Name: ラット表皮と真皮をサーモリジンと分離して、部位特異的炎症性mRNAおよびタンパク質を検出する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学ぶサーモリジンを用いたラット表皮・真皮分離法。mRNAとタンパク質の保全性を保ちながら、部位特異的な炎症性メディエーターと神経栄養因子の産生を評価する。創傷治癒や皮膚疾患研究に応用可能。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究のための資金は、国立衛生研究所NIH-AR047410(KEM)によって提供されました

このプロトコルは、オクラホマ州立大学保健科学センターIACUC(#2016-03)の動物ケアガイドラインに従います。
1. カラギーナンによる炎症(C-II)
<ol><li>イゾフルラン(または注射麻酔薬)で男性および/または雌のスプレイグ・ドーレーラット(200〜250 g;8〜9週齢)を麻酔する。</li>
<li>角膜に触れ、左後足を軽くつまんで麻酔の深さを確認します。動物が適切に麻酔を受けると、角膜や足の応答は認められない。</li>
<li>皮下に右グラブロスを注入し、100μLの100μLの後足(w/v)λ-カラギーナンをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)20に希釈した。<ol><li>このレポートでは、イオブルランを含まないナイーブラットなど、適切なコントロールが使用されていることを確認してください。予備的研究は、イオブルランの有無にかかわらずナイーブラットが表皮IL-6およびNGFの同じ基底発現を有することを示す。 注:ナイーブラットは、皮下生理食音またはPBSが局所炎症23、37を引き起こすので、炎症研究のための好ましいコントロールである。</li></ol>
</li>
<li>C-IIラットの浮腫を評価してカラギーナンの有効性を保証する(図1)20.後足の中足骨の厚さをキャリパーで測定して浮腫の量を決定します。</li>
<li>6-12時間で、CO2( または注射麻酔の過剰摂取)でラットを安楽死させ、鋭いメスでグラブラス後足の皮膚の1ミリメートルx 2mm部分を切断します。毛むくじゃらの皮膚を使用する場合は、1mm x 2mmの皮膚部分を切断する前に剃ります。 注: 特定のスタディに従って適切なタイムポイントが選択されていることを確認します。</li>
<li>マイクロディセクショニング鉗子を使用して、氷の上のマイクロ遠心分離管内の冷たいダルベッコの修正イーグルミディアム(DMEM)の1mLに皮膚を移し、15〜60分間冷たく保ちます。</li></ol>表皮と真皮のサーモリシン分離
<ol><li>サーモリシンを準備し、活性化します。<ol>
<li>10 mLの PBSに5mgのジオバチルス・ステアサーモフィルス を加えて、pH= 8(濃度500μg/mL)で、サーモリシンの溶液を調製する。</li>
<li>1.11gを蒸留したH2Oの10mLに加えて、塩化カルシウム(CaCl2無水)の1M溶液を調製する。</li>
<li>サーモリシンの自己溶解を防ぐには、10 mLのサーリシン溶液に塩化カルシウム10μLを加えます。塩化カルシウムの最終濃度は1mMとなります。</li>
<li>アリコート1mLの活性化サーモリシンを氷上の24ウェル細胞培養プレートの10個のウェルに入す。</li>
</ol></li>
<li>サーモリシン酵素消化を使用して、表皮を真皮から分離します。<ol>
<li>マイクロディスセクション鉗子を使用して、活性化されたサーモリシンの各ウェルに1つの皮膚サンプルを移す。サーモリジン溶液に皮膚を浸さないようにしてください。</li>
<li>ウェルの側面の皮膚を軽くタップして、鉗子から皮膚サンプルを放出し、サーリシン溶液に浮かべるのを助けます。</li>
<li>角 層 (外表皮)側を上にして真皮を下に向けてサーモリシン溶液に皮膚を浮かべます。真皮が下に向かうか、効果的な分離が起されないことが重要です。 注: サーモリジンインキュベーションの時間は、エンドユーザーが経験的に決定する必要があります。グラブロウス、後足の皮膚は、スプレイグ・ドーレーラット(200〜250 g;8-9週齢)で、分離のために2.0~2.5時間を要する。インキュベーション時間は種や年齢によって異なると予想されます。</li>
<li>サーモリシンで適切なインキュベーション時間を過ごした後、マイクロディスセクション鉗子を使用して、1つの皮膚サンプルを7〜8 mLの冷たい(4°C)DMEMを備えた6ウェル細胞培養プレートのウェルに移します。これにより、真皮から表皮を分離する余地が増えます。</li>
<li>皮膚をDMEMに浸します。</li>
<li>半透明の表皮が境界で観察されるまで、皮膚の周囲の鉗子で表皮をそっと磨きます。これが達成できない場合は、皮膚サンプルをサーリシン溶液に戻して、さらに15〜30分間戻してください。</li>
<li>表皮が真皮から顕著に分離したら、その後、慎重にマイクロ解剖鉗子で表皮と真皮の両方を保持し、非常にゆっくりと真皮から表皮を引っ張る。</li>
<li>分離した表皮の透過性を評価し、光学的に一貫性があることを確認します。ラット表皮の1mm x 2mmサンプルの例については 、図2 を参照してください。半透明性にばらつきがある場合、適切な分離は起こっていない。</li>
</ol></li>
<li>表皮と真皮の分離片にエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を用いた熱分解を不活性化する。 注意:表皮や真皮に残るサーモリジンは依然として活性であり、不活性化しないと層に損傷を与える可能性があります。<ol>
<li>0.5 M EDTA ストックソリューションを準備します。これを行うには、ゆっくりと2蒸留水の5 mLに0.93 g EDTAを追加します。水酸化ナトリウムを溶液に加え、クリアします。ソリューションの pH が約 8.0 であることを確認します。</li>
<li>DMEMで5 mM EDTA溶液を作ります。0.5 M EDTA ストックソリューションの 0.25 mL を 25 mL の DMEM に追加します。</li>
<li>分離した表皮と真皮を5 mM EDTA/DMEM溶液に4°Cで30分間置き、サーモリジンの活性を失活させます。</li>
</ol></li>
<li>表皮を、ティンストリンジロジー8,9,10で評価する。<ol>
<li>表皮の一部を10%中性ホルマリン、4%パラホルムアルデヒド、または0.25%パラホルムアルデヒドで1.8%のピコン酸溶液を室温(RT)で攪拌して固定します。</li>
<li>固定表皮を10%スクロースにPBSで1時間攪拌してRTに入れる。</li>
<li>断面化のための組織埋め込みマトリックス内の表皮を凍結します。14 μmの断面を、ゼラチンコーティングガラス顕微鏡スライド上にクライオスタットと解凍マウントセクションを使用して切ります。</li>
<li>スライドウォーマー上の乾燥した切片と90 sのためのトルイジンブルー(TB;1%塩化ナトリウムで10%TB)の働く溶液と染色。水性取り付け媒体を使用したカバーリップをアポス。</li>
<li>50x-250xで明視野顕微鏡で表皮を観察します。 注:適切な分離が発生した場合、表皮は真皮からきれいに分割され、5つの層が検出されます: 層バサレ、 尖層、 顆粒層、 角層、角 質 層。分離されたラット皮膚表皮の例は 図3に見ることができる。</li>
</ol></li></ol>3. タンパク質抽出とウェスタンブロット分析
<ol><li>以前に公開されたプロトコル21を使用して分離された組織サンプルに対してウェスタンブロッティングを行う。</li>
<li>ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む50μLのリシスバッファー(25mMトリスHCl、pH=7.4、150mM NaCl、1 mM EDTA、5%グリセロール、および1%トリトンX-100)で表皮を均質化します。</li>
<li>4°Cで15分間の最高速度で遠心分離機サンプルを、タンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度の上清を評価します。</li>
<li>タンパク質の濃度(30μg)をSDSゲルに負荷し、電気泳動を行い、タンパク質をニトロセルロースまたはPVDF膜に移します。</li>
<li>2時間の5%乳を有するブロック膜と一次抗体で一晩インキュベート(マウス抗NGF、E12、1:1000)。</li>
<li>3xをPBSで10分間0.3%トゥイーンで洗浄し、標識された二次抗体(例えば、アルカリホスファターゼ標識ウサギ抗マウスIgG)でインキュベートする。</li>
<li>走査システムを使用して、ウェスタンブロット信号(例えば、ECF基板およびイメージングプラットフォーム)を評価する。</li></ol>4. 免疫検査
<ol><li>最適な免疫反応性のための固定液に組織サンプルを入れる:0.96%(w/v)ピクリン酸および0.2%(w/v)ホルムアルデヒド0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH= 7.321、22、23 FOR 4 h RTで4時間の間、4°CでPBSで10%スクロースに移す。</li>
<li>組織切片21、22、23に標準免疫組織化学を行う。</li>
<li>動物の表皮を単一の凍結ブロックに埋め込み、マトリックスを埋め込み、クライオスタットで10〜30μmのセクションをカットします。ゼラチンコーティングされたガラス顕微鏡スライドにセクションを取り付け、37°Cで2時間乾燥します。</li>
<li>PBSで3、10分のリンスのためのセクションを洗浄し、一次アンチセラで24〜96時間インキュベート、 [例えば、マウス抗NGF(E12、1:2000)]およびウサギ抗タンパク質遺伝子産物9.9(PGP 9.5、1:2000)を0.3%(w/v)トリトンX-100(PBS-T)PBS-T0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)および0.5%ポリピニル(ポリピロン)を含むPBSで希釈した。</li>
<li>一次抗血清インキュベーションの後、PBSで10分間の部分をすすいで、ALEXA Fluor 488ロバ抗ウサギIgG(1:1000)とアレクサフルーター555ロバ抗マウスIgG(1:1000)で1時間インキュベートします。</li>
<li>10分間PBSで3回リンスセクションを、免疫蛍光の退色を遅らせる非フェージング実装媒体とカバースリップを貼付します。</li></ol>5. RNAの単離とcDNA合成
<ol><li>皮膚サンプル21に対して標準の逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行う。フェノール、グアニジンイソチオシアネート溶液を使用して全RNAを単離する。</li>
<li>モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素による相補的DNA合成を行う。</li>
<li>NGF および IL-6 増幅には、次のプライマー シーケンスを使用します。 NGF (センス) - GTGGACCCCAAACTGTッタガーアックッグ NGF (アンチセンス) – GTGAGTCCGTTGTガーガガットGTACCATATAtG IL-6 (センス) - GCAATTCTGTTGTATGAACAGCGATGC; IL-6 (アンチセンス) – グタガーアックガッカガッカガグ</li>
<li>NGF および IL-6 mRNA のレベルをβアクチン ハウスキーピング遺伝子と比較します。 βアクチン(センス) - TGCGTガカッタアガガガグクトグタット β-アクチン(アンチセンス) – ガアッGCTGCCGATAGTATGA</li>
<li>qRT-PCR システムを使用してサーマルサイクラーおよび定量リアルタイム PCR (qRT-PCR) を使用して定性的 RT-PCR を評価します。</li></ol>

<ol><li>Choi, J. E., Di Nardo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+neurogenic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Skin neurogenic inflammation.</a> Seminars in Immunopathology. 40 (3), 249-259 (2018).</li>
<li>Manti, S., Brown, P., Perez, M. K., Piedimonte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neurotrophins+in+inflammation+and+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">The role of neurotrophins in inflammation and allergy.</a> Vitamins and Hormones. 104, 313-341 (2017).</li>
<li>Schäkel, K., Schön, M. P., Ghoreschi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Dermatologie%2C+Venerologie%2C+und+verwandte+Gebiete%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of psoriasis.</a> Zeitschrift für Dermatologie, Venerologie, und verwandte Gebiete. 67 (6), 422-431 (2016).</li>
<li>Zou, Y., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal-epidermal+separation+methods%3A+research+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatological+Research%22%5BJournal%5D)">Dermal-epidermal separation methods: research implications.</a> Archives of Dermatological Research. 310 (1), 1-9 (2018).</li>
<li>Baumberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+separation+of+epidermis+from+dermis+and+some+physiologic+and+chemical+properties+of+isolated+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Methods for the separation of epidermis from dermis and some physiologic and chemical properties of isolated epidermis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 2, 413-423 (1942).</li>
<li>Felsher, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+adherence+of+the+epidermis+to+the+corium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Studies on the adherence of the epidermis to the corium.</a> Journal of Investigative Dermatology. 8, 35-47 (1947).</li>
<li>Einbinder, J. M., Walzer, R. A., Mandl, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal-dermal+separation+with+proteolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Epidermal-dermal separation with proteolytic enzymes.</a> Journal of Investigative Dermatology. 46, 492-504 (1966).</li>
<li>Rakhorst, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+keratinocyte+isolation%3A+a+short+comparative+study+on+thermolysin+and+dispase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Association+of+Oral+and+Maxillofacial+Surgeons%22%5BJournal%5D)">Mucosal keratinocyte isolation: a short comparative study on thermolysin and dispase.</a> International Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 35 (10), 935-940 (2006).</li>
<li>Tschachler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sheet+preparations+expose+the+dermal+nerve+plexus+of+human+skin+and+render+the+dermal+nerve+end+organ+accessible+to+extensive+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Sheet preparations expose the dermal nerve plexus of human skin and render the dermal nerve end organ accessible to extensive analysis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 122 (1), 177-182 (2004).</li>
<li>Walzer, C., Benathan, M., Frenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermolysin+treatment-a+new+method+for+dermo-epidermal+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Thermolysin treatment-a new method for dermo-epidermal separation.</a> Journal of Investigative Dermatology. 92, 78-81 (1989).</li>
<li>Anderson, M. B., Miller, K. E., Schechter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rat+epidermis+and+dermis+following+thermolysin+separation%3A+PGP+9.5+and+Nav+1.8+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Abstract%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rat epidermis and dermis following thermolysin separation: PGP 9.5 and Nav 1.8 localization.</a> Society for Neuroscience Abstract. 584 (9), (2010).</li>
<li>Ibitokun, B. O., Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+corneal+epithelium+from+the+stroma+using+thermolysin%3A+evaluation+of+corneal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Abstract%22%5BJournal%5D)">Separation of corneal epithelium from the stroma using thermolysin: evaluation of corneal afferents.</a> Society for Neuroscience Abstract. , 584(2010).</li>
<li>Nawani, P., Anderson, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-property+relationship+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Oklahoma+Center+for+Neuroscience+Symposium+Abstract%22%5BJournal%5D)">Structure-property relationship of skin.</a> Oklahoma Center for Neuroscience Symposium Abstract. , # 17 (2011).</li>
<li>Anderson, M. B., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-epidermal+nerve+fiber+reconstruction+and+quantification+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Abstract%22%5BJournal%5D)">Intra-epidermal nerve fiber reconstruction and quantification in three-dimensions.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23(2017).</li>
<li>Gujar, V. K. E., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+nerve+growth+factor+in+adjuvant-induced+arthritis+%28AIA%29%3A+A+temporal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience+Abstract%22%5BJournal%5D)">Expression of nerve growth factor in adjuvant-induced arthritis (AIA): A temporal study.</a> Society for Neuroscience Abstract. 220, 23(2017).</li>
<li>Vinegar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((to+carrageenan-induced+inflammation+in+the+hind+limb+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">to carrageenan-induced inflammation in the hind limb of the rat.</a> Federation Proceedings. 46 (1), 118-126 (1987).</li>
<li>Fehrenbacher, J. C., Vasko, M. R., Duarte, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+inflammation%3A+Carrageenan-+or+complete+Freund%27s+Adjuvant+%28CFA%29-induced+edema+and+hypersensitivity+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Models of inflammation: Carrageenan- or complete Freund's Adjuvant (CFA)-induced edema and hypersensitivity in the rat.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 5, Unit 5.4 (2012).</li>
<li>Li, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((exerts+its+anti-inflammatory+effects+associated+with+suppressing+ERK%2Fp38+MAPK+and+Heme+Oxygenase-1+activation+in+lipopolysaccharide-stimulated+RAW+264.7+macrophages+and+carrageenan-induced+mice+paw+edema%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">exerts its anti-inflammatory effects associated with suppressing ERK/p38 MAPK and Heme Oxygenase-1 activation in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages and carrageenan-induced mice paw edema.</a> International Immunopharmacology. 54, 366-374 (2018).</li>
<li>Sammons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carrageenan-induced+thermal+hyperalgesia+in+the+mouse%3A+role+of+nerve+growth+factor+and+the+mitogen-activated+protein+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Carrageenan-induced thermal hyperalgesia in the mouse: role of nerve growth factor and the mitogen-activated protein kinase pathway.</a> Brain Research. 876 (1-2), 48-54 (2000).</li>
<li>Hoffman, E. M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+inhibition+of+glutaminase+reduces+carrageenan+induced+Fos+expression+in+the+superficial+dorsal+horn+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Peripheral inhibition of glutaminase reduces carrageenan induced Fos expression in the superficial dorsal horn of the rat.</a> Neuroscience Letters. 472 (3), 157-160 (2010).</li>
<li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Spencer, D., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+glutaminase+and+vesicular+glutamate+transporter+type+2+immunoreactivity+in+rat+sacral+dorsal+root+ganglia+following+a+surgical+tail+incision%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacy+and+Pharmacology+International+Journal%22%5BJournal%5D)">Expression of glutaminase and vesicular glutamate transporter type 2 immunoreactivity in rat sacral dorsal root ganglia following a surgical tail incision.</a> Pharmacy and Pharmacology International Journal. 2 (3), 00023(2015).</li>
<li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixative+composition+alters+distributions+of+immunoreactivity+for+glutaminase+and+two+markers+of+nociceptive+neurons+Nav1.8+and+TRPV1%2C+in+the+rat+dorsal+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixative composition alters distributions of immunoreactivity for glutaminase and two markers of nociceptive neurons Nav1.8 and TRPV1, in the rat dorsal ganglion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Hoffman, E. M., Zhang, Z., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaminase+increases+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+after+unilateral+adjuvant-induced+hind+paw+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Glutaminase increases in rat dorsal root ganglion neurons after unilateral adjuvant-induced hind paw inflammation.</a> Biomolecules. 6 (1), 10(2016).</li>
<li>van den Burg, B., Eijsink, V. Thermolysin and related Bacillus metallopeptidases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+den+Burg%2C+B+%22Handbook+of+Proteolytic+Enzymes%22">Handbook of Proteolytic Enzymes</a>. , Volume 1, Chapter 111 540-553 (2013).</li>
<li>Matthews, B. W. Thermolysin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthews%2C+BW+%22Encyclopedia+of+Inorganic+and+Bioinorganic+Chemistry%22">Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry</a>. , (2011).</li>
<li>Hybbinette, S., Boström, M., Lindberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+of+keratinocytes+from+human+skin+biopsies+for+in+vitro+cell+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation.</a> Experimental Dermatology. 8 (1), 30-38 (1999).</li>
<li>Glade, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+flow+cytometric+characterization+of+epidermal+cell+suspensions+prepared+from+normal+and+hyperproliferative+human+skin+using+an+optimized+thermolysin-trypsin+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatological+Research%22%5BJournal%5D)">Multiparameter flow cytometric characterization of epidermal cell suspensions prepared from normal and hyperproliferative human skin using an optimized thermolysin-trypsin protocol.</a> Archives of Dermatological Research. 288 (4), 203-210 (1996).</li>
<li>Sato, J. D., Kan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+for+culture+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Media for culture of mammalian cells.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1: Unit 1.2 (2001).</li>
<li>Gragnani, A., Sobral, C. S., Ferreira, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermolysin+in+human+cultured+keratinocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Biology%22%5BJournal%5D)">Thermolysin in human cultured keratinocyte isolation.</a> Brazilian Journal of Biology. 67 (1), 105-109 (2007).</li>
<li>Germain, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+human+keratinocyte+isolation+and+culture+using+thermolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin.</a> Burns. 19 (2), 99-104 (1993).</li>
<li>Michel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+new+tissue-engineered+human+skin+equivalent+with+hair%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 35 (6), 318-326 (1999).</li>
<li>Fassina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autolysis+of+thermolysin.+Isolation+and+characterization+of+a+folded+three-fragment+complex%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Autolysis of thermolysin. Isolation and characterization of a folded three-fragment complex.</a> European Journal of Biochemistry. 156 (2), 221-228 (1986).</li>
<li>Petho, G., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+and+signaling+mechanisms+of+bradykinin%2C+eicosanoids%2C+platelet-activating+factor%2C+and+nitric+oxide+in+peripheral+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sensory and signaling mechanisms of bradykinin, eicosanoids, platelet-activating factor, and nitric oxide in peripheral nociceptors.</a> Physiological Reviews. 92 (4), 1699-1775 (2012).</li>
<li>Djouhri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+nerve+growth+factor+dependence+of+inflammation-induced+alterations+in+electrophysiological+membrane+properties+in+nociceptive+primary+afferent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Time course and nerve growth factor dependence of inflammation-induced alterations in electrophysiological membrane properties in nociceptive primary afferent neurons.</a> Journal of Neuroscience. 21 (22), 8722-8733 (2001).</li>
<li>Denk, F., Bennett, D. L., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+pain+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and pain mechanisms.</a> Annual Review of Neuroscience. 40, 307-325 (2017).</li>
<li>Flint, M. S., Dearman, R. J., Kimber, I., Hotchkiss, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+in+situ+localization+of+cutaneous+tumour+necrosis+factor+alpha+%28TNF-alpha%29+and+interleukin+6+%28IL-6%29+following+skin+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Production and in situ localization of cutaneous tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin 6 (IL-6) following skin sensitization.</a> Cytokine. 10 (3), 213-219 (1998).</li>
<li>Crosby, H. A., Ihnat, M., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+toxicity+of+the+analgesic+glutaminase+inhibitor+6-diazo-5-oxo-L-norleucine+in+vitro+and+on+rat+dermal+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22MOJ+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the toxicity of the analgesic glutaminase inhibitor 6-diazo-5-oxo-L-norleucine in vitro and on rat dermal skin fibroblasts.</a> MOJ Toxicology. 1 (1), 00005(2015).</li>
</ol>

著者は開示を持っていません。

この研究では、ラット後ろ足グラブロス皮膚の表皮は、2.5時間4°Cで1mMの塩化カルシウムを用いたPBSのサーモリシン(0.5 mG/mL)を使用して真皮から容易に分離されると判断した。組織学的評価により、表皮は基膜の真皮から分離され、表皮のレテ尾根はそのままであった。サーモライシンは、グラム陽性(ジオ)サーモプロテオリティクス24によって産生される細胞外金属内ペプチダーゼである。その活性は4°Cで安定しているが、温度10、24、25の広い範囲にわたって機能している。この酵素はタンパク質化学24,25に広く用いられてきたが、いくつかの群は表皮および/または真皮シート</s...

皮膚からの炎症性メディエーターおよび神経栄養因子の評価は、炎症を起こした真皮および表皮1、2、3に見られる細胞タイプの不均一性に起因して制限され得る。いくつかの酵素、化学的、熱的、または評価のために細胞解離を行うための2つの層の分離を伴う機械的技術が最近4に見直されている。酸、アルカリ、中性塩、熱は表皮を真皮から素早く分けることができるが、細胞外腫脹は5,6で起こることが多い。トリプシン、膵臓、エラスターゼ、ケラチナーゼ、コラゲナーゼ、プロナーゼ、ディスパーゼ、およびサーリシンは、表皮皮膚分離4、7に使用されてきた酵素である。トリプシンやその他の広いスケールのタンパク質分解酵素は37~40°Cで活性ですが、表皮層の解離を防ぐために注意深くモニタリングする必要があります。ディスパーゼは、薄層デンサで表皮を切断するが、37°C4、9で冷たい4、8または短いタイムポイントで分離するために24時間を必要とする。これらすべての技術の制限的な特徴は、組織形態の潜在的な破壊およびmRNAおよびタンパク質の完全性の喪失である。
mRNAとタンパク質の完全性を維持するために、皮膚分離方法は、短時間の間、寒さの中で行われるべきである。炎症研究のための皮膚分離技術を評価する際に、サーリシンは、寒い温度4で真皮から表皮を分離するのに有効な酵素である。サーモリシンは、4°Cで活性であり、表皮ヘミデスモソームを層のルシダから切断し、表皮を1-3 h4、8、10以内の真皮から分離する。このレポートの目的は、炎症を起こしたラット表皮を真皮から分離して、炎症性メディエーターおよび神経栄養因子のmRNAおよびタンパク質レベルを検出するためのサーモリシンの使用を最適化することです。いくつかの予備的なレポートが提示されています11,12,13,14,15.本稿の目的は、サーモリシンを用いた最適な皮膚分離技術を記述し、1)炎症の1)マーカーの検出を実証することである、2)インターロイキン-6(IL-6)mRNA、および3)神経成長因子(NGF)mRNAおよびカラギーゲン誘導性炎症を有するラットの表皮中のタンパク質(C-II)16,17。完全なフロイントアジュバントモデルを用いた予備報告は、NGF mRNAおよびタンパク質レベルが炎症の間に早期に増加することを示す15。マウスにおいて、オキサゾロンの局所適用による皮膚感作は、その後ハイブリダイゼーション36に使用するIL-6 mRNAの早期上昇を引き起こす。IL-6とNGFはいずれもC-II18,19に関与しているが、C-IIの急性期の表皮から特異的に表皮からmRNAまたはタンパク質レベルを記述する報告はない。
サーモリシン技術は安価で、実行が簡単です。さらに、真皮からの表皮のサーモリシン分離は、炎症の過程におけるmRNA、ウェスタンブロット、および炎症の過程における炎症性メディエーターおよび神経栄養因子の免疫組織化学的分析を可能にする15。研究者は、皮膚の炎症の前臨床および臨床研究の両方でこの技術を簡単に使用できるはずです.

<table><tbody><tr><td>&lambda;-carrageenan</td><td>Millipore Sigma</td><td>22049</td><td>カラギーナンの皮下注射は炎症を誘発します</td></tr><tr><td>7500 高速リアルタイムPCRシステム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4351107</td><td>RT-PCR分析用</td></tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl2)、無水</td><td>ミリポアシグマ</td><td>499609</td><td>サーモリシンの自己消化を防止</td></tr><tr><td>クリスタルマウント水性封入剤</td><td>Millipore Sigma</td><td>C0612</td><td>トルイジンブルー染色後の水性封入剤</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31570</td><td>免疫組織化学の二次抗体</td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>免疫組織化学の二次抗体</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo FisherScientific</td><td>11966-025</td><td>組織の完全性を維持するために</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>ミリポアシグマ</td><td>E6758</td><td>サーモリジン反応を停止</td></tr><tr><td>モロニーマウス白血病ウイルス (M-MLV) 逆転写酵素</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td>相補的DNA合成マウス</td></tr><tr><td>抗NGF抗体 (E-12)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365944</td><td>ニューロトロフィン用免疫組織化学</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止封入剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36930</td><td>消光免疫蛍光を遅らせる</td></tr><tr><td>ウサギ抗PGP 9.5</td><td>シダーレーンラボ</td><td>CL7756AP</td><td>表皮内神経染色用</td></tr><tr><td>SAS Sprague Dawley ラット</td><td>チャールズ川</td><td>ひずみコード 400</td><td>炎症研究に使用される動物</td></tr><tr><td>Shandon M-1 Embedding Matrix</td><td>Thermoフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>1310TS</td><td>チンクトリアルおよび免疫組織化学用組織包埋マトリックス</td></tr><tr><td>SimpliAmp サーマルサイクラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A24811</td><td>RT-PCR分析用</td></tr><tr><td>SYBRセレクトマスターミックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティ</td><td>フィック4472908</td><td>RT-PCR分析用</td></tr><tr>ジオ<td>バチルス・ステアロサーモフィラス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>社製サーモリシンミリポアシグマT7902トルイジンブルー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>89640</td><td>明視野顕微鏡の着色染色用</td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>15596026</td><td>RTPCRの全RNA抽出用</td></tr></tbody></table>

ラット表皮と真皮をサーモリジンと分離して、部位特異的炎症性mrnaおよびタンパク質を検出する

Separation of Rat Epidermis and Dermis with Thermolysin to Detect Site-Specific Inflammatory mRNA and Protein

皮膚損傷、炎症、および/または感作中の炎症性メディエーターおよびニューロトロフィンの部位特異的産生を決定するには、使いやすく安価な技術が必要です。本研究の目的は、4°Cで活性であるプロテイナーゼであるサーモリシンを用いた表皮皮膚分離プロトコルを記述することにある。 この手順を説明するために、スプレイグ・ドーリーラットは麻酔を受け、右後足にはカラギーナンを注射する。注射の6時間と12時間後、炎症とナイーブラットを持つラットは安楽死させられ、後足の一部、グラブルーの皮膚は冷たいダルベッコの修正されたイーグル培地に入れられる。表皮は、次いで、塩化カルシウムを用いてPBSでサーリシンによって真皮から基膜で分離される。次に、真皮はマイクロ解剖鉗子によって固定され、表皮は穏やかにからかわれ、組織切片のトルイジンブルー染色は、表皮が地下膜の真皮からきれいに分離されていることを示す。すべてのケラチノサイト細胞層はそのまま残っており、表皮レテの隆起は、真皮乳頭からのくぼみと共に明らかに観察される。定性的およびリアルタイムRT-PCRは、神経成長因子およびインターロイキン-6発現レベルを決定するために使用されます。最終的に、ウエスタンブロッティングと免疫染色法が行われ、神経成長因子の量を検出します。この報告は、炎症時のmRNAおよびタンパク質変化の評価のために、冷熱酵素消化が真皮から表皮を分離する有効な方法であることを示している。

ラット後足へのカラギーナン注射は、赤みや浮腫16、17などの炎症の古典的な症状を引き起こした。後足の腫れをメカニカルキャリパー20で測定した。カラギーナン処理前に各ラットについて足の厚さのベースライン値を得て、6時間および12時間で再び測定した。足の厚さはベースライン値と比較して有意に増加した(図1)。
ラットグラブロス後足の皮膚のサーモリジンインキュベーションは、表皮のシートを生成しました.明視野顕微鏡を用いて、表皮と真皮のサーモリシン分離の有効性を評価した(図2)。表皮の層は、より高い倍率でシートを通して焦点を合わせながら決定することができる。表皮の断面のトルイジンブルー染色は、表皮が地下膜で真皮から分離されたことを示した(図3)。表皮の...

ここで提示される、表皮を真皮から分離し、炎症性メディター産生を評価するためのプロトコルである。炎症に続いて、ラット後足表皮は、4°Cでサーモリシンによって真皮から分離される。 次に、表皮を、ウエスタンブロットおよび免疫染色法によるRT-PCRおよびタンパク質評価によるmRNA解析に使用する。

ラット表皮と真皮をサーモリジンと分離して、部位特異的炎症性mRNAおよびタンパク質を検出する

Easy-to-use and inexpensive techniques are needed to determine the site-specific production of inflammatory mediators and neurotrophins during skin ...

我々のプロトコルは、皮膚炎症時の炎症性メディエーターおよびニューロトロフィンの部位特異的産生を決定するための使いやすく、安価な表皮皮膚分離技術である。この技術の主な利点は、真皮からの表皮の酵素分離が摂氏4度で行われ、mRNAとタンパク質の完全性を維持することです。この方法は、新たな治療介入の開発のための急性および慢性炎症の間に原発性の不感性末端を感作するメディエーターの種類に関する洞察を提供する。創傷治癒、皮膚疾患、慢性創傷、および火傷は、この研究の恩恵を受ける可能性があります。そして、この方法は、GI管および角膜のような他の上皮表面に適用することができる。最適な分離時間は、ラボ間で若干異なる場合があります。分離の質を決定するために、異なる時点を2D形態評価と組み合わせた予備的な実験をお勧めします。8~9週齢のスプレイグ・ドーリーラットの麻酔でペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、PBSで希釈した1Xラムダカラギーナンの100マイクロリットルで右グラブロス後足を皮下注射する。カリパーを使用して、注射の直前と6時間と12時間後に後足の中足骨の厚さを測定し、刺激に応答して浮腫の体積を決定します。適切な実験エンドポイントでは、鋭いメスを使用して注入された足からグラブロス後足の皮膚を1ミリメートルずつ収穫し、マイクロディセクション鉗子を使用して氷上のマイクロ遠心チューブ内の冷たいDMEMの1ミリリットルに皮膚を15〜60分間移します。組織がインキュベートしている間に、氷の上の24ウェル細胞培養プレートの10個の井戸に作りたての活性化サーモリシンを1ミリリットル加えます。インキュベーションの最後に、マイクロ解離鉗子を使用して、溶液中にサンプルを浸すことなく、活性化サーモリシン、角層側の各ウェルに1つの皮膚サンプルを移管する。皮膚がサーモリシンに浸からず、角層が直面して効果的な分離を達成することが重要です。2〜3時間後、マイクロ解剖鉗子を使用して、1つの皮膚サンプルをペトリ皿に7〜8ミリリットルの摂氏DMEMに浸し、表皮が真皮から分離する余地を増やします。鉗子を使用して、サンプルの境界で半透明の表皮が観察されるまで、皮膚の周囲の表皮を優しく磨きます。表皮が真皮から著しく分離する場合、皮膚の各層を1組の鉗子で慎重に把握し、真皮から表皮をゆっくりと引っ張り出し、次に、光顕微鏡で単離された表皮の半透明を評価し、光学的に一貫していることを確認する。層が適切に分離されている場合は、表皮組織と真皮組織をDMEMの5ミリモルEDTAの個々の容器に30分間摂氏4度で配置します。サーモリシンが失活した後、攪拌で室温で1時間、表皮の一部を適切な固定剤で固定する。インキュベーションの終わりに、固定組織をPBSに10%スクロースに入れ、攪拌で室温で1時間、切断に適した組織埋め込みマトリックスでサンプルを凍結する前に行う。クライオスタットを使用して厚さ14マイクロメートルの断面を得て、ゼラチンコーティングガラス顕微鏡スライドにセクションを解凍します。スライドウォーマーで乾燥した後、90秒間トルイジンブルーの作業溶液でサンプルを染色します。その後、PBSでスライドからトルイジンブルーを静かに洗浄し、水性取り付け媒体でカバーリップに反対し、50〜250倍の倍率でブライトフィールド顕微鏡で表皮を観察します。ラット後足へのカラギーナン注射は、注射後6時間と12時間の両方で発赤や浮腫などの炎症の古典的な症状を引き起こす。ブライトフィールド顕微鏡は、ラットグラブロス後足の皮膚の表皮と真皮のサーリシン分離の有効性を評価するために使用することができる。実際、表皮断面のトルイジンブルー染色は、表皮がベースライン膜の真皮から分離されているが、表皮レテ尾根および真皮乳頭からの痕直しがそのまま残っていることを示している。また、ケラチノサイト細胞層の全てが観察される。サーモリシン分離表皮のウェスタンブロッティングは一貫した結果を生じ、4°Cの技術の間に安定したタンパク質レベルを示す。ナイーブラット表皮ではNGFタンパク質が検出されることはほとんどありませんが、6時間のカラギーナン誘発炎症の後、NGFタンパク質レベルは有意にアップレギュレートされます。注射の12時間後、NGFレベルは6時間で観察されたものに比べて低下するが、対照に対して上昇したままである。ウェスタンブロット分析から予想されるように、NGF免疫反応性は、ナイーブコントロール表皮組織サンプルでは検出されないが、カラギーナン誘発炎症後6時間で、NGF免疫反応性は、角層および角層の角質細胞のほとんどで観察される。尖塔内の細胞もNGF免疫反応性である。サーモリシンを使用して無傷の表皮を分離する場合、最適な分離時間はエンドユーザーが経験的に決定しなければならないことを覚えておくことが重要です。様々なプロテオミクスおよび分子技術を用いて、特定のタンパク質および/または一次遺伝子の転写産物の発現を検証し、この手順が基礎的発現を変化させないことを確認することができる。この表皮-真皮分離の技術は、研究者が異なる皮膚炎症性モデルにおける神経トロフィンおよび炎症性メディエーターの部位特異的発現に関する追加の質問に答えることを可能にする。ピク酸とパラホルムアルデヒドは危険です。ヒュームフードの両方の化学物質で作業し、個人的な防護服や手袋を使用し、取り扱い後に顔と手を洗います。

separation-rat-epidermis-dermis-with-thermolysin-to-detect-site

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この資料では、ラット腸間膜血管新生を刺激するための単純なモデルを説明しています。モデルは、単一細胞レベル全体を微小血管網のEN面の可視化を可能に組織内の比較的短い時間の経過とともに毛細管発芽、血管領域と血管密度の劇的な増加を生成します。...

ラット腸間膜具象化：血管新生に関与する細胞のダイナミクスを調べるためのモデル

皮膚は複雑な免疫細胞ネットワークに生息しています。私たちは、動物の体のさまざまな部分からマウスの皮膚を消化するための効率的な方法論を説明し、単一細胞懸濁液を取得し、フローサイトメトリーによって皮膚に常在するさまざまな白血球集団を分析します。...

別のマウス皮膚の領域から細胞蛍光分析のための単一細胞懸濁液の調製

このプロトコルは、栄養豊富な培地でのマウス皮膚の酵素的消化と、それに続く白血球を分離するための勾配分離について説明しています。...

酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

私たちは、C57Bl/6Jコントロールマウス、タイトスキンマウス、およびIRF5阻害ペプチドで処理したタイトスキンマウスからの心臓細胞外マトリックスの分離について説明します。また、C57Bl/6Jから単離された血管、タイトスキンマウス、およびIRF5阻害ペプチドで処理されたタイトスキンマウスの血管拡張研究についても説明します。...

単離された血管の血管拡張およびタイト皮膚マウスの細胞外マトリックスの単離

ここでは、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ラット腹膜におけるマイクロRNA発現の検出のためのプロトコールを提示する。この方法は、いくつかの病理学的状態におけるラット腹膜におけるマイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。...

定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出

ここでは、下流の RNA 解析のための小柱網 (TM) を隔離するため再現性のあるレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) のためのプロトコルについて述べる.TM での遺伝子発現の変化を分析する能力は、TM...

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

この原稿は、ヒトの皮膚から乳頭線維芽細胞および網状繊維を単離するための FACS ベースのプロトコルを記載している。それは、explant...

蛍光活性化細胞選別によるヒトの皮膚からの乳頭状および網状線維芽細胞の単離

液体窒素冷凍庫ミルを用いてマウス足を処理する極低温粉砕法を開発し、組織から抽出されたRNAまたはタンパク質の収率と品質を向上させ、炎症に関連する分子プロファイルの解析を可能にした。応答。...

コラーゲン誘発性関節炎モデルにおける組織炎症の分子経路を評価するためのマウス足処理のためのクライオ粉砕プロトコル

このプロトコルは、タンパク質分析のためにマウスの桿体光受容体の細胞内区画を単離するための2つの技術を提示する。第1の方法は、生きた網膜とセルロース濾紙を使用してロッドの外側セグメントを分離し、第2の方法は凍結乾燥された網膜と粘着テープを使用してロッドの内側と外側のセグメント層を剥離する。...

タンパク質分析のためのマウス網膜における光受容体細胞区画の単離のための2つの剥離方法

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。...

マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

網膜は、その層状構造全体で複雑な空間構成を示します。最新の空間トランスクリプトミクスおよびシーケンシング技術では、厚さ20μm&lt;組織切片が必要であり、網膜研究の適用性は限られています。この新鮮凍結凍結切片法は、平面的な空間的関係を維持しながら、マウス網膜の薄い 顔...

顔面 高次元空間分子解析のためのマウス網膜の凍結切片

学ぶサーモリジンを用いたラット表皮・真皮分離法。mRNAとタンパク質の保全性を保ちながら、部位特異的な炎症性メディエーターと神経栄養因子の産生を評価する。創傷治癒や皮膚疾患研究に応用可能。

ラット表皮と真皮をサーモリジンと分離して、部位特異的炎症性mRNAおよびタンパク質を検出する

さらに動画を探す