Name: 下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 学ぶ ロボットマイクロマニピュレーションを用いた循環腫瘍細胞（CTCs）の単細胞分離法。高純度で単細胞を選択し、転移性シード能の評価と次世代シーケンスによる分子解析を可能にする革新的ワークフローです。

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私達は私達の研究のために血を寄付したすべての患者、またすべての関係の臨床医および研究の看護婦に感謝する。イェンス Eberhardt、Uwe コク birke、および ALS 自動化ラボソリューション GmbH からのカタリーナ Uhlig に感謝し、継続的なサポートを行っています。私たちは、フィードバックと議論のためにアセトラボのすべてのメンバーに感謝します。アセトラボでの研究は、欧州研究評議会、欧州連合、スイス国立科学財団、スイス癌連盟、バーゼル癌連盟、バーゼルの2州のチューリッヒを介して、バーゼル大学によってサポートされています。

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<li>Went, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+EpCam+protein+expression+in+human+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Frequent EpCam protein expression in human carcinomas.</a> Human Pathology. 35 (1), 122-128 (2004).</li>
<li>Soysal, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM+expression+varies+significantly+and+is+differentially+associated+with+prognosis+in+the+luminal+B+HER2%28%2B%29%2C+basal-like%2C+and+HER2+intrinsic+subtypes+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">EpCAM expression varies significantly and is differentially associated with prognosis in the luminal B HER2(+), basal-like, and HER2 intrinsic subtypes of breast cancer.</a> British Journal of Cancer. 108 (7), 1480-1487 (2013).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+breast+tumor+cells+exhibit+dynamic+changes+in+epithelial+and+mesenchymal+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition.</a> Science. 339 (6119), 580-584 (2013).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133 (4), 704-715 (2008).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+microfilter+device+for+selective+capture%2C+electrolysis+and+genomic+analysis+of+human+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Membrane microfilter device for selective capture, electrolysis and genomic analysis of human circulating tumor cells.</a> Journal of Chromatography A. 1162 (2), 154-161 (2007).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345 (6193), 216-220 (2014).</li>
</ol>

N.A. および B.M.S. は、循環腫瘍細胞および癌の治療に関連する特許出願に発明者として記載されている。N.A. は、液体生検に関心のある医薬品および保険会社の有償コンサルタントです。

CTCs の分子的キャラクタリゼーションは、転移性プロセスに対する我々の理解を改善し、新しい抗転移療法の開発を導くという約束を保持している。ここでは、CTC マイクロマニピュレーションおよび下流解析を可能にするこれらのプロトコルの詳細な説明を提供し、単一細胞ベースの機能アッセイ、遺伝子発現分析、および転移性電位に対するインビボ移植を含む評価20.
私たちのプロトコルの最も重要なステップの中で、CTC に富んだ製品のマイクロマニピュレーションは、比較的不均一な細胞懸濁液からの単一細胞分解能を獲得することを目的とし、すなわち、純度の最高レベルに到達し、品質を向上させることを可能にするその後の機能的または分子分析。例えば、CTCs の単一細胞ピッキングにより、私たちと他の人が、CTC の不均一性 (例えば、単一 CTCs、CTC クラスター、および CTC-WBC クラスター間の差異) を調査することが可能になり、両方の分子的観点から、および評価することができるという観点から転移-開始能力。一般的に、実験者が CTCs を...

遠隔臓器における転移の臨床的発現は、癌進行の最終段階を表し、癌関連死の 90% 以上を占める。局在化から転移性疾患への移行は多段階プロセスであり、しばしば循環腫瘍細胞 (CTCs)2、3、4によって媒介される。これらの細胞は、原発腫瘍から血液循環に流され、遠くの器官に運ばれ、そこで転移性病変5,6を extravasate ことができる。固形腫瘍は比較的高い数の CTCs を放出することができるが、ほとんどの CTCs は死ぬ運命にあり、循環における高い剪断力、アノイキス媒介性細胞死、免疫攻撃、または外来微小環境7に適応する能力が限られている。したがって、転移播種能力を持つ CTCs の分子特性を解剖するためのツールを確立することが重要です。最近の前臨床および臨床研究は、単一の CTCs および CTC クラスターの存在および量が、様々なタイプの固形腫瘍の患者におけるより悪い結果と関連していることを示唆する8,9,10,11,12,13,14.CTC クラスタは循環の間に互いに付す2つ以上の CTCs のグループで、単一 CTCs3、15、16と比較される転移を形成することでより有効である。クラスタ内の細胞は、デスモゾームおよび adherens 接合を介して強力な細胞細胞接着を維持し、アノイキス17,18を克服するのに役立つ可能性がある。最近、我々は、CTCs のクラスタリングが stemness および増殖関連転写因子の結合部位の hypomethylation にリンクされていることを観察し、転移19を首尾よく開始する能力を高めることにつながる。CTC クラスタ解離は、キー結合部位のリモデリングをもたらし、そして結果的に、それらの転移性電位19の抑制をもたらす。癌細胞のクラスターに加えて、CTCs は、白血球 (最も頻繁に好中球) に関連付けて循環中の高い増殖レベルを維持し、その転移性能力20を増加させることもできる。しかし、CTCs の生物学は部分的にしか理解されておらないし、単一およびクラスター化された細胞の根底にある分子的特徴と脆弱性を含め、いくつかの質問は開いたままである。
近年では、細胞表面発現パターンだけでなく、それらの分離のための CTCs の物理的特性を利用するいくつかの戦略が確立されています21,22,23,24,25. 抗原依存性分離法は、細胞表面上皮細胞接着分子 (EpCAM)26の発現に主に依存している。CTC 列挙のために最も頻繁に使用され、(現時点では) 唯一の FDA 承認プラットフォームは、CTCs21を分離するための2段階の手順に基づいている CellSearch システムです。最初のステップでは、血漿成分は遠心分離によって除去され、一方、CTCs は抗 EpCAM 抗体に結合した磁気 ferrofluids で捕捉される。第2工程において、CTC 富化溶液は、サイトケラチン (CK)8、18、19を発現する有核 (DAPI −陽性) 細胞について染色され、一方白血球 (WBCs) は、パン-白血球マーカー CD45.最後に、捕捉した細胞は、統合スクリーニングプラットフォーム上に配置され、CD45 については陰性である一方、CTCs は EpCAM、中正、および DAPI の発現を介して同定される。これは CTC 列挙のための金本位と考えられていますが、CTC 検索に内在する制約により、下流の分子分析はこの技術では困難です。さらに、その分離手順を考えると、CellSearch は、癌の不均一性27または上皮マーカーの下方制御に例えば、より低い epcam 発現を有する CTCs と比較して、より高い Epcam レベルの CTCs の濃縮を支持することができる28、29。これらの制限を克服するために、CTCs の富化のための抗原非依存性技術が出現してきた。例えば、iChip は、残りの血液成分からの CTCs および WBCs を含む有核細胞の流体力学的分離を統合し、続いて抗体タグ付き WBCs の immunomagnetic 枯渇により、タグなしおよび生存可能な CTCs の精製ができる。解決策25.さらに、ほとんどの CTCs が赤血球 (赤血球) や WBCs よりもわずかに大きいという事実は、サイズベースの CTC 濃縮技術23,30 (例えば、Parsortix システム (ANGLE)) を利用するマイクロ流体ベースの技術は、分離カセットを横切って狭窄チャネルを含む、10、8、6.5 または4.5 μ m のいずれかの末端間隙に細胞をリードする (異なるサイズは、標的癌細胞の予想される直径に応じて利用可能である)。血液細胞のほとんどは狭い隙間を通過し、一方、CTCs はそのサイズのために閉じ込められます (しかし、その低い変形性のためにも)、したがって、カセットに保持される。流れの方向を戻すことは捕獲された CTCs の解放を可能にし、下流の分析のために適している。しかし、CTC 分離のために選択されたプロトコルとは関係なく、典型的なポストエンリッチメント手順は、比較的少数の赤血球および WBCs と混合される CTCs を生成し、純粋な単一またはバルク CTCs の分析を困難にします。この問題に対処するために、我々は、血球汚染物質によって生じる潜在的なバイアスなしに CTC 操作を可能にするワークフローを確立した。事前に免疫染色を追加することで、可変抗体の組み合わせにより、CTCs を血液細胞から区別し、さらには異なる表面マーカー発現プロファイルを有する CTC サブグループを同定することができます。この高度にカスタマイズ可能な手順は、さらに特定のダウンストリームアプリケーションと組み合わせることができます。
ここでは、ctc が濃縮された製品 (任意の CTC エンリッチメント技術で得られる) から開始するワークフローについて説明し、1つのセルの分解能で CTC の生物学に関する洞察を得るためのいくつかのアプローチを組み合わせています。一言で言えば、私達のワークフローは生きて免疫染色によって単一の CTCs、CTC のクラスターおよび CTC-WBC のクラスターの識別を可能にし、前のインビボ培養プロトコルを使用して単一細胞のマイクロマニピュレーションおよび下流の分析に続いて、単一細胞配列決定、およびインビボ転移アッセイを行う。

<table><tbody><tr><td>抗ヒトEpCAM-AF488</td>細胞<td>シグナル伝達技術</td><td>CST5198</td><td>クローン:VU1D9</td></tr><tr><td>1X DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td>カルシウム、マグニジウムなし</td></tr><tr><td>6ウェル 超低アタッチメントプレート</td><td>コーニング</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト CD45-BV605</td><td>バイオレジェン</td>ド <td>304041</td><td>クローン:HI30</td></tr><tr><td>抗ヒト EGFR-FITC&nbsp;</td><td>GeneTex</td><td>GTX11400</td><td>クローン:ICR10</td></tr><tr><td>抗ヒトHER2-AF488&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>324410</td><td>クローン:24D2</td></tr><tr><td>抗マウスCD45-BV605</td>バイオ<td>レジェンド</td><td>103139</td><td>クローン:30-F11</td></tr><tr><td>BDバキュテイナーK2EDTA</td><td>BDヒト採血用</td><td>BD</td><td>366643</td></tr><tr><td>Cell Celector</td><td>ALS</td><td>CC1001</td><td>コアユニット&nbsp;</td></tr><tr><td>CellDソフトウェア</td><td>ALS</td><td></td><td>バージョン3.0</td></tr><tr><td>Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2</td><td>R&D Systems</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1.3 mL K3EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>41.3395.005</td><td>マウス採血</td></tr><tr><td>用 PCR チューブ</td><td>Corning</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>RLT Plus</td><td>Quiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase&nbsp;RNase阻害剤サー</td><td>モフィ</td><td>ッシャーAM2696</td><td>&nbsp;1 U/&micro;L&nbsp;</td></tr></tbody></table>

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

血液によって媒介される転移は、ほとんどの癌に関連した死亡と、遠隔地での新しい腫瘍の確立に成功している循環腫瘍細胞 (CTCs) を含む。CTCs は、単一細胞 (単一 CTCs) または多細胞集合体 (CTC クラスターおよび CTC-白血球クラスター) として患者の血流に見られ、後者はより高い転移性能力を示す。列挙型を超えて、表現型および分子分析は CTC 生物学を分析し、実用的な脆弱性を識別するために非常に重要です。ここでは、CTC 免疫染色およびマイクロマニピュレーションを含むワークフローの詳細な説明を提供し、 ex インビボ培養は、個々の細胞の増殖および生存能力を評価し、インビボ転移形成アッセイを行う。また、CTC クラスタを個々の細胞に解離させ、クラスタ内の異質性を調べるためのプロトコルも提供しています。これらのアプローチによって、例えば、CTC クラスター内の単一の CTCs と個々の細胞の生存と増殖の可能性を正確に定量化し、クラスター内の細胞が ex においてより良い生存と増殖を表示するという観察に導いた。 インビボ培養は単一 CTCs と比較した。全体として、単一細胞レベルで CTCs の特性を分析するためのプラットフォームを提供し、転移関連経路の同定と CTC 生物学のより良い理解を目指します。

提示されたワークフローは単一 CTCs からのか、または CTC クラスタから分けられる個々の CTCs の準備を可能にする。患者または腫瘍を含むマウスからの CTCs は、利用可能な CTC 濃縮法を用いて全血から濃縮され、次いで癌関連マーカー (例えば、EpCAM、緑色) および WBC 特異的マーカー (例えば CD45、赤色) に対する抗体で染色した (図1a).染色された CTC 製品をマイクロマニピュレーションステーションに移し、個々の細胞をピックアップし、PCR チューブまたはマルチウェルプレートに堆積させ、単一細胞配列決定を含む下流分析のために準備し、インビトロ培養またin vivoアッセイ (図 1b)。
この方法の信頼性は、手動のセルピッキング中の適切なターゲットセルの区別に基づ...

ここでは、循環腫瘍細胞 (CTCs) を特徴付ける表現型および分子的特徴を同定するための統合ワークフローを紹介する。単一およびクラスタ化された CTCs の生免疫染色とロボットマイクロマニピュレーションを、下流解析および転移播種能力の評価のための単一細胞ベースの技術と組み合わせています。

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

このプロトコルは、単一セル解像度で後続のダウンストリーム分析のために混合セルのプールから単一セルを検出および選択できるため、特に重要です。この技術の主な利点は、高純度を必要とする分析の範囲のために、個々の循環腫瘍細胞(またはCTC)を血液細胞から分離する可能性である。まず、マイクロマニピュレータソフトウェアを起動し、マイクロマニピュレータのスイッチを入れ替えます。マイクロマニピュレータをコンピュータに接続し、[接続とデバイスの初期化] をクリックして、顕微鏡ステージでロボットアームを初期化します。保護キャビネットの外部および内部表面をエタノールで洗浄し、機械を操作するたびに保護キャビネットを閉じて、コンピュータを介してデバイスを操作することができます。ロボットアームに新しい20〜30マイクロメートルのガラスキャピラリーを取り付け、システムオイルをシステムに通してチューブ内の気泡を取り除きます。殺菌槽1に70%エタノール、滅菌タンク2に無菌ヌクレアーゼフリー水、バッファタンクを無菌のDulbecco PBSで充填します。70%エタノールでキャピラリーを2回殺菌し、滅菌タンク1を殺菌タンク2に交換し、滅菌機能を利用してキャピラリーを水中で少なくとも3回洗浄する。マイクロマニピュレータソフトウェアで、新しい実験を開始し、自動選択モードと手動選択モードからピッキング実験の種類を選択します。滅菌タンク、バッファータンク、および堆積トレイの位置を指定するようにデッキトレイを設定し、選択した堆積トレイ内の液体タンクの温度を摂氏4度に設定します。マイクロマニピュレータキャビネット内の顕微鏡の下に、放出されたCTC溶液を含む超低い取り付けプレートを置きます。蓋をプレートから取り出し、キャビネットを閉じます。遠心分離機は、各ウェルの底部に分離し、プレートを選択した4°Cの1つの位置に置くように、1ウェルあたり20マイクロリットルのCTC培養培地を含む384ウェルプレートを置きます。手動でピッキングのための顕微鏡の目的と必要なすべてのチャネルの露出時間を選択します。[ウェル ナビゲーターを表示] を選択して、ピックアップ プレートのタイプを視覚化して選択します。次に、視野の中央に細胞を含まないCTC溶液を含むウェルの中央に集荷位置を較正する。センサーを使用して、プレートの底部に毛細管を軽く触り、プレートの底面の上方に0.05ミリメートルのピックアップ位置を設定します。毛細血管の損傷を避けるために、ロボットアームを一度に10マイクロメートルずつ慎重に下げます。セルタイプとピッキングパラメータを選択します。単一セルピッキングの場合は、手動モードを選択します。ジョイスティックを使用して、ウェル内のガラスキャピラリーをナビゲートし、ウェルボーダーから少なくとも1ミリメートル離れた関心のある単一のセルの上に毛細管を置きます。次に、手動でパーティクルを追加し、[アクティブなパーティクルを選択]を選択して、選択を開始します。すべての細胞が摘み取られたとき、遠心分離機は各ウェルの底にある細胞を沈着させるためにプレートを沈下させる。抗上皮細胞接着分子抗体によるバイオアミノ染色は、CD45陽性事象とは正確に区別して懸濁液中の癌細胞の可視化を可能にする。正確なCTC単離は、周囲の夾雑細胞を含まない所望の標的のみの吸引によって特徴付けられる。疑われるように、CTCクラスターは単一CTCと比較して生存率の増加を示し、インビトロ培養の56日以内に細胞コロニーを生じさせる。特に、CTCクラスターはまた、より高い増殖率を示し、したがって、より高い最終細胞数に達し、他の腫瘍細胞との直接接触が腫瘍細胞の生存率および増殖率の両方に影響を及ぼすことを示す。乳癌患者から直接分離されたCTCの単細胞RNAシーケンシングは、単一CTC、CTCクラスター、またはCTC白血球クラスターに由来する単一細胞のT分布確率的隣接を埋め込むT分布した確率的な隣人を明らかにする。マイクロマニピュレーターの流体システム内の気泡を除去し、効率的な単一セルピッキングを確実にするためにピックアップ位置を較正するために、ガラスキャピラリーを取り付けることを忘れないでください。単一セルは、シードまたは次世代のシーケンス処理のためにさらに処理することができ、単一細胞解像度での元生体解析とCTC特性評価を可能にして、転移プロセスを調査することができます。

micromanipulation-circulating-tumor-cells-for-downstream-molecular

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

循環腫瘍細胞は細胞のダメージを与えることなく癌患者の血液から分離されています。腫瘍細胞の単離は上皮マーカーに対する抗体に加えて、E-セレクチンの二分子表面を使用して行われます。ナノチューブのコーティングは、特に高い捕捉純度で得られた癌細胞の接着を促進する。...

患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離

循環腫瘍細胞(CTC)は、腫瘍の転移において重要な役割を果たすことが示されています。ここでは、肝細胞癌(HCC)転移の同系マウス腫瘍モデルの全血からCTCを単離および増殖する方法について説明する。...

マウス癌モデルからの循環腫瘍細胞の単離と伝播

本稿では、腫瘍の転移の動物モデルにおける肺腫瘍細胞蓄積を定量化する方法について説明します。...

肺腫瘍細胞募集試験

このプロトコルは、特定の目的の細胞タイプを分離するための、デスチオビオチン、ストレプトアビジン、およびAPTESシステムのカスタマイズ可能な表面機能化について説明しています。さらに、この原稿では、このプロセスのアプリケーション、最適化、および検証について説明します。...

ガラスの表面機能を介して、標的細胞の単離方法

プロトコルは、ポリ（N -iso-プロピル）効果的な捕獲、生存循環腫瘍細胞（CTC）の熱応答性放出のための（PIPAAm）コーティングされたマイクロフィルター提示さを利用します。この方法は、患者の血液と下流オフチップの文化のための実行可能なCTCの今後のリリースからのCTCの捕獲を可能に分析し、特性評価。...

キャプチャと血液から生存循環腫瘍細胞のリリース

本発明者らは、腫瘍細胞またはオルガノイドをマウスの盲腸に注入することによる同所性結腸直腸腫瘍の確立およびこのモデルからの循環腫瘍細胞（CTC）のその後の単離について記載する。...

結腸直腸癌モデルマウスにおける循環腫瘍細胞の単離

このプロトコルは、回復し、単一細胞レベルの分子遺伝学的解析の非対象の背景セルの混合物から珍しいターゲット セルを準備することです。DNA の品質は非処理の単一細胞であるし、により、単一セルに適用 (両方のスクリーニング...

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

これは、抑制剤または癌転移のドライバーをスクリーニングするための効果的な方法です。発現ライブラリーを用いて細胞を導入し、鶏絨毛管内膜血管構造中に注入して転移性コロニーを形成する。浸潤性の減少または増加を有するコロニーは、切除、拡張、再注入して表現型を確認し、最後に、ハイスループットシーケンシングを用いて分析する。...

迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見

CTCを培養することで、特定のマーカー発現をアッセリングし、薬剤耐性や肝臓を植民地化する能力を評価することによって、癌のより深い機能的特徴付けが可能になります。全体的に、CTC培養は、患者の転帰を改善するためのパーソナライズされた医療のための有望な臨床ツールである可能性があります。...

循環腫瘍細胞株:基礎的・翻訳的研究のための革新的なツール

ここでは、異種移植片を生成するためのヒントと腫瘍行動分析、全実装免疫蛍光、共焦点イメージング定量のためのガイドラインを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。...

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

マイクロ流体ベースのハイスループット循環腫瘍細胞選別およびシングルセルシーケンシング技術

学ぶ ロボットマイクロマニピュレーションを用いた循環腫瘍細胞（CTCs）の単細胞分離法。高純度で単細胞を選択し、転移性シード能の評価と次世代シーケンスによる分子解析を可能にする革新的ワークフローです。

下流の分子分析と転移性電位評価のための循環腫瘍細胞のマイクロマニピュレーション

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