免疫組織化学用マウスレチンクライオ切片の調製
July 1st, 2019
本報告では、免疫組織化学(IHC)のための凍結マウス網膜切片を準備するための包括的な方法について説明する。 記載された方法は、眼後カップの解剖、パラホルムアルデヒド固定、最適切断温度(OCT)培媒体および組織配向への埋め込み、断断および免疫染色を含む。
マウスの裂肛は、目の大きさと形と、眼の部分の脆弱性のために、本当に繊細なプロセスです。効率的な方法とヒントを提供する詳細なプロトコルを持つことは、高品質のレティナル解剖とセクションの鍵です。研究者が共通の落とし穴を避け、免疫検査に適した高品質のレチナルセクションを得るのを助けるヒントとアドバイスを提供します。
尾のコーテアライザーを使用して安楽死させたマウスの目の一時的な部分を非常に軽く触れ、角膜をわずかに燃やして穴を開けるのを避けるために1秒以下の部分をマークします。その直後に湾曲したデュモン545鉗子を使用してマウスの目を核とした。4%PFAとPBSの1ミリリットルの1.5ミリリットルのクライオチューブに目を入れ、氷の上で15分間インキュベートします。
次に、曲面デュモン545鉗子を用いて固定眼を、PBSで満たされた改変された35ミリメートルの解剖皿に移し、解剖顕微鏡の下に置く。マイクロナイフを使用して、角膜の縁端のすぐ上と垂直なバーマークで小さな切開を行います。湾曲したはさみを切開に挿入し、手足に続く角膜の周回カットを行います。
次に、薄いデュモン5鉗子を使用して、角膜を取り除き、レンズを抽出し、目の後部から繊細に離れて持ち上げます。ガラス体はレンズで出てきますし、後眼球の内側を覆う白い表面として、レチナが見えます。分離したアイカップをPBSの1ミリリットルで室温で10分間2回洗います。
アイカップを凍結保護するには、15%のスクロースとPBSで一晩4度で平らにし、沈みます。その後、アイカップを30%スクロースに移し、2〜3時間PBSに移して沈みます。埋め込み用の10ミリメートルのクライオモールドで10月にアイカップを置きます。
解剖顕微鏡の下で、火傷マークが上になるまで目を回転させることによって、その側側腹側軸に沿ってクライオモールドの眼を向けます。視神経は左の1つであり、カビの切り取られた部分は右に向いています。残存組織を凍結するには、イソペンタンを含む金属ビーカーに少なくとも5分間クライオモールドを浸し、ビーカーをビーカーの高さの3分の1まで液体窒素に入れます。
冷凍ブロックを取り外し、アルミホイルで包み、マイナス80度で保管します。ペンまたはシャーピーを使用して、フリーズしたブロックに印を付け、その向きを記録します。クライオスタット温度をマイナス20度からマイナス25度の間で調整した後、埋め込まれたアイカップを含む金型を内部に入れ、クライオスタット温度に1時間平衡化できるようにします。
側腹側の方向を持つクライオスタットにブロックを取り付け、10マイクロメートル厚いシリアルセクションの切断を開始します。注意深く、注意して、注意して、番号付きの顕微鏡スライドにレチンのセクションを置き、免疫染色の準備ができるまでマイナス20°Cまたはマイナス80°Cでスライドボックスに保存します。ロドプシンに対する抗体を用いた免疫組織化学、感光体マーカー、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65、アマカリヌ細胞マーカー、グルタミン合成酵素およびミュラー細胞マーカー、およびカルビンビンジン、水平細胞マーカーを、残膜切片に対して行った。
この結果は、このプロトコルが異なるプロトコルから得られた低品質のレティナルセクションとは異なり、高品質でよく保存されたレチンのセクションを生み出していることを示しています。ロドプシンの豊富な内側および外側のセグメントは、網膜色素上皮の上に置かからほとんどまたは全く分離されずに垂直および無傷のままである。Gad65陽性アマトリン細胞などのインターニューロンは、内部核層および内膜神経膜層内で適切に階層化されたままである。
また、Muller細胞は、神経節細胞層から外核層に及ぶ細胞質プロセスにおいて適切に整列した相馬でよく保存されたままである。さらに、明確に定義された水平細胞は、内部核層および外型プレキシフォーム層境界で検出可能である。目のトッパー領域をマークし、埋め込み時に向きを維持することが重要です。
常に適切な個人用保護具でフードの下にパラホルムアルデヒドを準備します。
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概要
この報告書は、凍結マウス網膜切片の免疫組織化学（IHC）の準備方法を詳細に説明し、眼球解剖、固定、および切片などの技術に焦点を当てています。概説されたプロトコルは、網膜構造の詳細な免疫染色に適した高品質のサンプルを生成することを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 組織学
- 免疫組織化学
背景
- 網膜は視覚に不可欠であり、その細胞構造の理解は様々な研究分野にとって重要です。
- 高品質の網膜切片は、正確な免疫組織化学的分析に不可欠です。
- 網膜の脆弱性により、損傷を防ぐために慎重な解剖と取り扱いが必要です。
- 既存のプロトコルでは品質の悪いサンプルが得られる可能性があり、改善が必要です。
研究の目的
- IHCのためのマウス網膜の切片と準備のための効率的で詳細な方法を開発すること。
- 網膜構造の保存を確保し、正確な免疫染色を容易にすること。
- 網膜解剖における一般的な落とし穴について明確なガイダンスを提供すること。
使用された方法
- 方法には、マウスの眼からの眼球後部カップの解剖と、パラホルムアルデヒドによる固定が含まれます。
- 網膜はOCT媒体に埋め込んで切片化し、適切な方向性と品質を確保します。
- 主要なステップには、サンプルの眼をショ糖溶液で平衡させ、凍結前に慎重な凍結保護を含みます。
- 10マイクロメートルの厚さの切片をクライオスタットを使用して切り取り、免疫染色の準備を行います。
主要な結果
- このプロトコルは、主要な細胞構造を保存した良好に保存された網膜切片を生成します。
- 免疫染色の結果は、光受容体マーカーが完全で、網膜細胞層が適切に層化していることを示します。
- 高品質の切片により、網膜細胞とその機能の詳細な分析が可能になります。
- この方法と以前に報告された技術との間で結果の違いが強調されています。
結論
- この研究は、神経科学における細胞分析に不可欠なIHCのための高品質の凍結網膜切片を生成するための価値ある技術を提供します。
- 詳細なプロトコルは、様々な条件下での網膜構造と機能の理解を深めます。
- 改良された技術は、網膜研究と潜在的な疾病モデルでのより良い結果につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-fidelity tissue preparation is essential for reliable immunohistochemical analysis in retinal disease research, where structural preservation directly impacts data reproducibility and target validation confidence. This protocol addresses a critical bottleneck in preclinical neuroscience workflows by enabling consistent section quality that supports mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. By minimizing epitope masking and preserving cytoarchitecture, the method enhances predictive value in early discovery stages involving retinal pathophysiology models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of retinal cell-type-specific markers to validate therapeutic targets in neurodegeneration models.
- Operational Value: Reduces variability in immunostaining outcomes by preserving epitope accessibility and tissue integrity.
- Predictive Value: Supports confident target engagement assessment through preserved subcellular localization of markers like rhodopsin and calbindin.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces serial cryosections suitable for multiplex IHC panels to evaluate compound effects on retinal stratification.
- Reproducibility: Standardized fixation and cryoprotection steps minimize batch-to-batch variation in section quality.
- Scalability: Protocol supports processing of multiple ocular posterior cups for high-content screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maintains laminar structure critical for modeling retinal degeneration and assessing neuroprotective candidates.
- Translational Continuity: Enables side-by-side comparison of wild-type and disease-model retinas under identical processing conditions.
- Risk Mitigation: Reduces false-negative IHC results due to epitope masking, improving confidence in preclinical go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through preclinical validation, where reliable tissue sectioning enables downstream immunohistochemical readouts essential for pathway analysis and biomarker evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of retinal cell layers and synaptic layers using layer-specific markers.
- Screening: Generates quantitative IHC-ready sections for assessing compound-induced changes in cell survival or stratification.
- Analytics: Enables morphometric analysis of retinal thickness, layer integrity, and marker co-localization for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by preserving epitopes of cell-type-specific proteins relevant to retinal function.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized tissue preparation module applicable across multiple retinal target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by preserving native epitope-antibody interactions critical for specific detection.
- Operational Value: Improves sectioning yield and reduces tissue loss through optimized cryoprotection and embedding orientation.
- Strategic Value: Increases throughput of reliable IHC data, accelerating lead identification in retinal therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reproducible histological outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and cryostat sectioning techniques.
- Dependent on access to cryostat, isopentane, liquid nitrogen, and OCT-compatible molds.
- Necessitates standardized timing for sucrose equilibration to ensure consistent cryoprotection.
- Requires training to maintain dorsal-ventral orientation during embedding for reproducible sectioning.
- Limited by post-fixation tissue fragility, necessitating careful handling during transfer and mounting steps.
