Name: 末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学ぶ末梢血単核細胞から誘導神経幹細胞を生成し、ドーパミン作動性ニューロン前駆体へ分化させる方法。パーキンソン病治療への応用と移植後の運動機能改善効果を評価する再生医療技術です。

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この研究は、幹細胞と翻訳国家キープロジェクト(2016YFA0101403)、中国国立自然科学財団(81661130160、81422014、81561138004)、北京市自然科学財団(5142005)の助成金によって支援されました。北京タレント財団(201700021223TD03)、第13次5カ年計画(CIT&TCD20180333)、北京医療システムハイレベル人材賞(2015-3-063)の北京市立大学の高レベル教師支援プロジェクト市保健委員会基金(PXM 2018_026283_000002)、北京100、千、1万人の人材基金(2018A03)、北京市病院行政特別資金支援(ZYLX201706)、ロイヤル・ソサエティ・ニュートン・アドバンスト・フェローシップ(NA150482)。

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<li>Ma, T., Xie, M., Laurent, T., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+the+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Progress in the reprogramming of somatic cells.</a> Circulation Research. 112 (3), 562-574 (2013).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+adult+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+into+induced+neural+stem+cell+by+using+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Conversion of adult human peripheral blood mononuclear cells into induced neural stem cell by using episomal vectors.</a> Stem Cell Research. 16 (2), 236-242 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+precursors+differentiated+from+human+blood-derived+induced+neural+stem+cells+improve+symptoms+of+a+mouse+Parkinson%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic precursors differentiated from human blood-derived induced neural stem cells improve symptoms of a mouse Parkinson's disease model.</a> Theranostics. 8 (17), 4679-4694 (2018).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
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<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).</li>
<li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nature Protocols. 7 (4), 718-728 (2012).</li>
<li>Bazley, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Reprogramming+of+Human+Primordial+Germ+Cells+into+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Efficient+Generation+of+Genetically+Engineered+Germ+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Direct Reprogramming of Human Primordial Germ Cells into Induced Pluripotent Stem Cells: Efficient Generation of Genetically Engineered Germ Cells.</a> Stem Cells and Development. 24 (22), 2634-2648 (2015).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> Journal of Virology. 74 (14), 6564-6569 (2000).</li>
<li>Sochacki, J., Devalle, S., Reis, M., Mattos, P., Rehen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+urine+iPS+cell+lines+from+patients+with+Attention+Deficit+Hyperactivity+Disorder+%28ADHD%29+using+a+non-integrative+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of urine iPS cell lines from patients with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD) using a non-integrative method.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 102-106 (2016).</li>
<li>Ban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14234-14239 (2011).</li>
<li>Cho, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (9), 3392-3397 (2008).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. -K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7 (11), 2013-2021 (2012).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+primary+somatic+cells+by+OCT4+and+chemical+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human primary somatic cells by OCT4 and chemical compounds.</a> Cell Stem Cell. 7 (6), 651-655 (2010).</li>
<li>Ono, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+neurogenic+potential+in+floor+plate+cells+along+an+anteroposterior+location%3A+midbrain+dopaminergic+neurons+originate+from+mesencephalic+floor+plate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells.</a> Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).</li>
<li>Kirkeby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+regionally+specified+neural+progenitors+and+functional+neurons+from+human+embryonic+stem+cells+under+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions.</a> Cell Reports. 1 (6), 703-714 (2012).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Fasano, C. A., Chambers, S. M., Lee, G., Tomishima, M. J., Studer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+functional+floor+plate+tissue+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 6 (4), 336-347 (2010).</li>
<li>Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rodent+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochirurgica+Supplements%22%5BJournal%5D)">Transgenic rodent models of Parkinson's disease.</a> Acta Neurochirurgica Supplements. 101, 89-92 (2008).</li>
<li>Sheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dopaminergic+neurons+directly+from+mouse+fibroblasts+and+fibroblast-derived+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of dopaminergic neurons directly from mouse fibroblasts and fibroblast-derived neural progenitors.</a> Cell Research. 22 (4), 769-772 (2012).</li>
<li>Prasad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+induced+pluripotent+stem+cell%2C+direct+conversion+by+trans-differentiation%2C+direct+reprogramming+and+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">A review of induced pluripotent stem cell, direct conversion by trans-differentiation, direct reprogramming and oligodendrocyte differentiation.</a> Regenerative Medicine. 11 (2), 181-191 (2016).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、PDモデルに対するiNSC-DA細胞療法の異なる段階をカバーするプロトコルを紹介した。このプロトコルの重要な側面は、(1)PBMNCの単離と拡大、SeV感染によるiNSCへのPBNCのリプログラミング、(2)INSCとDAニューロンの分化、(3)一方的な6-OHDA病変PDマウスモデルと行動の確立DA前駆体の細胞移植および行動評価
このプロトコルでは、最初の部分は、優先的にエリスロブラストを拡張し、リンパ球増殖をサポートしない血清フリー培地(MNC培地)でPBNCを収集し、拡大することを含む。以前の研究では、いくつかの体細胞タイプは、iPSCまたはiNSC12、13、14に再プログラムされています。他のタイプの体細胞と比較して、PBMNCにはいくつかの利点があります。最も重要な利点は、彼らの有利な遺伝子発現パターンおよびエピジェネティックプロファイルである。PBMNCは生体内で短命であり...

パーキンソン病(PD)は、視室メゼンサロン(VM)におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる一般的な神経変性疾患であり、60歳以上の人口で1%以上の有病率を有する。1,2.過去10年間にわたり、細胞療法は、変性または損傷した細胞を置き換えるか、または変性ニューロンの周りの微小環境に栄養を与えることを目的とし、PD3の治療における可能性を示している。一方、リプログラミング技術は、補充療法のための有望な細胞源を提供する4、大きな進歩を遂げました。ヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)と胚性幹細胞(ESC)は、ラットおよび非ヒト霊長類PDモデルに移植すると、生き残り、母性、運動機能を改善することができるDA神経細胞に分化できることが証明されている5 ,6,7,8.iPSCは細胞リプログラミング技術のマイルストーンであり、細胞移植の大きな可能性を秘めています。しかし、不完全に分化した細胞からの腫瘍形成のリスクについては、依然として懸念がある。細胞移植のための代替細胞源は、不安定な中間体から導き出すことができる誘導神経幹細胞(iNSC)などの直接リプログラミングを通じて得られた系統コミット成人幹細胞であり、多能性をバイパスするステージ9,10,11.
iPSCとiNsCの両方は、線維芽細胞、末梢血単核細胞(PBMcNC)および様々な他のタイプの細胞12、13、14などの自家細胞源から再プログラムすることができ、したがって、移植細胞の免疫原性を大いに高める。さらに、iPSCと比較して、iNSCは腫瘍形成および系統コミット可塑性のリスクが減少し、ニューロンおよびグリア11に区別することができるだけである。初期研究では、ヒトまたはマウスのiPSCおよびiNSCは、侵襲的処置14、15である皮膚生検から得られた線維芽細胞から生成された。これに関して、PBMNCは、侵襲性の低いサンプリングプロセスのため魅力的なスターター細胞源であり、拡張時間16の短い期間内に多数の細胞を得ることが容易である。初期のリプログラミング研究では、レンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどの統合デリバリーシステムを採用し、多くのタイプの細胞で効率的かつ簡単に実装できます17;しかしながら、これらの送達システムは、残留トランスジーンの変異および再活性化を引き起こす可能性があり、これは臨床治療目的12の安全性問題を提示する。センダイウイルス(SeV)は、宿主ゲノムに統合されない負感のある一本鎖ゲノムを持つ非統合型RNAウイルスであるが、感染細胞の細胞質中にのみ複製し、リプログラミングのための効率的で安全な手段を提供する18 、19.組換えSeVベクトルは、オープンリーディングフレームにヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む再プログラミング因子を含む利用可能です。 さらに、SeVウイルスベクターは、温度感受性変異を導入することによってさらに改善することができ、培養温度が39°C20に上昇したときに迅速に除去することができる。この記事では、SeV システムを使用して PBMC を iNsC に再プログラムするプロトコルについて説明します。
多くの研究は、様々な方法を使用してヒトESCまたはiPSCからDAニューロンの誘導を報告しています 6,8,21.しかし、iNSCからのDAニューロンの分化を詳細に説明するプロトコルが不足しています。このプロトコルでは、2段階法を用いてiNSCからのDAニューロンの効率的な生成について述べた。DAニューロン前駆体は、安全性および有効性評価のためのPDマウスモデルの線条体に移植することができる。本稿では、仙台ウイルスによる誘導神経幹細胞の生成、DAニューロンへのiNSCの分化、マウスPDモデルの確立、DA前駆体の線条体への移植まで、様々な段階をカバーする詳細なプロトコルを紹介する。PDモデルの。このプロトコルを使用して、患者や健康なドナーからiNSCを生成し、細胞移植の目的のために安全、標準化、スケーラブルで均質なDAニューロンを導き出したり、皿の中でPDをモデル化したり、メカニズムの調査を行うことができます。根本的な病気の発症と発症。

<table><tbody><tr><td>15 mlコニカルチューブ</td><td>コーニング</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>1-チオグリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td>吸入および皮膚接触に有毒</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3337</td><td></td></tr><tr><td>50 mlコニカルチューブ&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>6-OHDA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4381</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>A11105-01</td><td>細胞解離試薬</td></tr><tr><td>アポモルヒネ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4393</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A92902</td><td>皮膚に接触すると毒性&nbsp;</td></tr><tr><td>B27サプリメント&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>脳由来神経栄養因子</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウムを含む採血管</td><td>BD</td><td>367871</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>yisheng</td><td>36106es60</td><td>ウシ胎児血清</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>ジブチリラデノシン環状一リン酸</td></tr><tr><td>CellBanker 2</td><td>ZENOAQ</td><td>100ml</td><td>PBMNCの凍結培地として使用</td></tr><tr><td>既知組成の脂質濃縮物</td><td>Invitrogen</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>遺伝子操作</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>フィッシャー</td><td>25*25-2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320</td><td></td></tr><tr><td>ドンキー血清</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Peprotech</td><td>100-64-50UG</td><td>ヒトエリスロポエチン</td></tr><tr><td>FGF8b</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>P = 1.077、密度勾配中</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td>グリ<td>ア由来神経栄養因子</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>21051024</td><td>100 &times;グルタミン原液</td></tr><tr><td>Ham's-F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175079</td><td>平衡食塩水</td></tr><tr><td>ヒト白血病抑制因子</td><td>ミルポア</td><td>LIF1010</td><td></td></tr><tr><td>ヒト組換え SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07-100UG</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1 Peprotech</td><td></td><td>100-11-100UG</td><td>ヒトインスリン様成長ファクター&nbsp;</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03-10UG</td><td>ヒトインターロイキン 3</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>215056-023</td><td>イスコーブの修正ダルベッコの培地</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>ロシュ&nbsp;</td><td></td><td></td>12585014</tr><tr><td>ITS-X</td><td>Invitrogen</td><td>51500-056</td><td>Insulin-transferrin-selenium-X supplement</td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>無血清基礎培地</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11243217001</tr><tr><td>マイクロシリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>N2 サプリメント&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>非必須アミノ酸</td></tr><tr><td>ニューロベース</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>塩基性培地</td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>Poly-D-リジン</td></tr><tr><td>SAG1</td><td>Enzo</td><td>ALX-270-426-M01</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>遺伝子操作</td><td>04-0010-10mg</td><td>光から -20?</td></tr><tr><td>仙台ウイルス</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ MAN0009378</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>baiaoshengke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;?</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td>トランスフォーミング グロース ファクター&nbsp; &β;?</td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td>R&Dシステムズ</td><td>2914-HT-100G</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX100baiaoshengke</td><td></td><td></td><td>非イオン性界面活性剤</td></tr><tr><td>トリパン</td><td>ブルーGibco</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1126</td><td></td></tr></tbody></table>

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

パーキンソン病(PD)は、腹部メセンスファロン(VM)における基数ニグラパースコンパクター(SNpc)におけるドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる。細胞置換療法はPDの治療に大きな期待を寄せており、最近、腫瘍形成のリスクが低下し、可塑性が生じるため、誘導神経幹細胞(iNSC)が細胞補充療法の候補として浮上している。領域特異的ニューロンとグリア。iNSCは、線維芽細胞、末梢血単核細胞(PBMNC)および様々な他のタイプの細胞などの自家体細胞源から再プログラムすることができる。他のタイプの体細胞と比較して、PBMNCは培養中にアクセスし、拡大しやすいので魅力的なスターターセルタイプです。センダイウイルス(SeV)は、ヒトOCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含む再プログラミング因子をコードするRNA非統合型ウイルスであり、ネグレーション、一本鎖、非セグメントゲノムを有し、 宿主ゲノムは、感染した細胞の細胞質でのみ複製し、リプログラミングのための効率的で安全な手段を提供する。本研究では,PBMNCを再プログラミングしてiNSCを得るプロトコルを用いて,2段階の方法で特殊なVM DAニューロンに分化するプロトコルについて述べた.次に、DA前駆体を一方的に6-ヒロキシドパミン(6-OHDA)病変PDマウスモデルに移植し、PDの治療の安全性と有効性を評価する。この方法は、インビトロおよびインビボにおける患者特異的DA神経細胞の機能および治療効果を調べるためのプラットフォームを提供する。

ここでは、PDモデルを治療するためのiNSC-DA細胞療法の異なる段階をカバーするプロトコルを報告する。まず、PBMNCを単離して拡張し、SeV感染によりiNsCに再プログラムした。PBMNC 拡張および iNSC 誘導を使用した手順の概略図を図1に示します。14日目、PBMNCは密度勾配媒体(材料の表)を用いて単離した。遠心分離の前に、PBSと密度勾配媒体で希釈した血液を2層に分離した。遠心分離の後、4つの勾配層が現れた(下から上へ):下層には顆粒球と赤血球が含まれていた。2番目の層には密度勾配媒体が含まれていました。3 番目の含まれている PBMNC (赤い矢印);最上層には血小板が豊富な血漿が含まれていた(図2A)。拡大の14日後、PBMNCは0日目としてSeVに感染した。1日目に、SeVを含む培地を除去した(図2B)。<strong class="xf...

このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

このプロトコルは、パーキンソン病などの神経変性疾患の治療に使用できる神経幹細胞に血液および単核細胞を再プログラムする方法を説明する。これは、神経変性疾患を治療するために自己細胞源を提供しています.また、神経幹細胞を誘導し、所望の細胞タイプへの分化に必要な時間枠は、人工多能性幹細胞に比べて短い。誘導神経幹細胞は、良好な増殖能力を有し、適用前にスケールアップすることができる。iNSCは、脊髄ニューロンまたは運動ニューロンなどの異なる領域特異的神経細胞に指定することができるので、この方法は、他の神経疾患の治療のために拡張され得る。手順全体は長い時間がかかり、すべてのステップが関連し、重要であるため、視覚的なデモンストレーションでは、セルがどのように見えるかを知ることができ、目的のセルの生成を成功させるためのヒントが提供されます。まず、以前に単離された末梢静脈血を50ミリリットル円錐形チューブに移し、同量の無菌ダルベッコPBSで希釈する。別の50ミリリットルの円錐形チューブで、15ミリリットルの滅菌密度勾配培地を調製する。45度の角度でチューブを傾け、ゆっくりと慎重に密度勾配媒体上に希釈された末梢血の30ミリリットルを置きます。遠心分離機ブレーキをオフ位置にセットした室温で15分間、800回gでチューブを遠心します。黄色、上部プラズマ層を吸引し、廃棄する。10ミリリットルのピペットを使用して、単核細胞を含む白色の白濁薄膜層を新しい50ミリリットル円錐形チューブに移します。MNCでチューブに30ミリリットルのD-PBSを加え、摂氏4度で10分間600倍の遠心分離機を加えます。上清を捨て、45ミリリットルのD-PBSを加え、細胞を再懸濁する。チューブを400倍gで摂氏4度で10分間遠心した後、上清を捨てます。D-PBSの5ミリリットルで細胞を再中断し、トリパンブルーの排除方法で生きた細胞を数え、拡張に必要なMNCを脇に置き、残りの細胞を将来使用するために凍結します。日マイナス14日に、37°Cの1.5ミリリットル、事前に温めたMNC培地を備えた6ウェルプレートのウェルあたり、1ミリリットル当たり2〜300万個の密度でMNCをシードします。摂氏37度、2日間の二酸化炭素5%でインキュベートします。日マイナス11日に、殺菌されたピペットを使用して培地で細胞を採取し、新しい15ミリリットルの円錐管に移します。室温で5分間250回gで遠心分離機を、上清を捨て、あらかじめ温めたMNC培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁する。トリパンブルーで生存細胞を数えた後、6ウェルプレートで事前に温めたMNC培地で1ミリリットル当たり100万個の細胞の密度でMNCを播種します。摂氏37度、二酸化炭素5%を3日間インキュベートし、MNC培地で細胞回収、遠心分離、めっきを8日とマイナス4日に繰り返します。この手順でセンダイウイルスは危険であり、センダイウイルスに関するすべての手順は安全キャビネットで行う必要があります。そして、仙台ウイルスにさらされたすべてのヒントやチューブは、処分前にエタノールや漂白剤で処理する必要があります。ゼロ日に、MNC培地で細胞を収集し、15ミリリットル円錐管に移します。細胞を200回gで5分間遠心した後、上清を吸引し、温めるMNC培地を1ミリリットルで再懸濁する。トリパンブルーで生存細胞を数え、24ウェルプレートでウェルあたり200,000細胞の濃度に事前に温めたMNC培地でそれらを再中断します。仙台ウイルスを含むマイナス80度の貯蔵から5~10秒間摂氏37度の水浴でチューブを解凍し、室温で解凍します。解凍したら、すぐに氷の上に置きます。解凍した仙台ウイルスをMNCと共に24ウェルプレートの井戸に10の感染の多重度で加える。細胞の付着を容易にするために、プレートを1,000回gで30分間遠心し、その後プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素でインキュベーターに入れます。1日目に、培地で細胞を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。残りの細胞をさらに剥離するには、ウェルあたり1ミリリットルのMNC培地でウェルをすすいで、培地付きの細胞をチューブに加えます。細胞懸濁液を200回gで5分間遠心し、上清を吸引し、500マイクロリットルの新鮮な前温めたMNC培地で細胞を再懸濁し、24ウェルプレートのウェルに加える。2日目には、D-PBSでマイクロリットル1マイクロリットル当たり50マイクログラムを希釈した井戸あたり1ミリリットルを使用して、室温で少なくとも2時間6ウェルプレートをコーティングします。6ウェルプレートからポリD-リジンを吸引し、垂直クリーンベンチで約10分間乾燥させる。その後、6ウェルプレートに1ミリリットルラミニンあたり5マイクログラムのウェルあたり1ミリリットルを追加し、コーティングするために摂氏37度で4〜6時間インキュベートします。使用前にD-PBSでプレートを洗ってください。3日目には、ポリD-リジン/ラミニンコーティングされた6ウェルプレート上の誘発神経幹細胞培地にセンダイウイルス導入MNCをプレートします。5日目と7日目には、摂氏37度の1ミリリットル、事前に温めたiNSC培地を6ウェルプレートの各ウェルにそっと加えます。9日目から28日目まで、毎日新鮮な事前温めたiNSC培地に交換してください。iNSCコロニーの出現を監視し、約2〜3週間で、焼けたガラスピペットを使用して適切な形態を有するコロニーを選び、各コロニーを6ウェルプレートの別々のウェルに移して拡張する。一方的な6−ヒロキシドパミン病変マウスモデルを確立するために、麻酔を受けた成人、男性、SCIDベージュマウスの頭部を剃り、エリスロマイシン眼軟膏を塗布する。ステレオタックス装置上にマウスを置き、切歯バーでマウスを固定します。マウスヘッドをしっかりと適切に配置するために、イヤーカップを正しく挿入します。ポビドンヨウ素とイソプロピルアルコールで頭部を殺菌し、メスの刃を使用して頭部皮膚に約1.5センチメートルの矢状切開を行い、頭蓋骨を露出させる。切歯バーとイヤーバーを調整して、ブレグマとラムダの高さの差を 0.1 ミリメートル未満に減らします。マイクロシリンジ針の先端をブレグマに向かってゆっくりと動かして下げ、ブレグマをゼロポイントとして扱います。先端を前部 0.5 ミリメートルの座標と、bregma に対する横 2.1 ミリメートルの位置に移動します。先端を引き込み、マーカーペンで点をマークし、電子ドリルで頭蓋骨に少し穴を開けます。マイクロシリンジに1ミリリットル当たり5マイクログラムの2マイクロリットルを抽出します。針をマークされた点に戻し、針を3.2ミリメートルの側側/腹側に挿入します。注射器から6-ヒロキシドパミン溶液を1分間に1マイクロリットルの速度で注入し、注射針をさらに5分間所定の位置に残し、ゆっくりと引き込みます。縫合糸で切開を閉じた後、エリスロマイシン眼軟膏を再び目に塗布する。ステレオタックス装置からマウスを取り出し、回収ケージに入れ、意識を取り戻すまで食料と水へのアクセスを許可する。PBMNCがSeVに感染した後、その形態は変化し、細胞は5日目まで劇的な死を遂げた。INSCコロニーは12日目に出現しました。iNSCクローンを選択して、いくつかの通路の拡張のために移した後、彼らは良い形態を示し、単層の形態または球体として、iNSC媒体で安定して自己更新することができた。24日間の分化後、iNSCは、チロシンヒドロキシラーゼ、フォークヘッドボックスA2、およびニューロン特異的クラスIIIβ-チューブリンマーカーの大部分としてドーパミン作動性ニューロンとして同定された。一方的な6−ヒロキシドパミン病病のマウスモデルの確立後、行動評価はパーキンソン病の症状を推定するために行われた。細胞移植を受けたマウスは、運動機能の有意な改善を示した。6-ヒロキシドパミン誘発病変の程度は、線条体におけるTHの事後免疫蛍光染色、内側前脳束、および立体ニグラパルスパルスコンパクトで検証された。TH陽性シグナルは、細胞が移植された線条体で大きく回収され、SNでも軽度に回復した。移植後3ヶ月後、生き残った細胞のうち、約13.84%がTH陽性ドーパミン作動性ニューロンであった。TH陽性細胞の約91.72%が孤立核受容体を発現し、約86.76%がFOXA2を発現し、約98.77%がGタンパク質結合内向き整流カリウムと共標識された。濃度勾配媒体上に希釈された末梢血の30ミルを敷設する場合は、勾配界面を乱さない、ゆっくりと慎重にそれをしてください。高いウイルス活動を確実にするために、センダイウイルスの繰り返し解凍と凍結を避けるために注意する必要があります。末梢血単核細胞を神経幹細胞にリプログラミングする場合は、細胞の形態を毎日詳しく観察してください。また、6-ヒドロキシドーパミンは光と温度に敏感です。溶液を光から守り、使用前に氷の上に保管してください。この手順に従って、1つは、培養中の家族PD患者由来ドーパミン作動性ニューロンを使用して疾患メカニズムを研究し続けることができる。また、移植された細胞が損傷した神経回路にどのような影響を与えるかを調査し続けることができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

このビデオは、センダイウイルスを使用して末梢血単核細胞(PBMNC)を誘導神経幹細胞(iNSC)に再プログラミングする方法を示しています。センダイウイルスは、細胞を再プログラミングするための効率的で安全な手段を提供する非統合ウイルスです。...

末梢血単核細胞(PBMNC)からの誘導神経幹細胞(iNSC)の生成:仙台ウイルスを用いたPBMNCsのiNSCへの再プログラム法

このビデオは、遺伝子組み換え造血前駆細胞をニューロン幹細胞に直接再プログラミングする方法を示しています。造血前駆細胞によって発現される転写因子は、それらの形質転換を促進する分子イベントのカスケードを引き起こします。さらに特異的な培地を使用して、誘導されたニューロン幹細胞を選択し、増殖させます。...

造血前駆細胞の神経幹細胞への直接リプログラミング

このビデオは、パーキンソン病を研究するためのモデルを提供するために、ヒト胚性幹細胞(hESC)のドーパミン作動性ニューロンへの分化を示しています。hESCは、マイクロウェルプレート内の神経誘導培地で培養され、3Dニューロスフェアが形成されます。次に、これらを神経誘導培地で培養して、ドーパミン作動性前駆ニューロンへの分化を促進します。ニューロンの最終的な成熟は、気液界面条件下で培養インサートで起こり、成熟したドーパミン作動性ニューロンからなる3Dオルガノイドが得られます。...

ヒト胚性幹細胞からのドーパミン作動性ニューロンオルガノイドの作製

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ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

骨髄内には、神経ポテンシャルを有する骨髄間質細胞（MSC）が存在する。我々のプロトコルは、低酸素プレコンディショニングを介してこの細胞集団を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞にするよう指示する。...

成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

我々は、再プログラム化された末梢血細胞から神経表現型を有する細胞を得るための遺伝子組換え非遺伝子組換え(GMフリー)法を提示する。新規ヒトGPI結合タンパク質にリンクされたシグナル伝達経路の活性化は、ヒト多能性幹細胞を得るための効率的なGMフリーの方法を明らかにする。...

血液由来神経細胞のGMフリー生成

ここでは、化学的に再プログラムされた幹細胞をドーパミン作動性前駆細胞に分化させ、パーキンソン病のマウスモデルに移植し、移植された細胞の成功した統合と機能的有効性を確認するために、これらの細胞を正確なニューロン調節を達成するためのプロトコルについて説明します。...

神経変性疾患の治療における再プログラム幹細胞由来前駆細胞における化学遺伝学的制御

学ぶ末梢血単核細胞から誘導神経幹細胞を生成し、ドーパミン作動性ニューロン前駆体へ分化させる方法。パーキンソン病治療への応用と移植後の運動機能改善効果を評価する再生医療技術です。

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

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