電圧感受性染料を用いた脳スライスにおける広視野単一光子光学記録
2019年6月20日
電圧感受性染料を用いた脳スライスの再現性と安定した光学記録法をご紹介します。この記事では、従来の海馬スライス製剤を用いた光信号の電圧感受性染料染色と記録について説明する。
感応色の光記録法は、脳の働き方を可視化する理想的な技術と考えられています。この方法は、精神的な活動に関する見解を与えられ、12時間以上にわたって神経精神動態を安定的かつ確実に記録することを可能にした。母に対する貴重な酸塗布など、開発全段階で化学物質による回路変化を検出するアプリケーションを拡大しようとしています。
この技術はすでに十分に確立されています。ここで紹介する方法に従って、研究を再現してみてください。この手順を開始するには、切断された頭部を氷の冷たいACSFにステンレス鋼の外科用トレイに浸します。
1分以内に脳を抽出し、5分間冷やしたACSFを含むビーカーに入れます。次に、メスで中線の脳部を分割し、4%寒天ブロックに両方の半球を配置します。次に、両半球の脳ブロックを4%寒天ブロックに置きます。
余分な ACSF をフィルタ ペーパーでブロックから拭き取ります。その後、バイブレーションのプラットフォームにスーパーグルーを適用します。寒天ブロックを置き、過剰な接着剤を濾紙で拭きます。
優しく余分なスーパーグルーを固め、接着剤が脳を覆い、スライスを乱すことを防ぐために、脳寒天ブロックの上から氷冷ACSFの少量を適用します。その後、プラットフォームをビブラートメトレーに固定し、変更されたACSFを注ぎます。ビブラートを低速に設定し、ブレード周波数を最大設定にします。
その後、スライスを開始します。スライスの順序を簡単に区別できるように、スライスチャンバーの隅にスライスを順番に配置します。通常、1つの半球から3〜5枚のスライスを得ることができます。
次に、30ゲージ針を用いて脳幹部分を切断する。小さな先端のペイントブラシを使用して、プレキシガラスリングで保持されている膜フィルターの上にスライスを置きます。リングを湿った回復室に置き、カバーを固定して内圧を高く保ちます。
スライスを膜フィルターに配置する場合は、リング内のスライスの方向と位置を調整して、適切に中央に配置され、一貫した方向を持つようにします。標本を摂氏28度に30分間放置し、室温で少なくとも10~30分間放置して回収します。スライスを染色するには、各スライスに100マイクロリットルの染色液をそっと塗布し、室温で20分でインキュベートします。
次に、50~100ミリリットルのACSFを容器に入れる。試料を入れたリングを入れ、染色液をすすきます。次に、すすったスライスを別のインキュベーションチャンバーに移します。
実験の前に回復のために1時間以上待ちます。この手順を開始するには、アンプ、コンピュータ、カメラシステムの電源を入れ、ソフトウェアを開きます。50ミリリットルのチューブにACSFを注ぎ、カルボーゲンで泡立て。
ACSFを循環させ、流量を毎分約1ミリリットルに調整するために蠕動ポンプを使用してください。次に、実験室内部の液位が常に一定になるように吸引ピペットの高さを調整する。地面電極をチャンバーに置きます。
続いて、ガラス電極に少量のACSFを充填し、電極ホルダーに入れます。ホルダをマニピュレータのロッドに取り付けます。アンプを使用して、電極抵抗がおよそ1メガオームであることを確認してください。
録音セッションでは、湿ったチャンバから実験室にスライスを移します。リングの端をしっかりとシリコンOリングに押し込みます。膜や実験室の底部を壊さないように注意してください。
顕微鏡下では、刺激電極の先端と電界電位記録電極をスライスに配置します。刺激を提供することによって、呼び起こされる応答を確認します。視野が光学記録システムの右の神経回路を覆っていることを確認します。
次に、励起光強度をカメラの最大容量の約70~80%に調整します。蛍光光源を使用して、集録システムで焦点を調整します。そして、記録を開始し、取得後の画像取得ソフトウェアのデータを分析する。
この図は、マウス海馬スライスの領域CA1におけるシャファーコラテロールの電気刺激時の代表的な光信号を示す。これらの連続した画像は、任意の容量フィルタと時間フィルタが適用される前に光信号を示し、これらの画像は5/5〜5立方フィルタを2回適用した後、同じデータを示しています。高いフレームレートと高い空間分解能のために、フィルタの適用は信号を変更しませんでしたが、単一の試行でピクセルで記録された時間コースでも観察できるノイズを除外しました。
ここでは、マウスとラットの海馬スライスの領域CA1の典型的な応答の比較です。小さな過分極応答は、マウス海馬スライスで24ミリ秒後にCA1の遠位側で観察されるが、より大規模な過分極応答はラット海馬スライスの脱分極応答を追い越した。スライスが染色されると、それらは12時間以上続く必要があり、あなたはそれらに他の電気生理学的録音を行うことができます。
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概要
本研究では、海馬ニューロンのシグナリングに着目し、電圧感受性色素を用いた脳切片向けの安定した光学記録法を提示します。この手法により、神経精神的なダイナミクスを長期間にわたって信頼性高く観察することが可能となり、薬剤投与による回路変化の調査が促進されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 光学イメージング
背景
- 電圧感受性色素は、脳活動を可視化するために不可欠です。
- 従来の海馬スライス標本を生物学的モデルとして用います。
- 本研究では、神経精神的なダイナミクスと回路の変化を探索します。
- 従来の手法では、長時間の記録において信頼性が不足していました。
研究目的
- 脳切片における光学記録の再現可能な手法を導入すること。
- 化学物質が脳回路のダイナミクスに及ぼす影響についての知見を提供すること。
- ニューロンの活動および反応の長期的な観察を可能にすること。
使用した手法
- 使用されるプラットフォームは、マウス海馬から作製されたex vivo脳スライスです。
- 主要なモデルには海馬スライスが含まれており、電気活動の研究を容易にします。
- マルチオミクスワークフローについての言及はなく、光学的手法および電気生理学的手法に焦点が当てられています。
- 作製工程には、スライスの冷却、染色、およびインキュベーションなどの細心の注意を要するステップが含まれます。
- 記録セッションは、精密なセットアップ要件を備えた実験チャンバー内で実施されます。
主な結果
- 光学的手法を用いることで、12時間にわたる信頼性の高いデータ収集が可能になります。
- マウスとラットの海馬スライスにおける応答を比較すると、異なる神経生理学的プロファイルが示されます。
- 過分極応答などの電気生理学的変化が、光学的な記録によって裏付けられています。
- この技術により、さまざまな条件下における神経回路ダイナミクスの理解が深まります。
結論
- この手法は、脳回路および神経心理学的現象の研究において重要な進展をもたらします。
- これにより、研究者はニューロンシグナリングのリアルタイムな変化を観察することが可能になります。
- これらのメカニズムを解明することで、可塑性や潜在的な治療への応用に関する知見が得られる可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
広視野単一光子電位感受性色素イメージングにより、脳切片における神経回路の安定した長期的な機能評価が可能となり、神経科学のターゲットバリデーションにおける主要な課題が解決されます。この手法は、長期間にわたる神経活動の定量的かつ高解像度な光学的読み出しを提供することで、メカニズムのデリスキングを支援し、これは前臨床探索において化合物が回路ダイナミクスに及ぼす影響を評価するために不可欠です。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：海馬回路における神経細胞のシグナル伝達ダイナミクスをリアルタイムで可視化することにより、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用上の価値：12時間以上の安定した再現性のある記録を可能にし、ターゲットへの結合やパスウェイ変調の縦断的な評価をサポートします。
- 予測的価値：化学物質の適用によって誘導される回路の変化の検出を容易にし、神経活性化合物の効果の早期特定を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況： 10 kHzのフレームレートと100x100ピクセルの解像度を実現し、神経応答の高スループットな時間的および空間的解析を可能にします。
- 信号品質： 記録後のフィルタリングにより信号対雑音比が向上し、アッセイの感度に不可欠な閾下回路の変化を確実に検出できます。
- 再現性： 安定したスライス操作および染色プロトコルにより機械的なアーチファクトが最小限に抑えられ、反復試行および実験セッション間での一貫したデータが保証されます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：認知機能障害や神経精神疾患に関与する領域である海馬ネットワークにおける回路改変の評価を支援します。
- トランスレーショナルな連続性：光学的な記録と電気生理学的な記録の並行実施を可能にし、異なる測定モダリティ間での機能的アウトカムの検証を強化します。
- リスク調整済み進展：マウスとラットのスライス間における応答プロファイルの相違を明らかにすることで、種間翻訳に情報を与え、前臨床候補の選択におけるリスク低減に寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、標的バリデーションとリード化合物の同定を橋渡しする機能的な回路リードアウトを提供することで、初期探索ワークフローに統合されます。これは特に、回路レベルでの表現型評価を必要とする神経活性化合物の解析において有用です。
- 探索生物学：定義された神経回路における誘発光信号の直接的な可視化を通じて、神経心理学的ダイナミクスの仮説検証とパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：自動解析に適した定量的で高解像度な光出力を提供し、化合物によって誘導される神経活動の変化の比較を可能にします。
- アナリティクス：時空間フィルタの適用によりノイズから信号を抽出できるため、回路応答の客観的な定量化とばらつきの評価を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ：長期間にわたる繰り返し記録を可能にすることで、化合物効果の安定性と再現性を評価し、探索段階の回路観察を前臨床検証へと結びつけます。
- エンタープライズ再利用：標準化されたスライス作製およびイメージングプラットフォームにより、複数のプロジェクトや化合物シリーズ間での再利用をサポートし、神経科学スクリーニングカスケードにおける手法のばらつきを低減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経回路機能に関するメカニズム的な洞察を提供し、標的バリデーションにおける曖昧さを軽減し、神経薬理学的スクリーニングにおける予測の信頼性を高めます。
- 運用の価値：生理学的条件を維持し、スライスの移動を防止することで、信頼性の高い化合物スクリーニングのための、安定したアーティファクトのないデータ収集を保証します。
- 戦略的価値：オフターゲット効果や有害な回路への影響を早期に検出することを可能にし、CNS（中枢神経系）創薬における後期段階での失敗リスクを軽減することで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：機能的な回路プロファイルに基づいた化合物のリスク調整済み優先順位付けをサポートし、前臨床パイプラインにおける資本効率を向上させます。
実施上の考慮事項
- スライスの生存率と染色の効率を適切に確保するため、電気生理学、光学イメージング、および組織操作に関する専門知識が必要です。
- 高速カメラシステム、蛍光光源、および長時間の記録において生理学的条件を維持できる灌流装置への依存度が高くなります。
- 光学信号のベースラインと応答性のばらつきを最小限に抑えるため、チーム間でのスライスの方向、染色時間、および回復プロトコルの標準化が必要です。
- 他の脳領域や疾患モデルに適用する場合、染色効率および回路特異的な信号発現の検証が必要となる場合があります。
- 実用上の制限として、検出に十分な信号振幅を維持しつつ、光毒性を防ぐために励起光強度を慎重に最適化する必要があります。
