末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

このプロトコルは、パーキンソン病などの神経変性疾患の治療に使用できる神経幹細胞に血液および単核細胞を再プログラムする方法を説明する。これは、神経変性疾患を治療するために自己細胞源を提供しています.また、神経幹細胞を誘導し、所望の細胞タイプへの分化に必要な時間枠は、人工多能性幹細胞に比べて短い。

誘導神経幹細胞は、良好な増殖能力を有し、適用前にスケールアップすることができる。iNSCは、脊髄ニューロンまたは運動ニューロンなどの異なる領域特異的神経細胞に指定することができるので、この方法は、他の神経疾患の治療のために拡張され得る。手順全体は長い時間がかかり、すべてのステップが関連し、重要であるため、視覚的なデモンストレーションでは、セルがどのように見えるかを知ることができ、目的のセルの生成を成功させるためのヒントが提供されます。

まず、以前に単離された末梢静脈血を50ミリリットル円錐形チューブに移し、同量の無菌ダルベッコPBSで希釈する。別の50ミリリットルの円錐形チューブで、15ミリリットルの滅菌密度勾配培地を調製する。45度の角度でチューブを傾け、ゆっくりと慎重に密度勾配媒体上に希釈された末梢血の30ミリリットルを置きます。

遠心分離機ブレーキをオフ位置にセットした室温で15分間、800回gでチューブを遠心します。黄色、上部プラズマ層を吸引し、廃棄する。10ミリリットルのピペットを使用して、単核細胞を含む白色の白濁薄膜層を新しい50ミリリットル円錐形チューブに移します。

MNCでチューブに30ミリリットルのD-PBSを加え、摂氏4度で10分間600倍の遠心分離機を加えます。上清を捨て、45ミリリットルのD-PBSを加え、細胞を再懸濁する。チューブを400倍gで摂氏4度で10分間遠心した後、上清を捨てます。

D-PBSの5ミリリットルで細胞を再中断し、トリパンブルーの排除方法で生きた細胞を数え、拡張に必要なMNCを脇に置き、残りの細胞を将来使用するために凍結します。日マイナス14日に、37°Cの1.5ミリリットル、事前に温めたMNC培地を備えた6ウェルプレートのウェルあたり、1ミリリットル当たり2〜300万個の密度でMNCをシードします。摂氏37度、2日間の二酸化炭素5%でインキュベートします。

日マイナス11日に、殺菌されたピペットを使用して培地で細胞を採取し、新しい15ミリリットルの円錐管に移します。室温で5分間250回gで遠心分離機を、上清を捨て、あらかじめ温めたMNC培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁する。トリパンブルーで生存細胞を数えた後、6ウェルプレートで事前に温めたMNC培地で1ミリリットル当たり100万個の細胞の密度でMNCを播種します。

摂氏37度、二酸化炭素5%を3日間インキュベートし、MNC培地で細胞回収、遠心分離、めっきを8日とマイナス4日に繰り返します。この手順でセンダイウイルスは危険であり、センダイウイルスに関するすべての手順は安全キャビネットで行う必要があります。そして、仙台ウイルスにさらされたすべてのヒントやチューブは、処分前にエタノールや漂白剤で処理する必要があります。

ゼロ日に、MNC培地で細胞を収集し、15ミリリットル円錐管に移します。細胞を200回gで5分間遠心した後、上清を吸引し、温めるMNC培地を1ミリリットルで再懸濁する。トリパンブルーで生存細胞を数え、24ウェルプレートでウェルあたり200,000細胞の濃度に事前に温めたMNC培地でそれらを再中断します。

仙台ウイルスを含むマイナス80度の貯蔵から5~10秒間摂氏37度の水浴でチューブを解凍し、室温で解凍します。解凍したら、すぐに氷の上に置きます。解凍した仙台ウイルスをMNCと共に24ウェルプレートの井戸に10の感染の多重度で加える。

細胞の付着を容易にするために、プレートを1,000回gで30分間遠心し、その後プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素でインキュベーターに入れます。1日目に、培地で細胞を15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。残りの細胞をさらに剥離するには、ウェルあたり1ミリリットルのMNC培地でウェルをすすいで、培地付きの細胞をチューブに加えます。

細胞懸濁液を200回gで5分間遠心し、上清を吸引し、500マイクロリットルの新鮮な前温めたMNC培地で細胞を再懸濁し、24ウェルプレートのウェルに加える。2日目には、D-PBSでマイクロリットル1マイクロリットル当たり50マイクログラムを希釈した井戸あたり1ミリリットルを使用して、室温で少なくとも2時間6ウェルプレートをコーティングします。6ウェルプレートからポリD-リジンを吸引し、垂直クリーンベンチで約10分間乾燥させる。

その後、6ウェルプレートに1ミリリットルラミニンあたり5マイクログラムのウェルあたり1ミリリットルを追加し、コーティングするために摂氏37度で4〜6時間インキュベートします。使用前にD-PBSでプレートを洗ってください。3日目には、ポリD-リジン/ラミニンコーティングされた6ウェルプレート上の誘発神経幹細胞培地にセンダイウイルス導入MNCをプレートします。

5日目と7日目には、摂氏37度の1ミリリットル、事前に温めたiNSC培地を6ウェルプレートの各ウェルにそっと加えます。9日目から28日目まで、毎日新鮮な事前温めたiNSC培地に交換してください。iNSCコロニーの出現を監視し、約2〜3週間で、焼けたガラスピペットを使用して適切な形態を有するコロニーを選び、各コロニーを6ウェルプレートの別々のウェルに移して拡張する。

一方的な6−ヒロキシドパミン病変マウスモデルを確立するために、麻酔を受けた成人、男性、SCIDベージュマウスの頭部を剃り、エリスロマイシン眼軟膏を塗布する。ステレオタックス装置上にマウスを置き、切歯バーでマウスを固定します。マウスヘッドをしっかりと適切に配置するために、イヤーカップを正しく挿入します。

ポビドンヨウ素とイソプロピルアルコールで頭部を殺菌し、メスの刃を使用して頭部皮膚に約1.5センチメートルの矢状切開を行い、頭蓋骨を露出させる。切歯バーとイヤーバーを調整して、ブレグマとラムダの高さの差を 0.1 ミリメートル未満に減らします。マイクロシリンジ針の先端をブレグマに向かってゆっくりと動かして下げ、ブレグマをゼロポイントとして扱います。

先端を前部 0.5 ミリメートルの座標と、bregma に対する横 2.1 ミリメートルの位置に移動します。先端を引き込み、マーカーペンで点をマークし、電子ドリルで頭蓋骨に少し穴を開けます。マイクロシリンジに1ミリリットル当たり5マイクログラムの2マイクロリットルを抽出します。

針をマークされた点に戻し、針を3.2ミリメートルの側側/腹側に挿入します。注射器から6-ヒロキシドパミン溶液を1分間に1マイクロリットルの速度で注入し、注射針をさらに5分間所定の位置に残し、ゆっくりと引き込みます。縫合糸で切開を閉じた後、エリスロマイシン眼軟膏を再び目に塗布する。

ステレオタックス装置からマウスを取り出し、回収ケージに入れ、意識を取り戻すまで食料と水へのアクセスを許可する。PBMNCがSeVに感染した後、その形態は変化し、細胞は5日目まで劇的な死を遂げた。INSCコロニーは12日目に出現しました。

iNSCクローンを選択して、いくつかの通路の拡張のために移した後、彼らは良い形態を示し、単層の形態または球体として、iNSC媒体で安定して自己更新することができた。24日間の分化後、iNSCは、チロシンヒドロキシラーゼ、フォークヘッドボックスA2、およびニューロン特異的クラスIIIβ-チューブリンマーカーの大部分としてドーパミン作動性ニューロンとして同定された。一方的な6−ヒロキシドパミン病病のマウスモデルの確立後、行動評価はパーキンソン病の症状を推定するために行われた。

細胞移植を受けたマウスは、運動機能の有意な改善を示した。6-ヒロキシドパミン誘発病変の程度は、線条体におけるTHの事後免疫蛍光染色、内側前脳束、および立体ニグラパルスパルスコンパクトで検証された。TH陽性シグナルは、細胞が移植された線条体で大きく回収され、SNでも軽度に回復した。移植後3ヶ月後、生き残った細胞のうち、約13.84%がTH陽性ドーパミン作動性ニューロンであった。

TH陽性細胞の約91.72%が孤立核受容体を発現し、約86.76%がFOXA2を発現し、約98.77%がGタンパク質結合内向き整流カリウムと共標識された。濃度勾配媒体上に希釈された末梢血の30ミルを敷設する場合は、勾配界面を乱さない、ゆっくりと慎重にそれをしてください。高いウイルス活動を確実にするために、センダイウイルスの繰り返し解凍と凍結を避けるために注意する必要があります。

末梢血単核細胞を神経幹細胞にリプログラミングする場合は、細胞の形態を毎日詳しく観察してください。また、6-ヒドロキシドーパミンは光と温度に敏感です。溶液を光から守り、使用前に氷の上に保管してください。

この手順に従って、1つは、培養中の家族PD患者由来ドーパミン作動性ニューロンを使用して疾患メカニズムを研究し続けることができる。また、移植された細胞が損傷した神経回路にどのような影響を与えるかを調査し続けることができます。