KSHV感染細胞における特定遺伝子産物の高量蛍光ハイブリダイゼーション(FISH)と免疫蛍光(IF)における定量蛍光

このプロトコルは、特にヘルペスウイルスに関連して、宿主細胞の文脈内で、ウイルス遺伝子産物の時間的調節に関する定量的洞察を得るのに役立つ。この技術は、宿主およびウイルスRNAおよびタンパク質の両方に関連する研究上の質問に対処するのに役立ちます。さらに、この技術は同時生化学的アッセイと互換性がある。

8つのチャンバースライドに細胞を付着させるために、無菌、8つのチャンバースライドの各チャンバーに200マイクロリットルの固有の細胞懸濁液を塗布し、摂氏37度で12〜24時間、摂氏5%の二酸化炭素で種子増殖を可能にする。インキュベーションの終わりに、上清および未結合の細胞を吸引し、PBS上で4%ホルムアルデヒドを氷上で冷やして30分間直します。固定の終わりに、1回の洗浄につき4°CのPBSの200マイクロリットルで3、5分の洗浄で細胞を洗浄します。

最後の洗浄後、PBSあたり200マイクロリットルのプレチルド0.5%トリトン-XをPBSで、氷の上で10分間透過させます。パーメアビライゼーションの終了時に、スライドを割らずにチャンバーを慎重に取り出し、細胞を冷やしてPBSをすすいだ。PBSで4%BSAを4°Cで30分間冷やしてすすった細胞をブロックし、続いてPBSで0.1%BSAの適切なポリクローナル一次抗体をインキュベートし、摂氏4度で1時間ブロックします。

インキュベーションの終わりに、新鮮なPBSで細胞を3回洗浄し、FISH検出抗体と互換性のあるフルオロフォリックと相溶した適切な二次抗体で細胞を摂氏4度でインキュベートします。実演したように3回のPBSを流した後、サンプルをPBSで4%ホルムアルデヒドで10〜15分間再び固定してから、実証したように2回目のパーメアブライゼーションを行います。次に、スライドをアルミホイルで覆い、蛍光シグナルを保持し、光の漂白を防ぎます。

そして、45マイクロリットルのハイブリダイゼーション溶液を塗布する前に、クエン酸2x生理食塩水ナトリウムで細胞を洗浄する。加湿チャンバーで摂氏37度で1時間後、目的のアンチセンスオリゴヌクレオチドに蒸留水を加え、変性体積を10マイクロリットルにします。オリゴヌクレオチドを摂氏95度で5分間変性し、スライド当たり35マイクロリットルの新鮮なハイブリダイゼーション溶液を添加する。

その後、ホイルで保護された37°Cで加湿チャンバーで10〜24時間からサンプルをインキュベートします。翌日、細胞を2分10分で洗います。2X生理食塩水ナトリウムは室温で洗浄し、続いて1X生理食塩水ナトリウムで1回、摂氏25度で1回洗浄する。

最後の洗浄後、PBSで4%ホルムアルデヒドを冷やして、氷の上で10〜15分間、新鮮なPBSで3回洗浄して細胞を固定します。次に、サンプルを実証したように透過させ、続いてPBSで抗ジオキシゲニンFTCとプレチルド0.1%BSAを摂氏4度で1時間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、新鮮なPBXでスライドを3回洗い、PBSで予め冷やした4%パラホルムアルデヒドでサンプルを摂氏4度で10〜15分間固定します。

PBSで3回のスベッシュを行った後、核にDAPIの1ミリリットル当たり0.4マイクログラム、PBSで0.5%トリトン-Xを氷上で15分間冷やしてから、PBSで3回の最終打ち水を付けます。蛍光ビーズでスライドを取り付け、実験的に関連し、適切な実装媒体に取り付けます。無菌ワイプで余分な取り付け媒体を取り除いた後、透明なマニキュアの複数のコートで各スライドに1つのカバースリップをシールし、蛍光顕微鏡を使用して実験の成功を確認します。

画像は、630倍の倍率で、取り付けから1週間以内にサンプルの画像を収集するために共焦点顕微鏡で撮影することができます。これらの代表的FISHおよび免疫蛍光の結果は、半定量的であり、異なる蛍光染色の強度間の比較ではなく、オリゴヌクレオチドの局在化に関する洞察を提供する。なぜならこれらの実験はスライド調製物に蛍光ビーズを含まなかったからである。これらの実験では、細胞質および核領域とその比率は、潜在的および、そして、そして、キミチンのKSHV感染細胞のために異なっていた。

この図に示すように、面積はヌクレオシプラズム比で制御される。KSHV DNAの複製が、そのリンパ相において阻害されると、KSHVオリゴヌクレオチド転写産物の初期のタンパク質は、主に細胞質局在に移行する。しかし、KSHVポリアデニル化RNAは、ウイルスDNA複製の阻害にもかかわらず、特定の核部位に局部的に局部化する。

スライドからチャンバーを取り外すときは、工具に接着残留物がほとんどないので注意し、エタノールを使用して細胞を透過させ、接着剤を弱めます。QPCR、ウェスタンブロット、ハイスループットシーケンシングなどの生化学的アッセイは、マイクログラフから収集された定量データを増強するために並行して実行することができます。