ラット表皮と真皮をサーモリジンと分離して、部位特異的炎症性mRNAおよびタンパク質を検出する
2021年9月29日
ここで提示される、表皮を真皮から分離し、炎症性メディター産生を評価するためのプロトコルである。炎症に続いて、ラット後足表皮は、4°Cでサーモリシンによって真皮から分離される。 次に、表皮を、ウエスタンブロットおよび免疫染色法によるRT-PCRおよびタンパク質評価によるmRNA解析に使用する。
我々のプロトコルは、皮膚炎症時の炎症性メディエーターおよびニューロトロフィンの部位特異的産生を決定するための使いやすく、安価な表皮皮膚分離技術である。この技術の主な利点は、真皮からの表皮の酵素分離が摂氏4度で行われ、mRNAとタンパク質の完全性を維持することです。この方法は、新たな治療介入の開発のための急性および慢性炎症の間に原発性の不感性末端を感作するメディエーターの種類に関する洞察を提供する。
創傷治癒、皮膚疾患、慢性創傷、および火傷は、この研究の恩恵を受ける可能性があります。そして、この方法は、GI管および角膜のような他の上皮表面に適用することができる。最適な分離時間は、ラボ間で若干異なる場合があります。
分離の質を決定するために、異なる時点を2D形態評価と組み合わせた予備的な実験をお勧めします。8~9週齢のスプレイグ・ドーリーラットの麻酔でペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、PBSで希釈した1Xラムダカラギーナンの100マイクロリットルで右グラブロス後足を皮下注射する。カリパーを使用して、注射の直前と6時間と12時間後に後足の中足骨の厚さを測定し、刺激に応答して浮腫の体積を決定します。
適切な実験エンドポイントでは、鋭いメスを使用して注入された足からグラブロス後足の皮膚を1ミリメートルずつ収穫し、マイクロディセクション鉗子を使用して氷上のマイクロ遠心チューブ内の冷たいDMEMの1ミリリットルに皮膚を15〜60分間移します。組織がインキュベートしている間に、氷の上の24ウェル細胞培養プレートの10個の井戸に作りたての活性化サーモリシンを1ミリリットル加えます。インキュベーションの最後に、マイクロ解離鉗子を使用して、溶液中にサンプルを浸すことなく、活性化サーモリシン、角層側の各ウェルに1つの皮膚サンプルを移管する。
皮膚がサーモリシンに浸からず、角層が直面して効果的な分離を達成することが重要です。2〜3時間後、マイクロ解剖鉗子を使用して、1つの皮膚サンプルをペトリ皿に7〜8ミリリットルの摂氏DMEMに浸し、表皮が真皮から分離する余地を増やします。鉗子を使用して、サンプルの境界で半透明の表皮が観察されるまで、皮膚の周囲の表皮を優しく磨きます。
表皮が真皮から著しく分離する場合、皮膚の各層を1組の鉗子で慎重に把握し、真皮から表皮をゆっくりと引っ張り出し、次に、光顕微鏡で単離された表皮の半透明を評価し、光学的に一貫していることを確認する。層が適切に分離されている場合は、表皮組織と真皮組織をDMEMの5ミリモルEDTAの個々の容器に30分間摂氏4度で配置します。サーモリシンが失活した後、攪拌で室温で1時間、表皮の一部を適切な固定剤で固定する。
インキュベーションの終わりに、固定組織をPBSに10%スクロースに入れ、攪拌で室温で1時間、切断に適した組織埋め込みマトリックスでサンプルを凍結する前に行う。クライオスタットを使用して厚さ14マイクロメートルの断面を得て、ゼラチンコーティングガラス顕微鏡スライドにセクションを解凍します。スライドウォーマーで乾燥した後、90秒間トルイジンブルーの作業溶液でサンプルを染色します。
その後、PBSでスライドからトルイジンブルーを静かに洗浄し、水性取り付け媒体でカバーリップに反対し、50〜250倍の倍率でブライトフィールド顕微鏡で表皮を観察します。ラット後足へのカラギーナン注射は、注射後6時間と12時間の両方で発赤や浮腫などの炎症の古典的な症状を引き起こす。ブライトフィールド顕微鏡は、ラットグラブロス後足の皮膚の表皮と真皮のサーリシン分離の有効性を評価するために使用することができる。
実際、表皮断面のトルイジンブルー染色は、表皮がベースライン膜の真皮から分離されているが、表皮レテ尾根および真皮乳頭からの痕直しがそのまま残っていることを示している。また、ケラチノサイト細胞層の全てが観察される。サーモリシン分離表皮のウェスタンブロッティングは一貫した結果を生じ、4°Cの技術の間に安定したタンパク質レベルを示す。
ナイーブラット表皮ではNGFタンパク質が検出されることはほとんどありませんが、6時間のカラギーナン誘発炎症の後、NGFタンパク質レベルは有意にアップレギュレートされます。注射の12時間後、NGFレベルは6時間で観察されたものに比べて低下するが、対照に対して上昇したままである。ウェスタンブロット分析から予想されるように、NGF免疫反応性は、ナイーブコントロール表皮組織サンプルでは検出されないが、カラギーナン誘発炎症後6時間で、NGF免疫反応性は、角層および角層の角質細胞のほとんどで観察される。
尖塔内の細胞もNGF免疫反応性である。サーモリシンを使用して無傷の表皮を分離する場合、最適な分離時間はエンドユーザーが経験的に決定しなければならないことを覚えておくことが重要です。様々なプロテオミクスおよび分子技術を用いて、特定のタンパク質および/または一次遺伝子の転写産物の発現を検証し、この手順が基礎的発現を変化させないことを確認することができる。
この表皮-真皮分離の技術は、研究者が異なる皮膚炎症性モデルにおける神経トロフィンおよび炎症性メディエーターの部位特異的発現に関する追加の質問に答えることを可能にする。ピク酸とパラホルムアルデヒドは危険です。ヒュームフードの両方の化学物質で作業し、個人的な防護服や手袋を使用し、取り扱い後に顔と手を洗います。
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概要
このプロトコルは、炎症性メディエーター産生を評価するために表皮を真皮から分離する効率的な方法を概説しています。この技術は、4 ℃でサーモリジンを使用してmRNAとタンパク質の完全性を保存し、その後の分析に使用します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 炎症生物学
- 皮膚科学
背景
- 炎症性メディエーターを理解することは、治療介入を開発する上で重要です。
- 皮膚の炎症は慢性創傷や火傷など、様々な状態に影響を与えます。
- 生物学的サンプルの完全性を維持することは、正確な分析に不可欠です。
- この方法は他の上皮組織に適応できます。
研究の目的
- 皮膚の炎症時の部位特異的な炎症性メディエーター産生を評価すること。
- 炎症に対するニューロトロフィン産生についての洞察を提供すること。
- 新しい治療戦略につながる可能性のある研究を促進すること。
使用された方法
- サーモリジンを用いた表皮と真皮の酵素分離。
- 4 ℃で分離を行い、mRNAとタンパク質の完全性を保存。
- RT-PCRによるmRNAの分析。
- ウェスタンブロットと免疫組織化学によるタンパク質評価。
主要な結果
- サンプルの完全性を維持しながら表皮と真皮の成功的な分離。
- 一次求心性終末を感作する炎症性メディエーターの同定。
- 創傷治癒と皮膚疾患研究への潜在的な応用。
- この方法は、GI tractなどの他の上皮表面にも適応可能。
結論
- このプロトコルは、皮膚の炎症反応を研究するための信頼できる方法を提供します。
- 得られた洞察は、皮膚関連の状態に対する治療アプローチに情報を提供する可能性があります。
- さらなる研究により、最適な分離時間の研究所間の違いを探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Site-specific separation of rat epidermis and dermis using cold thermolysin enables precise quantification of inflammatory mRNA and protein in distinct skin layers. This workflow supports mechanistic de-risking and target validation for inflammatory mediators and neurotrophins relevant to dermatological and wound-healing research. The protocol's preservation of molecular integrity at low temperatures enhances predictive confidence for downstream translational studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of site-specific inflammatory mediator and neurotrophin expression in skin injury models.
- Supports biological de-risking by maintaining mRNA and protein integrity during tissue separation.
- Facilitates functional target validation for mediators implicated in acute and chronic inflammation.
- Improves predictive confidence for advancing skin inflammation targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact epidermal and dermal samples for quantitative molecular assays.
- Enables reproducible RT-PCR, western blot, and immunohistochemistry analyses of separated layers.
- Supports assay standardization by preserving tissue architecture and molecular content.
- Provides reliable biological material for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for skin inflammation, wound healing, and sensitization.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of inflammatory biomarkers.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust molecular readouts.
- Facilitates adaptation to other epithelial tissues, broadening translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling precise molecular analysis of skin layers following inflammatory challenge.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for mediator localization and pathway involvement in skin inflammation.
- Screening: Provides standardized, reproducible samples for quantitative molecular assays.
- Analytics: Delivers robust mRNA and protein measurements for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects site-specific molecular changes to disease-relevant endpoints in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to various epithelial tissues and inflammatory models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in skin inflammation research.
- Operational Value: Standardizes tissue separation and molecular analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program applicability in dermatology and inflammation portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, enzymatic digestion, and molecular analysis.
- Needs access to cold incubation, microdissection tools, and analytical platforms for RT-PCR and western blotting.
- Demands cross-team standardization of separation times and quality control via morphology evaluation.
- Adaptable to other epithelial tissues with empirical optimization of separation parameters.
- Optimal separation time and tissue handling must be empirically determined for each lab setting.
