと図1Bは、QIマップを取得する目的の領域を見つけるために使用されるプロトコルのステップ1.3.4~1.3.6の結果を示すスクリーンショットを示しています。目的の領域が傾斜面にないために選択された(すなわち、可能な限り平坦である)ことは言及する価値があります。実際には、Routier et al.5によって気づかるように、インデント軸が表面に対して垂直でない場合、測定されたヤングの係数は過小評価されうる。この効果は図1の C パネルまたは D パネルの右上隅に表示され、セルの境界線の一部がセルの残りの部分よりも柔らかく見えます。この効果によって誘発されるアーティファクトは、ローカルの傾斜角が50 x 50 μm2スキャン領域の40°を容易に克服できるメリステムの場合、はるかに強くなります。当研究室では、現在、Routie...

ここでは、細胞や組織に対してナノ・マイクロインデントツールとして動作する原子力顕微鏡(AFM)を紹介する。器械はサンプルの3D表面の地形および細胞壁ヤングの係数およびターゴール圧力を含む機械特性の同時獲得を可能にする。

We present here the use of atomic force microscopy to indent plant tissues and recover its mechanical properties. Using two different microscopes in ...

植物細胞の機械的特性は、開発の根底にあるメカニズムを理解しようとする際に考慮に入れ不可欠です。原子間力顕微鏡は、これらの特性を測定し、臓器、組織間、すべての発達段階の間で変化する方法に従うために使用することができます。この技術の主な利点は、それが侵襲的でなく、比較的迅速であり、それが直接生きているサンプルに適用することができるように治療を必要としないことです。この手順に新しい人のために、サンプルのcisセクションは本当に重要ですので、サンプルの機械的な固定が実際に適切であることを確認してください。この手順の視覚的なデモンストレーションは、サンプル固定、フォスターの品質管理および測定セットアップの複雑さをよりよく理解するために重要である。この手順をデモンストレーションするには、エンジニアのシモーネ・ボビオと、私の研究室のポストドクターであるユーチェン・ロンです。まず、直径5センチメートルのシャーレの中央に両面テープを入れます。花芽から分離された遺伝子のサンプルをテープに追加します。脱水を避けるためにサンプルが完全に覆われるまで、皿に水を素早く加えます。次に、サンプルを AFM ステージに置き、サンプルの上になるようにヘッドを移動します。カンチレバーを校正した後、ソフトウェアでは、システムがQIモードであることを確認し、15ナノニュートンの設定点力でサンプルにアプローチします。次に、Z の長さを 4 ミクロンに設定し、スキャン領域を 80 x 80 ミクロンに設定し、ピクセル数を 40 x 40 に設定します。次に、高度なイメージング設定パネルに移動し、モードを一定の速度に設定します。さらに、トラック速度を毎秒200ミクロンに入力し、サンプルレートを25キロヘルツに設定します。パラメータを設定したら、サンプル上の対象領域にヒントを移動します。スキャンする領域に破片が含まれないように確認し、可能な限り平坦な領域を見つけて、エンゲージしてからスキャンを開始し、サンプルが動くかどうかを確認するために急速な低力スキャンを使用します。関心のある領域が見つかったら、40~60×60~60ミクロンの領域を選択し、ピクセル数をミクロン当たり2ピクセルに増やします。次に、設定点を500ナノニュートンに増やし、100〜200ナノメートルのインデントを得る。Z の長さを 2 ミクロンに下げ、延びる速度を毎秒 100 ミクロンに入力し、サンプルレートを 50 キロヘルツに増やして、サンプルのスキャンを開始します。完了したら、出力をイメージとデータ ファイルの両方として保存します。データ処理ソフトウェアを開き、データファイルをロードします。マップのすべての曲線で同じパラメータを使用するには、[このマップをバッチ処理に使用] ボタンをクリックし、定義済みのプロセスをロードし、ヘルツフィットを選択します。次に、切り替え可能な基本線の操作に移動し、オフセットとチルトに減算を設定し、X 分を 40 ~ 60% に設定します。垂直の先端の位置タブで、生データを操作する場合は、スムーズにタイトに選択します。適切な適合モデルを選択するには、弾性フィットタブに移動し、予想される接着強度に基づいてオプションの 1 つを選択します。接着性が無いか弱い場合は、アプローチ曲線を使用し、ヘルツイズナードモデルを使用することを好みます。より強い接着の場合は、ダーゲン・ミリア・ドルトプロフまたはDMDのモデルを使用し、遅滞曲線に取り組みます。ここで、公称先端形状に基づいて、先端幾何学的パラメータを設定します。この実験で使用される先端は、半径400ナノメートルの球状の先端である。次に、ポアソン比を 0.5 に設定し、シフトカーブを選択します。メイン ウィンドウのアイコンをクリックして、2 つ目の弾性フィット ルーチンを追加し、同じパラメーター設定を繰り返します。最後に、X 分で目的のインデントを指定し、すべてのマップの曲線上で前のステップを反復処理するために、すべてを保持して適用します。結果を保存して、ドット tsv ファイル内のイメージを取得します。迅速な溶液の変化を測定するには、小さな粘着マスチックを保持して、シャーレにサンプルを取り付けます。マスチックとサンプルベースの間の隙間を生体適合接着剤で素早く密封します。接着剤が固まり、0.1%の植物保存混合物を含む液体の頂点培養培地にサンプルを沈下するのを待ちます。システムのキャリブレーションが終了したら、取得ソフトウェアを開き、まずチェックパラメータウィンドウに移動します。そこでは、カンチレバーの製造スプリング定数または確定スプリング定数にばね定数を設定します。次に、先端半径を400ナノメートルに、サンプルポアソン比を0.5に、サンプルラインを128に設定して迅速な取得を保証し、スキャンレートを0.2ヘルツに、スキャンサイズを1ミクロンに設定します。次に、ランプ ウィンドウに移動し、ランプ サイズを 5 ミクロン、トリグしきい値を最大値に、サンプルの数を 4,000 6008 に設定します。すべてのパラメーターを設定して、サンプルを慎重に手動でアプローチします。プローブがサンプル表面に比較的近い場合は、[アプローチ] をクリックします。接触すると、サンプルまたはチップを損傷することなく、所望のバランスに達するまで、スキャンサイズを徐々に増やし、スキャン速度を変更します。測定領域が希望どおりでない場合は、スキャンを再配置します。満足したら、ポイントとシュートウィンドウを開始するために、ボタンをクリックし、ポイントとシュートを撮影します。保管ディレクトリーとファイル名を指定します。次のスキャンでランプをクリックして、記録を開始します。スキャンが完了すると、ソフトウェアインターフェイスはランプウィンドウにリダイレクトされます。スキャンした画像をクリックして、インデントする位置を指定します。ベリーの中心付近のセルごとに少なくとも3つのインデント点を選択し、1 辺に 3 回インデントを繰り返すように設定してから、ランプをクリックしてキャプチャします。解析ソフトウェアでは、ドットMCAファイルを開き、スキャンした画像上の各力曲線の位置を示します。次に、解析する 1 つの力曲線を開きます。基準線補正ボタンをクリックし、ソースの基準線の開始と延長がソースの基準線の終了位置まで、またはそれぞれ 0%と 80% になるまで、フォース カーブの青い破線をドラッグします。次に実行をクリックします。次に、ボックスカーのフィルタボタンをクリックし、実行をクリックして力曲線を滑らかにします。次にインデント ボタンをクリックします。入力ウィンドウで、アクティブカーブを延長に設定し、5 番目の方法を線形化モデルに、最大フォース フィット境界を 99% に、最小フォース フィット境界を 75% に設定し、剛性に適合するモデルを設定します。一括で力曲線を解析します。これを行うには、[実行履歴] ボタンをクリックし、レポート ディレクトリを指定して、同じ処理を必要とする他の力曲線を追加します。完了したら、[実行] をクリックします。K の値がバッチフィットされたら、[履歴] をクリックし、5 インデントに移動してインデント ウィンドウに戻ります。そこで、最大フォース フィット境界を 10% に変更し、最小フォース フィット境界を 1% に変更します。次に、フィット モデルをヘルツィアンに設定します。次に、適切なファイルを開いて、スキャンした異なるチャンネルを表示します。ハイチャンネルウィンドウで、セクションボタンをクリックします。これにより、ターゴール圧力の控除に必要なサンプル表面曲率の測定が可能になります。次に、1 つのセルの長い軸を横切って線を描き、破線の境界をセルのエッジに移動して、半径の値を記録します。最後にテキストプロトコルに沿って、平均ヤング率、ばね定数、E、K、および各セルのturgor圧力を計算します。左の画像は、右側の画像を通してユーザー定義の力セットポイントまでの全体のインデントを分析することによって得られた若者の係数の地図であり、最初の100ナノメートルのインデントの分析の結果を示しています。この 2 つのマップは非常に類似していますが、インデントの深さの変化によりサンプルの異種が強調される場合があり、場所の特定や内部構造の動作に関する情報の提供に役立ちます。これらのマップ上の各ポイントには、基礎となる力曲線があります。ここに示す曲線は、言及する価値のある2つの効果を持っています。まず、力曲線の接近部が500ナノニュートンで終了する場合。下向きの先端の動きは続きます。チップによって適用される最終的な力が予想よりも高いことを意味します。2つ目の点は、楕円で強調されたリトラクトカーブ上の波です。このような振り手は、チップの作用下でのサンプル移動や振動の指標となり得、別の固定方法への切り替えが必要とされ得る。この記事で説明した手順を使用すると、細胞壁の厚さを除くターゴール圧力控除の主要パラメータはすべて、AFMスキャンとインデントから取得できます。赤十字位置における深いインデントの力曲線は、細胞壁若い弾性率と、曲線の異なるレジームにおけるサンプルの見かけの剛性を表します。サンプル固定は非常に重要です。測定プロセス中、サンプルの不安定性の兆候に注意してください。垂直なインデントを確保するために、平らなサーフェスを持つ領域を慎重に選択します。この手順に従って、時間の経過と共に機械的特性を監視し、さまざまな条件を監視できます。また、相関研究のための共焦点画像で機械的測定をオーバーレイすることもできます。この技術は、バイオメカニクスと生理学の開発やその他の生物学的プロセスを結びつける道を開きます。

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