Name: マウス精巣におけるタンパク質結合 RNA の効率的な同定のための拡張架橋免疫沈降 (eCLIP) 法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学ぶマウス精巣におけるeCLIP法を用いたRNA結合タンパク質の標的RNA同定手法。非放射性で効率的なこのプロトコルは、精子形成における転写後制御のメカニズム解明に貢献します。

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私たちは、元のプロトコルとの有用な指導のためのエリック L ヴァン Nostrand と遺伝子 W ヨに感謝します。K.Z. は、中国の国家キー R & D プログラム (2016YFA0500902、2018YFC1003500)、および中国の国家自然科学財団 (31771653) によって支持されました。L.Y. は、中国国家自然科学財団 (81471502、31871503) と江蘇省の革新的で起業的なプログラムによって支えられました。

<ol><li>Turner, J. M., Mahadevaiah, S. K., Ellis, P. J., Mitchell, M. J., Burgoyne, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pachytene+asynapsis+drives+meiotic+sex+chromosome+inactivation+and+leads+to+substantial+postmeiotic+repression+in+spermatids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Pachytene asynapsis drives meiotic sex chromosome inactivation and leads to substantial postmeiotic repression in spermatids.</a> Developmental Cell. 10 (4), 521-529 (2006).</li>
<li>Turner, J. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+sex+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Meiotic sex chromosome inactivation.</a> Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).</li>
<li>Kimmins, S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodelling+and+epigenetic+features+of+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells.</a> Nature. 434 (7033), 583-589 (2005).</li>
<li>Ule, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP+identifies+Nova-regulated+RNA+networks+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain.</a> Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).</li>
<li>Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLIP%3A+a+method+for+identifying+protein-RNA+interaction+sites+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CLIP: a method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells.</a> Methods. 37 (4), 376-386 (2005).</li>
<li>Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+right+RNA%3A+identification+of+cellular+mRNA+substrates+for+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins.</a> RNA. 5 (8), 1071-1082 (1999).</li>
<li>Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+mRNA+subsets+in+messenger+ribonucleoprotein+complexes+by+using+cDNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Acadamy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 97 (26), 14085-14090 (2000).</li>
<li>Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argonaute+HITS-CLIP+decodes+microRNA-mRNA+interaction+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.</a> Nature. 460 (7254), 479-486 (2009).</li>
<li>Zheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+MOV10L1+associates+with+Piwi+proteins+and+is+an+essential+component+of+the+Piwi-interacting+RNA+%28piRNA%29+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Acadamy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse MOV10L1 associates with Piwi proteins and is an essential component of the Piwi-interacting RNA (piRNA) pathway.</a> Proceedings of National Acadamy of Sciences U S A. 107 (26), 11841-11846 (2010).</li>
<li>Gregersen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+Is+a+5%27+to+3%27+RNA+helicase+contributing+to+UPF1+mRNA+target+degradation+by+translocation+along+3%27+UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs.</a> Molecular Cell. 54 (4), 573-585 (2014).</li>
<li>Banerjee, S., Neveu, P., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+coordinated+local+translational+control+point+at+the+synapse+involving+relief+from+silencing+and+MOV10+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A coordinated local translational control point at the synapse involving relief from silencing and MOV10 degradation.</a> Neuron. 64 (6), 871-884 (2009).</li>
<li>Choi, J., Hwang, S. Y., Ahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+RNASEH2+and+MOV10+controls+LINE-1+retrotransposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Interplay between RNASEH2 and MOV10 controls LINE-1 retrotransposition.</a> Nucleic Acids Research. 46 (4), 1912-1926 (2018).</li>
<li>Goodier, J. L., Cheung, L. E., Kazazian, H. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+RNA+helicase+is+a+potent+inhibitor+of+retrotransposition+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">MOV10 RNA helicase is a potent inhibitor of retrotransposition in cells.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1002941(2012).</li>
<li>Haussecker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capped+small+RNAs+and+MOV10+in+human+hepatitis+delta+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Capped small RNAs and MOV10 in human hepatitis delta virus replication.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 714-721 (2008).</li>
<li>Kenny, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOV10+and+FMRP+regulate+AGO2+association+with+microRNA+recognition+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements.</a> Cell Reports. 9 (5), 1729-1741 (2014).</li>
<li>Messaoudi-Aubert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+the+MOV10+RNA+helicase+in+Polycomb-mediated+repression+of+the+INK4a+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role for the MOV10 RNA helicase in Polycomb-mediated repression of the INK4a tumor suppressor.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 862-868 (2010).</li>
<li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).</li>
<li>Skariah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mov10+suppresses+retroelements+and+regulates+neuronal+development+and+function+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Mov10 suppresses retroelements and regulates neuronal development and function in the developing brain.</a> BMC Biology. 15 (1), 54(2017).</li>
<li>Zheng, K., Wang, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+pachytene+piRNA+biogenesis+reveals+a+novel+requirement+for+maintaining+post-meiotic+germline+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Blockade of pachytene piRNA biogenesis reveals a novel requirement for maintaining post-meiotic germline genome integrity.</a> PLoS Genetics. 8 (11), e1003038(2012).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+MOV10L1+binds+piRNA+precursors+to+initiate+piRNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing.</a> Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).</li>
<li>Hocq, R., Paternina, J., Alasseur, Q., Genovesio, A., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitored+eCLIP%3A+high+accuracy+mapping+of+RNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Monitored eCLIP: high accuracy mapping of RNA-protein interactions.</a> Nucleic Acids Research. 46 (21), 11553-11565 (2018).</li>
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<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
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<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP+reveals+the+function+of+hnRNP+particles+in+splicing+at+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142(2018).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24(2011).</li>
<li>Breunig, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Customizable+Protocol+for+String+Assembly+gRNA+Cloning+%28STAgR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR).</a> Journal of Visualized Experiments. (142), (2018).</li>
<li>Kuhn, R. M., Haussler, D., Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+genome+browser+and+associated+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The UCSC genome browser and associated tools.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 144-161 (2013).</li>
<li>Vourekas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mili+and+Miwi+target+RNA+repertoire+reveals+piRNA+biogenesis+and+function+of+Miwi+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mili and Miwi target RNA repertoire reveals piRNA biogenesis and function of Miwi in spermiogenesis.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (8), 773-781 (2012).</li>
<li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+is+an+RNA-binding+protein%2C+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li>
<li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+%28CLIP-Seq%29+for+mouse+Piwi+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li>
</ol>

作者は何も開示することはありません。

生物学的および病理上の文脈の両方で RBPs の普遍的な役割の理解が増すにつれて、クリップ法は RBPs20、32、33の分子機能を明らかにするために広く利用されてきた。 34、35。ここで説明するプロトコルは、マウスの精巣への eCLIP 方法の適応された適用を表す。
精巣で eCLIP を行う際の1つの課題は、新鮮な精巣細胞の生存性と完全性を維持することであり、これは効果的架橋にとっても重要である。緩い乳棒を使用して軽度の機械的力で精巣を剪断することは、細胞溶解32,36を防ぐことができる。RNA の適切な消化は、成功した eCLIP アッ...

哺乳類の精巣は、複雑な細胞分化プログラムが、多数の精子を生成するために周期的に動作する優れた発達モデルを表しています。このモデルのユニークな値は、精子形成の特定の段階での転写不活化の出現にあり、典型的に meiotic 性染色体不活性化 (MSCI) が1,2発生し、ラウンド spermatids が起こるときspermiogenesis3の間の抜本的核圧縮。これらの inconsecutive 転写イベントは、RNA 結合タンパク質 (RBPs) が重要な役割を果たし、トランスクリプトームを形成し、男性生殖能力を維持する転写後の遺伝子調節を必要とします。
インビボで個々の RBP の真正な RNA 標的を同定するために、架橋免疫沈降 (CLIP) 法が、通常の RNA 免疫沈降 (RIP) を超えて4,5を開発した、6、7、紫外線 (UV) 架橋を含む主要なステップの組み込みによって、シグナル特異性を改善するために厳しい洗浄およびゲル転送を行う。クリップの高度なアプリケーションと高スループットのシーケンシングは、ゲノム全体のレベル8におけるタンパク質-RNA 相互作用のプロファイリングに大きな関心を引き起こしました。RBP 機能に関する遺伝学的研究に加えて、内因性タンパク質と RNA の直接相互作用を同定する生化学的方法は、RBPs の RNA 調節役割を正確に解明するために不可欠である。例えば、MOV10L1 は、男性生殖能力および Piwi 相互作用 RNA (ピルナ) 生合成9に必要な精巣特異的 rna ヘリカーゼである。その paralogue MOV10 は、RNA 生物学の複数の局面における役割を持つ遍在発現および多機能性 RNA ヘリカーゼとして知られている10、11、12、13、14,15,16,17,18. 従来の CLIP seq を採用することにより、MOV10L1 が一次ピルナ前駆体を結合して調節し、初期ピルナ処理19,20を開始し、mRNA 3 ' UTRs と非ノンコーディング RNA を結合 MOV10 ことを発見しました。精巣生殖細胞における種 (データは示さず)。
それにもかかわらず、クリップは元々、クリップタグの著しい損失でライブラリの準備をシーケンスすることによって、面倒な放射性手順です。従来のクリップでは、両方の RNA 末端で連結されたアダプターを使用して、cDNA ライブラリを用意しています。タンパク質消化後、架橋短ポリペプチドは RNA フラグメントに付着したままである。この架橋マークは、cdna 合成時の逆転写酵素 (RTase) 進行を部分的にブロックし、cdna ライブラリ21,22の約 80% を表す切り捨てられた cDNAs をもたらす。これにより、架橋部位をバイパスする RTase (読み出し) に起因する cDNA フラグメントのみが配列される。最近では、パークリップ、iCLIP、eCLIP、uvCLAP などの様々なクリップアプローチが、生きている細胞の RBPs の架橋サイトを特定するために採用されています。パークリップは、365 nm の UV 放射線および photoactivatable ヌクレオチド類似体の適用を含み、したがって、培養中の生細胞に排他的であり、そして新たに合成された転写物へのヌクレオシド類似体の組み込みはバイアスを生じる傾向があるRNA がタンパク質23、24と物理的に相互作用するところ。ICLIP では、1つのアダプターだけが、3 ' 架橋 RNA フラグメントの端に連結されます。逆転写 (RT) の後、intramolecularly 環状化および再線形化によって、cDNAs およびリードスルーの両方によって得られ、次いでポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅25、26が続く。しかし、分子内環状化の効率は比較的低い。旧式のクリッププロトコルは、放射性同位体を用いた架橋 RNA の標識を必要とするが、紫外線架橋および親和性精製 (uvCLAP) は、厳しいタンデム親和性精製の過程で、放射能27に依存しない。それにもかかわらず、uvCLAP は、タンデム親和性精製のために 3x FLAG − HBH タグを担持した発現ベクターでトランスフェクトされなければならない培養細胞に限定される。
ECLIP では、アダプターは最初に 3 ' RNA の端に、その後に RT が、そして次に分子間モードで cDNAs の 3 ' の端でライゲーションされました。したがって、eCLIP は、すべての切り捨ておよび読み取りスルー cDNA28をキャプチャすることができます。また、単ヌクレオチド分解能を維持しながら、放射性標識に制限されず、またその原理に基づいて細胞株を使用することもない。
ここでは、マウスの精巣に適応した eCLIP プロトコルの手順を順を追って説明します。簡単に言うと、この eCLIP プロトコルは精巣細管の UV 架橋から始まり、続いてタンパク質特異的抗体を用いた部分 RNase 消化と免疫沈降が続きます。次に、タンパク質結合 RNA を dephosphorylated し、アダプターをその 3 ' 末端までライゲーションする。プロテインゲル電気泳動およびゲル間移動後、RNA は、予想されるサイズ範囲の膜面積を切断することによって分離されます。RT の後、DNA アダプタが cDNA の 3 ' 末端に続いて PCR 増幅される。ハイスループット・シーケンシングの前の subclones のスクリーニングは、ライブラリーの品質管理として行われます。このプロトコールは、RBPs のタンパク質結合 RNA の主要な種を同定するのに効率的であり、2つの精巣発現 RNA ヘリカーゼ MOV10L1 および MOV10 によって例示される。

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse MOV10&nbsp; 抗体</td><td>Proteintech, China</td><td>10370-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスMOV10L1抗体</td><td>Zheng et al.20109</td><td>polyclonal antisera UP2175</td><td>provided by P. Jeremy Wang lab, University of Pennsylvania</td></tr><tr><td>HRP Goat Anti-Rabbit IgG&nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG</td><td>Beyotime, China</td><td>A7016</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>Digital sonifier</td><td>BRANSON,USA</td><td>BBV12081048A</td><td>450 Watts; 50/60 Hz</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen,USA</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Miniブロットモジュール</td><td>Invitrogen,USA</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>Mini Gel Tank</td><td>Invitrogen,USA</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>振盪インキュベーター</td><td>エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ</td><td>Thermomixer comfort&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュグラインダー、Dounce</td><td>PYREX、米国</td><td>1234F35</td><td>のみ&nbsp; 「緩い」乳棒は、このプロトコル</td></tr><tr><td>TProfessional標準96勾配</td><td>Biometra、ドイツの</td><td>シリアル番号で使用されています:2604323</td><td></td></tr><tr><td>チューブリボルバー&nbsp;</td><td>クリスタル、米国</td><td>シリアル番号:3406051</td><td></td></tr><tr><td>UV光架橋剤</td><td>UVP、USA</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC処理されたカルチャーディ</td><td>ッシュコーニング、米国</td><td>430167</td><td>100 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>チューブ</td><td>コーニング、米国</td><td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>AXYGEN 、USA</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>試薬&nbsp;</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸性フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール&nbsp;</td><td>Solarbio, China</td><td>P1011</td><td>25:24:01</td></tr><tr><td>AffinityScript Enzyme</td><td>Agilent, USA</td><td>600107</td><td></td></tr><tr><td>Antioxidant</td><td>Invitrogen,USA</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; competent bacteria</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>18265017</td><td>これらの経済的な細胞は、>1 x 106 形質転換体/&micro;g 制御 DNA per 50 &micro;L反応。</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>Invitrogen, USA</td><td>10416014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>ECL reagent</td><td>Vazyme, China</td><td>E411-04</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA free protease inhibitor cocktail</td><td>Roche, USA</td><td>04693132001</td><td>add fresh</td></tr><tr><td>Exo-SAP-IT</td><td>Affymetrix, USA</td><td>78201</td><td>PCR Product Cleanup Reagent&nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP酵素</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>EF0652</td><td></td></tr><tr><td>LDS Sample Buffer</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MetaPhor Agarose&nbsp;</td><td>lonza, Switzerland</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>MiniElute gel Extraction</td><td>QIAGEN, Germany</td><td>28604</td><td>column store at 4 ?; buffer QG=gel dissolving buffer; buffer PE= wash buffer(for step 14)</td></tr><tr><td>MyONE Silane beads</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>37002D</td><td>nucleic acids extraction magnetic beads</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen,USA</td><td>AM9759 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco, USA</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris Protein Gels</td><td>Invitrogen, USA</td><td></td><td>NP0336BOX 4%&ndash;12%、1.5 mm、15ウェル</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS バッファーキット&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>NP0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phase-Locked Gel (PLG) heavy tube&nbsp;&nbsp;</td><td>中国、天元</td><td>WM5-2302831</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems, USA</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB, New England&nbsp;</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 PCR マスターミックス&nbsp;</td><td>NEB、ニューイングランド&nbsp;</td><td>M0492L</td><td></td></tr><tr><td>RLT緩衝液</td><td>QIAGEN, ドイツ</td><td>79216</td><td>RNA精製溶解緩衝液&nbsp;</td></tr><tr><td>RNAクリーン&コンセントレータ-5カラム&nbsp;</td><td>ZYMO RESEARCH, US</td><td>R1016</td><td>RNA 精製および濃縮カラム</td></tr><tr><td>RNase I&nbsp;</td><td>Invitrogen, USA</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Promega, USA</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNase</td><td>Promega, USA</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Sample Reducing Agent</td><td>Invitrogen,USA</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>SDS Solution</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15553027</td><td>10%</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>30970</td><td>protect fromライト</td></tr><tr><td>T4 PNK酵素</td><td>NEB、ニューイングランド&nbsp;</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA リガーゼ 1 高濃度</td><td>NEB, ニューイングランド&nbsp;</td><td>M0437M</td><td></td></tr><tr><td>TA/Blunt-Zero Cloning Mix</td><td>Vazyme, China</td><td>C601-01</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen,USA</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCI Buffer</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600198&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>X-ray Films</td><td>Caresteam, Canada</td><td>6535876</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス精巣におけるタンパク質結合 rna の効率的な同定のための拡張架橋免疫沈降 (eclip) 法

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

精子形成は、哺乳動物における男性生殖細胞分化の高度に順序付けられたプロセスを定義する。精巣では、転写および翻訳はクロッピングであり、RBPs によって組織化された遺伝子発現の転写後調節の重要性を強調している。RBP の機械的役割を解明するために、架橋免疫沈降 (CLIP) 法を用いて内因性の直接 RNA 標的を捕捉し、実際の相互作用部位を定義することができます。拡張クリップ (eCLIP) は、従来のクリップよりもいくつかの利点を提供する新たに開発された方法です。しかし、eCLIP の使用は、これまでのところ、拡張されたアプリケーションを呼び、細胞株に限定してきました。ここでは eCLIP を用いて、マウスの精巣における2つの既知の RNA 結合ヘリカーゼの MOV10 と MOV10L1 を研究した。予想通り、MOV10 は主に 3 ' 非翻訳領域 (UTRs) の mRNA に結合し、MOV10L1 は Piwi 相互作用 RNA (ピルナ) 前駆体転写物に選択的に結合することがわかった。私たちの eCLIP 法は、ディープシーケンシングを進めるための令状として、subclones の小規模なシーケンシングと、資格のあるライブラリの可用性を介して、様々な RBPs に縛られた主要な RNA 種を迅速に決定することができます。この研究は、哺乳類の精巣における eCLIP の適切な基礎を確立する。

ECLIP の手順と結果を図1、図 2、図 3、図 4に示します。マウスを、手術用ハサミを用いて下腹部に二酸化炭素と小切開で安楽死させた (図 2a、B)。マウスの精巣を除去し、detunicated した後、粉砕後に UV 架橋した (図 2c−I)。精巣組織において2つの既知の RNA 結合ヘリカーゼを使用した eCLIP の代表的な結果を<str...

ここでは、精巣での RBP 候補の主要な RNA 標的を決定するための eCLIP プロトコルを紹介する。

マウス精巣におけるタンパク質結合 RNA の効率的な同定のための拡張架橋免疫沈降 (eCLIP) 法

Spermatogenesis defines a highly ordered process of male germ cell differentiation in mammals. In testis, transcription and translation are uncoupled, ...

RNA結合タンパク質は細胞生理学に不可欠です。重要なことに、RBPは精子形成を通じて高発現しており、生殖細胞のすべての段階で重要な転写後調節因子として十分に文書化されている。結合ターゲットの同定は、RBPの機械的役割を解明するために重要である。このプロトコルは、内因性直接RNA標的を捕捉するためのeCLIP法の適応的な適用を表し、哺乳動物の精巣におけるeCLIPの適用可能な基礎を確立する。この方法の主な利点は、非放射性で、時間の負担が少なく、サイズに一致する入力が本物のターゲットの適切な背景となるため、より強い信号対雑音比を提供することです。最後に、サブクローンの小規模なシーケンシングは、深いシーケンスに従う上で有用であると考えます。手順をデモンストレーションするのは、私の同僚の徐気です。この手順を開始するには、各免疫沈降実験に適した年齢のマウスから約100ミリグラムの精巣を収穫する。氷冷PBSに組織を入れる。細かいピンセットを使用して、チュニカアルブギネアを静かに取り除きます。ティッシュグラインダーに氷冷PBSの3ミリリットルを加え、緩いガラスの害虫を使用して、軽度の機械的力で組織を三分性にします。次に、組織懸濁液を細胞培養皿に移し、氷冷PBSを最大6ミリリットルまで加える。液体が皿の底を均等に覆うように、プレートを素早く振ります。254ナノメートルで400ミリジュール/センチメートルで氷の上に懸濁液を3回架橋します。各照射の間に懸濁液を混ぜるようにしてください。次いで、15ミリリットルの円錐管に懸濁液を回収し、遠心分離機を1,200回g、4度で5分間回収する。上清を取り除き、PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁する。この後、懸濁液を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。1,000倍gで遠心分離機、摂氏4度で2分間、上清を捨てます。まず、新鮮な遠心分離管にサンプルあたり125マイクロリットルのタンパク質A磁気ビーズを加えます。マグネットの上にチューブを置き、ビーズを溶液から分離します。10秒後、上清を取り除き、1ミリリットルの氷冷ライシスバッファーでビーズを2回洗います。10マイクログラムのeCLIP抗体を用いて、100マイクロリットルの冷たいリシスバッファーでビーズを再懸濁させます。室温でチューブを45分間回転させます。その後、1ミリリットルの氷冷ライシスバッファーでビーズを2回洗います。まず、50倍のEDTAフリータンパク質阻害剤カクテルの22マイクロリットルとRNase阻害剤の11マイクロリットルを含む冷たいリシスバッファーの1ミリリットルの組織ペレットを再中断します。氷の上でサンプルを15分間氷上でくすみ続けます。テキスト プロトコルで説明されているように、各サンプルを超音波処理します。次に、各チューブに4マイクロリットルのDNaseを加え、よく混ぜます。1,200rpmで振りながら摂氏37度で10分間インキュベートします。その後、10マイクロリットルの希釈RNaseを加え、よく混ぜます。1,200rpmで振りながら5分間摂氏37度でインキュベートします。次いで、15,000倍gで遠心分離機を、摂氏4度で20分間、リセートをクリアする。上清を慎重に収集し、RWBおよびRRIサンプルの入力サンプルを保存します。まず、調製したビーズに1ミリリットルのライセートを加え、サンプルを摂氏4度で2時間または一晩回転させます。その後、磁気スタンドでビーズを回収し、上清を捨てます。900マイクロリットルの高塩バッファーでビーズを2回洗い、900マイクロリットルの洗浄バッファーでビーズを2回洗います。次いで、1x脱リン酸化バッファーの500マイクロリットルでビーズを1回洗浄します。まず、上清を捨て、細かいピペットチップを使用して残留液を除去します。各サンプルに3素子ライゲーションマスターミックスの25マイクロリットルを加え、慎重にピペットを混合します。各サンプルに2.5マイクロリットルのRNAアダプターX1Aと2.5マイクロリットルのRNAアダプタX1Bを加えます。ピペットやフリックで慎重に混ぜます。摂氏25度で75分間インキュベートし、チューブをフリックして10分ごとに混ぜるようにします。500マイクロリットルのコールドウォッシュバッファーでビーズを1回洗います。次に、500マイクロリットルの冷たい高塩バッファーでビーズを1回洗い、次に500マイクロリットルのコールドウォッシュバッファーで洗浄します。これらの両方のをもう一度繰り返します。ビーズを磁気的に分離し、細かいピペットチップを使用して残留液を除去します。100マイクロリットルの冷たい洗浄バッファーにビーズを再懸濁し、RWBサンプルとして20マイクロリットルを新しいチューブに移動します。残りのサンプルに、7.5マイクロリットルの4x LDSサンプルバッファーと10倍サンプル還元剤の3マイクロリットルを加えます。1,200rpmで振りながら摂氏70度で10分間インキュベートします。この後、氷の上でサンプルを1分間冷却し、遠心分離機を1,000倍g、摂氏4度で1分間冷却します。RWBゲルの場合は、チューブを磁石の上に置き、ビーズから溶出したタンパク質を分離します。各ウェルに15マイクロリットルのサンプルを積み込みます。次に、500マイクロリットルの抗酸化物質を1x SDSランニングバッファの500ミリリットルに加えます。ゲルを200ボルト、1x SDSランニングバッファで50分間、または染料フロントが底部になるまで実行します。10%メタノールを用いた1x転写バッファーで、ゲルからニトロセルロース膜に10ボルトで70分間タンパク質RNA複合体を移す。室温で5%乳のRWB膜を1時間ブロックします。TBSTで膜をリンスし、摂氏4度で一次抗体を一晩TBSTでインキュベートする。この後、TBSTで2回洗い、各洗浄は5分間続きます。TBSTで2次抗体を室温で1時間インキュベートする。その後、膜をTBSTで3回洗浄します。次に、ECLバッファーAとバッファBの等量を混合し、膜にこの混合物を追加し、1分間インキュベートします。膜をラップで覆い、室温でX線フィルムに2〜3分間露出してから、膜を現像します。本研究では、架橋されたライセートを処理するRNase Iを有する成体野生型マウスの精巣におけるMOV10 eCLIPが、約114キロダルトンである標的タンパク質を濃縮する。cDNAを様々なサンプルから1~10まで希釈したqPCRの結果は、非架橋サンプルがRNA回収の減少を示すことを明らかにした。非架橋群のCt値は、一般にUV架橋群の5倍以上である。アガロースゲル電気泳動によるPCR増幅およびサイズ選択の代表的な結果を以下に示す。プライマーダイマー製品は約140塩基対で現れる。2つの代表的なサブクローン配列のUCSCゲノムブラウザビューは、MOV10結合eCLIPタグがFto遺伝子の3素数UTR内に位置することが示されています。3素数UTRターゲットの概算率は75%を占め、HEK293細胞および精巣におけるMOV10標的の大部分と一致している。対照的に、MOV10L1結合eCLIPタグはpiRNAクラスタ内に位置することが判明し、MOV10L1標的はpiRNA前駆体を標的としている。piRNA前駆体標的の概算率は、以前の研究からの傾向を反映する42%を占める。40単位/ミリリットル RNase I 消化を伴う MOV10L1 eCLIP は、20 塩基対未満の比較的多くの配列を生成します。ここで説明するこのプロトコルは、再生におけるeCLIP法の採用を表し、RNA-RBP相互作用の知識がむしろ不十分である領域である。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

転写でRNA結合蛋白質の空間配置は、転写後調節の重要な決定要因である。したがって、我々は、RNA結合タンパク質の結合部位の正確なゲノムワイドなマッピングを可能にする個々のヌクレオチドの解像度のUV架橋及び免疫沈降（iCLIP）を開発。...

iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

RIP-チップを介したRNA関連した複合体を単離および同定するためのステップバイステップのプロトコル。...

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

このビデオは、マウス精巣のRNA結合タンパク質を同定するための強化された架橋免疫沈降法(eCLIP)を実演しています。eCLIPは、RNA結合タンパク質(RBP)が標的RNAと相互作用する結合部位の正確な同定を可能にします。...

マウス精巣におけるタンパク質結合RNAの効率的な同定のための強化された架橋免疫沈降法

この原稿は、特定のオリゴヌクレオチド指向濃縮を介して真核細胞で形成された選択された同族RNPを単離するアプローチを説明しています。DHX9/RNAヘリカーゼAで構成されるレトロウイルス5'非翻訳領域に結合した同族RNPを単離することにより、このアプローチの適用性を実証します。...

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

RNA 結合蛋白質を識別し、紫外線による光架橋と質量分析法を用いた生細胞におけるその RNA...

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

内生的に形成された mRNA 蛋白質複合体の回復のためのタンデムの RNA 分離手順 (旅行) を説明します。具体的には、RNA 蛋白質の複合体は、生体内で架橋 polyadenylated Rna ランダムプライマー ビーズ抽出物から分離された、特定の Mrna が変更された RNA アンチセンス オリゴヌクレオチドでキャプチャされます。イムノブロット解析による蛋白質の Mrna...

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

ここでは、哺乳動物細胞由来のRNA:タンパク質(RNP)複合体の内因性RNA結合部位または「フットプリント」を濃縮するプロトコルを提示する。このアプローチは、RNPサブユニットの2つの免疫沈殿を伴い、したがって、並行してRNA免疫沈殿(RIPiT)と呼ばれています。...

ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq)

ここでは、哺乳類細胞におけるRNA結合タンパク質(RRB)のRNA標的を決定するために、フラグビオチンタンデム精製を用いて...

FLAG-ビオチンタンデム精製による架橋と免疫沈降によるタンパク質RNA相互作用のトランスクリプトーム全体プロファイリング

ここでは、リボタグシステムを用いた成人男性マウス生殖細胞の選択集団からリボソームおよび関連RNAの免疫沈降について説明する。戦略的な繁殖と慎重な免疫沈降は、細菌細胞の翻訳を知らせ、変異型のメカニズムに関する洞察を提供するクリーンで再現可能な結果をもたらします。...

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

ここでは、ヒト細胞からの総タンパク質抽出物、ビオチン化RNAでコーティングされたストレプトアビジンビーズ、および質量分析を使用して、特定のRNA配列のタンパク質相互作用因子を発見、定量、および検証するための最適化された in vitro メソッドを紹介します。...

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

LNNa-タンパク質の直接的な相互作用を特定するためのUVベースのChIRP法。...

LncRNAと直接相互作用するタンパク質の検証可能な同定のためのUVベースのChIRP法:培養細胞からマウス精巣まで

学ぶマウス精巣におけるeCLIP法を用いたRNA結合タンパク質の標的RNA同定手法。非放射性で効率的なこのプロトコルは、精子形成における転写後制御のメカニズム解明に貢献します。

マウス精巣におけるタンパク質結合 RNA の効率的な同定のための拡張架橋免疫沈降 (eCLIP) 法

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