Name: KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: 学ぶFISHと免疫蛍光法を用いたKSHV感染細胞におけるウイルスRNAの可視化と定量解析。この手法は宿主細胞内でのヘルペスウイルス遺伝子産物の時間的調節を定量的に評価し、ウイルス学および細胞生物学研究に有用です。

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データ分析に関するアドバイスをいただいたジョナサン・ローデンフェルス、カジミエシュ・ティコウスキー、ジョアンナ・B・ウィーザーズに感謝します。また、G.ヘイワードの抗SSB抗体に感謝します。この研究は、国立衛生研究所(TKV)およびNIH助成金(CA16038)(JAS)からの助成金T32GM007223およびT32AI055403によって支援されました。JASはハワード・ヒューズ医学研究所の研究者です。図1-3および表1は、次の出版物からクリエイティブ・コモンズ・アトリビューション・ライセンスの下で米国微生物学会の許可を受けて複製されました:ヴァレリー、T.K.、ブリザーズ、J.B.、アンドー、J.A.、スタイツ、J.A.カポジの肉腫関連核病巣におけるヘルペスウイルスmRNA蓄積は、ウイルスDNA複製およびウイルス非コードポリアデデン化核RNAの影響を受ける。ウイルス学のジャーナル。92 (13), doi:10.1128/JVI.00220-18, (2018)

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<li>Vallery, T. K., Withers, J. B., Andoh, J. A., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+mRNA+Accumulation+in+Nuclear+Foci+Is+Influenced+by+Viral+DNA+Replication+and+Viral+Noncoding+Polyadenylated+Nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus mRNA Accumulation in Nuclear Foci Is Influenced by Viral DNA Replication and Viral Noncoding Polyadenylated Nuclear RNA.</a> Journal of Virology. 92 (13), (2018).</li>
<li>Borah, S., Nichols, L. A., Hassman, L. M., Kedes, D. H., Steitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+expression+and+subcellular+localization+of+RNA+and+protein+species+using+high-throughput+single+cell+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Tracking expression and subcellular localization of RNA and protein species using high-throughput single cell imaging flow cytometry.</a> RNA. 18 (8), 1573-1579 (2012).</li>
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<li>Chen, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+Sarcoma-Associated+Herpesvirus+Hijacks+RNA+Polymerase+II+To+Create+a+Viral+Transcriptional+Factory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory.</a> Journal of Virology. 91 (11), (2017).</li>
</ol>

著者は、開示する利益相反を持っていません。

このレポートに記載されているプロトコルは、異なる細胞タイプに適応することができ、モノクローナルおよびポリクローナル一次抗体の両方を使用してIFを用いた二重RNA FISHおよびRNA FISHのステップが含まれる。調製されたスライドは、通常、共焦点顕微鏡で画像化されるが、画像化は、増加した抗体濃度および異なる取り付け媒体の修飾後にSTED(刺激放出枯渇)顕微鏡で行うことができる。個々の細胞の増強分析のために、このプロトコルで調製されたサンプルは、Borahおよび同僚16によって示されているように、適度な変化を伴う細胞選別器またはフローサイトメーターによってソート、画像化、および分析され得る。ただし、このプロトコルは生細胞イメージングには採用できません。
詳細な定量法は、観察バイアスを排除し、潜在的な核細胞質シフトを検証するのに役立ちます。核細胞質比はまた、生体分子が特定の細胞内の局所化に均等に分散することから局所化するように調整する場合にも特定する。ここで示す結果は半定量であり、プロトコルは定量を強化する方法を概説します。核細胞質比と...

その溶解性(活性)相において、ヘルペスウイルスは宿主細胞をハイジャックし、細胞形態の変化および生体分子の局在化を引き起こし、ビリオンを産生する。操作のベースは核で、二本鎖DNAウイルスゲノムが複製され、カプシド1と呼ばれるタンパク質シェルに包まれます。まず、ウイルスは独自のタンパク質を発現し、宿主機構を乗っ取り、非必須の宿主遺伝子の発現を防止し、宿主の遮断効果と呼んだプロセスである。この活性の大部分は、宿主およびウイルスタンパク質、RNA、およびウイルスDNA2の両方からなるウイルス複製コンパートメントと呼ばれる特定の4'、6-ジアミド-2-フェニリンドール(DAPI)フリー核領域に局在する。セルは、複製コンパートメントのスペースとリソースを提供し、ウイルスカプシドの組み立てに対して、オーバーホールされます。いったんカプシドが核から出ると、細胞質にカプセル化して膜結合型ウイルス粒子(ビリオンとも呼ばれる)を作り出す方法は不明である。溶解期における宿主とウイルス生体分子の両方の局在化と空間シフトの理解は、複製コンパートメントの配置、宿主の遮断効果、ビリオン出口経路、およびその他の機械的洞察を提供します。ヘルペスウイルス感染および複製に関連するプロセス。
現在、これらの変化を検出して研究する最良の方法は、免疫蛍光(IF)と蛍光を有する感染細胞におけるタンパク質およびRNAの可視化(FISH)である。これらの技術を用いたタイムコースの使用は、溶解相の重要な点または単に時空間的なデータにおける生体分子の局在を明らかにする。FISHおよびIFは、細胞プロセスの阻害(例えば、ウイルスDNA複製の阻害)、RT-qPCR(リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応)、RNAシーケンシング、ノーザンブロット、質量分析、ウェスタンブロッティングなどの他の生化学的技術を補完する。ウイルスDNA産生の分析は、細胞活動のよりグローバルな画像を提供する可能性があります。
特定の遺伝子からRNA産物を調べるRNA FISH戦略と、特定遺伝子産物の核細胞質比を定量的に計算する計算解析を開発した。Steitzたちは、Steitzたちは以前の出版物3,4から改変したサンプル調製物は比較的容易であり、付着細胞および懸濁細胞の両方に使用することができる。プロトコルはまたIFの戦略が付いている複数のRNA FISHの戦略(二重RNA FISH)またはRNA FISHの同時使用のために適応可能である。特定のFISH戦略の開発は困難ですが、成功を改善するための提案が概説されています。ここで説明するデータ分析は、蛍光ビーズとコンパートメント境界の強いマーカーを使用する場合に定量的であり、顕微鏡写真に関するさらなる洞察、観察バイアスを除去する洞察を提供します。詳細なプロトコルは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)に感染した潜伏細胞および溶解細胞の両方のために設計されており、他のヘルペスウイルス5に感染した未感染細胞または細胞で使用することができる。定量の方法は、ほとんどの細胞の細胞下のコンパートメント間の核細胞シフトまたは再局在化に関する研究に適用可能である。

<table><tbody><tr><td>AlexaFluor594-5-dUTP</td><td>Life Technologies</td><td>C1100</td><td></td></tr><tr><td>アンチDIG FITC&nbsp;</td><td>Jackson Lab Immunologicals</td><td>200-092-156</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit Secondary AlexaFluor594 Monoclonal Antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>Goat</td></tr><tr><td>Anti-SSB Antibody</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Ref. Chiou et al. 2002</td></tr><tr><td>BLASTn</td><td>NIH NCBI</td><td>N/A</td><td>Free Sequence Alignment Software</td></tr><tr><td>Dextran Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8906</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>DIGオリゴヌクレオチドテーリングキット</td><td>Sigma Roche</td><td>#03353583910</td><td>2nd Gen</td></tr><tr><td>Eight-Chamber Slides</td><td>Nunc Lab Tek II</td><td>#154453</td><td>ブルーシールは表面張力を促進しますが、クリアゲルによる分離も可能です。&nbsp;</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9037</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>GAPDH プローブ</td><td>Stellaris</td><td>SMF-2019-1</td><td>プロトコルと互換性あり、Quasar 670</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td>NIH、ベセスダ、メリーランド州</td><td>N/A</td><td>無料画像解析ソフトウェア、[http:rsb.info.nih.gov/ij/]</td></tr><tr><td>OligoAnalyzer</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>無料オリゴヌクレオチド分析装置&nbsp;</td></tr><tr><td>pcDNA3</td><td>Invitrogen</td><td>A-150228</td><td></td></tr><tr><td>pmaxGFP</td><td>Amaxa</td><td>VDF-1012</td><td></td></tr><tr><td>Poly L-Lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Terminal Transferase</td><td>Sigma Roche</td><td>#003333574001</td><td></td></tr><tr><td>Vanadyl Ribonucleoside Complexes&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド</td><td>・ベクター・ラボラトリーズ株式会社&nbsp;</td><td>H-1000</td><td>DAPIは封入剤内で光を散乱させ、コントラストを低下させます。</td></tr></tbody></table>

kshv感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(fish)と免疫蛍光(if)における定量蛍光

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

機械的な洞察は、特定のRNAおよびタンパク質の慎重な研究と定量から到着します。特定の時間における細胞全体のこれらの生体分子の相対的な位置は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)および免疫蛍光(IF)における蛍光で捕捉することができる。溶解ヘルペスウイルス感染の間、ウイルスはウイルス遺伝子を優先的に発現するために宿主細胞をハイジャックし、細胞形態および生体分子の挙動に変化を引き起こす。溶解活性は、FISHとIFでのみ識別可能なウイルス複製コンパートメントと呼ぶ原子力工場を中心としています。ここでは、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス(KSHV)感染細胞に対するRNA FISHおよびIF技術の適応可能なプロトコルについて説明する。この方法には、特異的な抗感オリゴヌクレオチドの開発のためのステップ、ダブルRNA FISH、IFを有するRNA FISH、および蛍光強度の定量計算が含まれる。このプロトコルは、複数の細胞タイプ、未感染細胞、潜伏細胞、溶解細胞、時間コース、および阻害剤で処理された細胞に正常に適用され、ヒト宿主およびタンパク質の両方から特定のRNAおよびタンパク質の時空間的活性を分析し、KSHV

この原稿に詳述されているFISHおよびIF法は、蛍光強度の線トレースによる結果の定量化と共に図1に示す。ここで提示される結果は半定量的であり、実験はスライド調製に蛍光ビーズを含んでいなかったため、異なる蛍光染色の強度間の比較ではなく、局在化に関する洞察を提供する。図1はまた、細胞質および核領域とその比率が潜伏細胞および溶解性KSHV感染細胞に対して異なることを明らかにする。したがって、面積は、図2に示す核細胞質比で制御される。図2は、核制御、ウイルスポリアデニル化核(PAN)RNA、および細胞質制御、宿主GAPDH mRNAを用いた核細胞質比について、この原稿に詳述された計算を検証する。図3は、ホスホノ酢酸(ドキシ+PAA)またはシドフォビル(ドキシ+シド)のいずれかを使用して...

我々は、その場ハイブリダイゼーション(FISH)における蛍光を利用して、凍結感染したヒト細胞内の複数のヘルペスウイルスRNAを懸濁または付着性のいずれかで可視化するプロトコルについて説明する。このプロトコルは、核細胞質比を産生する蛍光の定量を含み、免疫蛍光(IF)を有する宿主およびウイルスタンパク質の同時可視化のために拡張することができる。

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

このプロトコルは、特にヘルペスウイルスに関連して、宿主細胞の文脈内で、ウイルス遺伝子産物の時間的調節に関する定量的洞察を得るのに役立つ。この技術は、宿主およびウイルスRNAおよびタンパク質の両方に関連する研究上の質問に対処するのに役立ちます。さらに、この技術は同時生化学的アッセイと互換性がある。8つのチャンバースライドに細胞を付着させるために、無菌、8つのチャンバースライドの各チャンバーに200マイクロリットルの固有の細胞懸濁液を塗布し、摂氏37度で12〜24時間、摂氏5%の二酸化炭素で種子増殖を可能にする。インキュベーションの終わりに、上清および未結合の細胞を吸引し、PBS上で4%ホルムアルデヒドを氷上で冷やして30分間直します。固定の終わりに、1回の洗浄につき4°CのPBSの200マイクロリットルで3、5分の洗浄で細胞を洗浄します。最後の洗浄後、PBSあたり200マイクロリットルのプレチルド0.5%トリトン-XをPBSで、氷の上で10分間透過させます。パーメアビライゼーションの終了時に、スライドを割らずにチャンバーを慎重に取り出し、細胞を冷やしてPBSをすすいだ。PBSで4%BSAを4°Cで30分間冷やしてすすった細胞をブロックし、続いてPBSで0.1%BSAの適切なポリクローナル一次抗体をインキュベートし、摂氏4度で1時間ブロックします。インキュベーションの終わりに、新鮮なPBSで細胞を3回洗浄し、FISH検出抗体と互換性のあるフルオロフォリックと相溶した適切な二次抗体で細胞を摂氏4度でインキュベートします。実演したように3回のPBSを流した後、サンプルをPBSで4%ホルムアルデヒドで10〜15分間再び固定してから、実証したように2回目のパーメアブライゼーションを行います。次に、スライドをアルミホイルで覆い、蛍光シグナルを保持し、光の漂白を防ぎます。そして、45マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液を塗布する前に、クエン酸2x生理食塩水ナトリウムで細胞を洗浄する。加湿チャンバーで摂氏37度で1時間後、目的のアンチセンスオリゴヌクレオチドに蒸留水を加え、変性体積を10マイクロリットルにします。オリゴヌクレオチドを摂氏95度で5分間変性し、スライド当たり35マイクロリットルの新鮮なハイブリダイゼーション溶液を添加する。その後、ホイルで保護された37°Cで加湿チャンバーで10〜24時間からサンプルをインキュベートします。翌日、細胞を2分10分で洗います。2X生理食塩水ナトリウムは室温で洗浄し、続いて1X生理食塩水ナトリウムで1回、摂氏25度で1回洗浄する。最後の洗浄後、PBSで4%ホルムアルデヒドを冷やして、氷の上で10〜15分間、新鮮なPBSで3回洗浄して細胞を固定します。次に、サンプルを実証したように透過させ、続いてPBSで抗ジオキシゲニンFTCとプレチルド0.1%BSAを摂氏4度で1時間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、新鮮なPBXでスライドを3回洗い、PBSで予め冷やした4%パラホルムアルデヒドでサンプルを摂氏4度で10〜15分間固定します。PBSで3回のスベッシュを行った後、核にDAPIの1ミリリットル当たり0.4マイクログラム、PBSで0.5%トリトン-Xを氷上で15分間冷やしてから、PBSで3回の最終打ち水を付けます。蛍光ビーズでスライドを取り付け、実験的に関連し、適切な実装媒体に取り付けます。無菌ワイプで余分な取り付け媒体を取り除いた後、透明なマニキュアの複数のコートで各スライドに1つのカバースリップをシールし、蛍光顕微鏡を使用して実験の成功を確認します。画像は、630倍の倍率で、取り付けから1週間以内にサンプルの画像を収集するために共焦点顕微鏡で撮影することができます。これらの代表的FISHおよび免疫蛍光の結果は、半定量的であり、異なる蛍光染色の強度間の比較ではなく、オリゴヌクレオチドの局在化に関する洞察を提供する。なぜならこれらの実験はスライド調製物に蛍光ビーズを含まなかったからである。これらの実験では、細胞質および核領域とその比率は、潜在的および、そして、そして、キミチンのKSHV感染細胞のために異なっていた。この図に示すように、面積はヌクレオシプラズム比で制御される。KSHV DNAの複製が、そのリンパ相において阻害されると、KSHVオリゴヌクレオチド転写産物の初期のタンパク質は、主に細胞質局在に移行する。しかし、KSHVポリアデニル化RNAは、ウイルスDNA複製の阻害にもかかわらず、特定の核部位に局部的に局部化する。スライドからチャンバーを取り外すときは、工具に接着残留物がほとんどないので注意し、エタノールを使用して細胞を透過させ、接着剤を弱めます。QPCR、ウェスタンブロット、ハイスループットシーケンシングなどの生化学的アッセイは、マイクログラフから収集された定量データを増強するために並行して実行することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

その場テトラマー染色やin situハイブリダイゼーション（ISTH）で組み合わせる手法は可視化、マッピングおよび分析、そのウイルスに感染したターゲットへのウイルス特異的CD8 +...

同時にウイルス特異的CD8 + T細胞やウイルス感染細胞を可視化するテクニックその場で</em

宿主細胞因子がカポジ肉腫（KS）の確立と維持において重要な役割を果たす。我々は、KSHV感染DMVEC細胞に、とKS腫瘍組織に改変宿主細胞因子を特定する方法の概要を示します。ウイルスによって変更さ細胞の遺伝子は、新規な治療のための潜在的なターゲット（複数可）として機能します。...

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）によって誘発される調節不全遺伝子を特定

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

このビデオでは、MCPyVビリオンに感染した細胞をin situハイブリダイゼーション連鎖反応にかけ、MCPyV特異的なゲノムを検出しました。さらに、DNA-HCR技術をFISHと組み合わせて、感染したヒト皮膚細胞のMCPyV...

HCR-DNA FISH:感染細胞中のウイルスDNAを検出するための蛍光In Situハイブリダイゼーション技術

このビデオでは、SARS-CoV-2サブゲノムRNAの空間分布を可視化するためのHybridization Chain Reaction(HCR)-Fluorescence In Situ...

Immuno-RNA Fluorescence In Situ ハイブリダイゼーションを使用した SARS-CoV-2 の可視化

我々は、動物モデルの組織切片内の永続的なDNAウイルスゲノムの検出のためのin situハイブリダイゼーションプロトコルにおいて蛍光を確立した。このプロトコルは、ウイルスゲノムのcodetection、そのRNA産物、および単一細胞内のウイルスまたは細胞タンパク質によって感染プロセスを研究できます。...

蛍光による神経組織の持続的なDNAウイルスのゲノム転写物の検出その場でハイブリダイゼーションは、免疫染色と組み合わせる

カポジ肉腫 (KS)、発癌性ウイルス ヘルペス ウイルス 8/KS ヒトヘルペス ウイルス (HHV-8/KSHV) 感染により誘導される腫瘍であります。ここで説明した内皮細胞培養モデルは KSHV...

カポジ肉腫ヘルペス ウイルスによる細胞変換を勉強するための in Vitroモデル

ウイルスの転写工場は、濃縮されている細胞の RNA ポリメラーゼ II は再活性化の中にウイルスの遺伝子の転写を増加する離散構造です。ここでは、積極的に蛍光染色し、その場でRNA の交配の組み合わせによってウイルス クロマチン核の 3 D...

3 D 蛍光顕微鏡を用いたウイルス転写工場の機能イメージング

ここで紹介するのは、蛍光イメージングアプローチのためのプロトコルであり、DNA、RNA、およびpロテイン(MICDDRP)の究極の蛍光immuno蛍光c...

ウイルスの核酸とタンパク質を視覚化し、HIV、HTLV、HBV、HCV、ジカウイルス、インフルエンザ感染を監視するためのシングルセルマルチプレックス蛍光イメージング

このプロトコルは、BAC16由来のビリオンを使用して、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスのde novo溶解感染をモデル化するin...

無細胞カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスによる De Novo 溶解性感染の確立と定量化

学ぶFISHと免疫蛍光法を用いたKSHV感染細胞におけるウイルスRNAの可視化と定量解析。この手法は宿主細胞内でのヘルペスウイルス遺伝子産物の時間的調節を定量的に評価し、ウイルス学および細胞生物学研究に有用です。

KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

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