Name: 前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学ぶ前立腺癌マウスモデルの解剖法と腫瘍オルガノイド生成プロトコル。オルガノイドは元の腫瘍を再現し、がん治療薬のスクリーニングに活用できる有用な研究モデルです。

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著者らは、HAマウスのノギンFcまたはHAマウスRspo1-Fcのいずれかで安定してトランスフェクトHEK293細胞を提供してくれたスタンフォード大学のカルビン・クオ研究所に感謝したいと思います。また、彼の研究室で蛍光解剖顕微鏡にアクセスさせてくださったディーン・タン博士に感謝します。この研究は、国立がん研究所からD.W.G.にCA179907によってサポートされました。ロズウェルパーク総合癌センターの共有リソースは、国立衛生癌センター支援助成金CA016056によって支援されました。

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著者は開示する財政的な関係を持っていません。

前立腺腫瘍解剖およびオルガノイド生成のためのプロトコル内の重要なステップ 非前立腺組織の除去とマウス前立腺腫瘍の微細な解剖は、非前立腺上皮細胞と正常前立腺上皮細胞の両方がオルガノイドを生成するので、癌オルガノイドの最適な生成のために重要である。特に固形前立腺腫瘍の場合、生存可能な細胞の数を減らす壊死組織による汚染を除去するために生存性腫瘍の領域を分離することが重要である。オルガノイド生成の間、コラゲナーゼを伴う組織消化は、コラゲナーゼへの長期暴露が細胞の生存率を制限するように、熱心に監視されるべきである。がんGEMMに由来するオルガノイドでは、マウスで設計されたすべてのトランスジーンと改変対立遺伝子がオルガノイド中に存在することを確実にするために、各行を完全に遺伝子型化することが重要です。長期の通過後のジェノタイピングの繰り返しは、遺伝子改変が維持されることを確実にするためにも必要である。
前立腺腫瘍解剖とオルガノイド生成の改変とトラブルシューティング 我々は、同じ遺伝子型を有する動物の間でも、前立腺腫...

1980年代後半以降、相同組換えによって遺伝子を改変する能力は、生物学的システム1の研究を大きく進めてきた。Cre-loxPのような誘導性、組織、または細胞特異的な組換えシステムおよび部位特異的組換え物は、時間的および空間的に2、3の両方の遺伝子改変に対する制御を容易にすることによって、高度な遺伝子研究を行っている。 4.これらの遺伝的戦略の組み合わせは、実験モデルシステム5、6、7の広い配列を作成しました。
遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、個々の遺伝子または遺伝子群が哺乳類の発達や疾患に与える影響を評価するための不可欠なツールです。前臨床癌研究において、GEMMは癌の発達、進行、および治療8を研究するための最も生理学的に関連する厳格な方法である。当研究室は、がんGEMMの生成と特徴付けに特化しています。
米国の男性の間で最も高く診断された非皮癌は前立腺癌(PCa)である。PCa患者の大半は、リスクの低い疾患と生存率が高いが、疾患が進行段階で診断されたり、標的ホルモン療法が積極的で治癒不可能なPCaに進行を誘導する場合、生存率は劇的に低下する。サブタイプ9,10.当研究室では、1つ以上の腫瘍抑制遺伝子の凝対性アセレルを利用したGEMMsを開発しました。前立腺上皮細胞のみで活性化されるプロバシンプロモーターの下流にクレ・レコンビネーゼを用いてトランスジーンを導入したため、腫瘍抑制遺伝子発現の組み換えおよび喪失が前立腺に特異的に起こる。12.我々はまた、Cre13を有する細胞において、Creおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)発現を欠く細胞においてトマト蛍光タンパク質発現を誘導するmT/mGと呼ばれるCreレポータートランスジーンを含むためにGEMMを飼育した。この方法の提示と我々の代表的な結果は、我々が我々の研究室で研究するGEMMを示しているが、このプロトコルは、任意のマウスモデルから前立腺癌オルガノイドを生成するために使用することができる。しかし、代表的な結果セクションで詳しく説明したように、特定の腫瘍特性が前立腺癌オルガノイド生成に最適であることを観察しました。
過去10年間で、上皮起源の組織から細胞を培養する新しい方法は、インビトロ14、15の器官系をモデル化する能力の著しい進歩をもたらした。「3D細胞培養」という用語は、オルガノイドの確立と維持に関わる技術に起因しており、一般に、臓器特異的細胞系統によって駆動される二次的なアーキテクチャを組み立てる細胞からなる構造として定義することができる。特性16.これらの新しい方法は、細胞が長期的な成長のために変換や不死化を必要としないという古典的な2D細胞培養とは異なります。したがって、正常細胞の3D培養物は、病気の細胞と比較することができる。これは、通常、正常な細胞対照培養が利用できないがん研究において特に有益です。さらに、オルガノイドは、適切に分化した細胞型を持つ二次組織アーキテクチャを自発的に形成し、2D細胞株よりもインビトロで癌を理解するより良いモデルシステムを作る17。当研究室では、PCa GEMMから分離した腫瘍問題から3Dオルガノイドラインを作成し、インビボデータを補完し、GEMMでは実現できない実験を行っています。
この記事では、明確なマウス前立腺葉と転移性病変の解剖を含む、PCa GEMMの完全な壊死のための書かれた視覚的なプロトコルを提示する。我々は、正常マウス前立腺上皮組織18からオルガノイドを導出するためのDrostらによって以前に発表されたプロトコルに基づいて、マウス前立腺腫瘍からオルガノイドを生成するためのステップバイステップの方法を説明し、示す。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン+2.21 mM EDTA</td><td>シグマ</td><td>25-053</td><td></td></tr><tr><td>1 1/4 インチ、23 G、使い捨てシリンジ針</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>Z192430</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン</td><td>シグマ</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>32% パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10432</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12+++</td><td>Gibco</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>分析天びん</td><td>メトラー・トレド</td><td>30216623</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Board</td><td>Thermo-Fisher</td><td>36-1</td><td></td></tr><tr><td>EHS Sarcoma matrix, Pathclear Lot#19814A10</td><td>Manufactured by Trevigen</td><td>フレデリック国立研究所の国立がん研究所からの要求</td><td>国立がん研究所からの助成金保有者は、マトリックスをリクエストできます</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Sigma</td><td>25-060</td><td></td></tr><tr><td>ヒト組換え上皮成長因子 (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>25-005</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システインシグマ</td><td></td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>Σ</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>精密天秤</td><td>メトラー・トレド</td><td>30216561</td><td></td></tr>メス <tr><td>#23</td><td>ワールド精密計器</td><td>504176</td><td></td></tr><tr><td>メスハンドル #7, 16 cm</td><td>ワールド精密計器</td><td>500238</td><td></td></tr><tr><td>片刃カーボンカミソリ刃</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼解剖はさみ、10 cm、ストレート</td><td>ワールド精密機器</td><td>14393</td><td></td></tr>ステンレス鋼<tr><td>アイリス鉗子、10 cm、湾曲した先端、鋸歯状の</td><td>ワールド精密機器</td><td>15915</td><td></td></tr>ステンレス鋼<tr><td>ニュージェントユーティリティ鉗子、ストレートチップ、鋸歯状の</td><td>ワールド精密機器</td><td>504489</td><td></td></tr><tr><td>Y-276632(ロック阻害剤)</td><td>APExBIO</td><td>A3008</td><td></td></tr></tbody></table>の

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

Generation of Tumor Organoids from Genetically Engineered Mouse Models of Prostate Cancer

遺伝子を改変するための相同組換えに基づく方法は、生物学的研究を著しく進めている。遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、哺乳類の発達と疾患を研究するための厳格な方法です。当研究室では、部位特異的Cre-loxP組換後システムと前立腺特異的プロモーターを用いて、1つまたは複数の腫瘍抑制遺伝子の発現を欠く前立腺癌(PCa)のいくつかのGEMMを開発しました。本稿では、マウス前立腺腫瘍の解剖に焦点を当てて、これらのPCa GEMMの壊死に対する我々の方法について説明する。過去10年間に開発された新しい方法は、三次元でインビトロで臓器系をモデル化する上皮由来細胞の培養を促進した。また、マウスPCa GEMMsから腫瘍オルガノイドを生成する3D細胞培養法についても詳しく述べる。前臨床癌研究は、2D細胞培養および細胞株由来または患者由来異種移植片モデルによって支配されてきた。これらの方法は腫瘍微小環境を欠き、前臨床試験でこれらの技術を使用する限界である。GEMMは、腫瘍形成と癌の進行を理解するために、より生理学的に関連しています。腫瘍オルガノイド培養は、腫瘍のアーキテクチャおよび細胞系統特性を要約するインビトロモデルシステムである。さらに、3D細胞培養法は、腫瘍細胞培養と比較して正常細胞の増殖を可能にし、2D細胞培養技術を用いてはほとんど不可能である。組み合わせて、前臨床試験におけるGEMMと3D細胞培養の使用は、がん生物学に対する理解を深める可能性を秘めています。

前立腺領域に大きな流体で満たされた原発性前立腺腫瘍を有するマウスの代表的な壊死画像を図2Aに示す。これに対して、図2Bは、個々の前立腺領域が区別できない大きな固体原発性前立腺腫瘍を有するマウスの代表的な壊死画像を示す。蛍光解剖画像は、GFPを発現する図2Bと同じ固体前立腺腫瘍を示し、腫瘍細胞がCreを発現することを示す(図2C)。膀胱などのプロバシンを発現しない組織は、トマトを発現し、したがってCreを発現しない(図2C)。図2Bのマウスの肝臓と肺は、GFPを発現する転移性腫瘍を有し...

前立腺腫瘍解剖に焦点を当て、マウス前立腺癌モデルの壊死および解剖の方法を示す。マウス前立腺腫瘍オルガノイドの生成のためのステップバイステッププロトコルも提示される。

Methods based on homologous recombination to modify genes have significantly furthered biological research. Genetically engineered mouse models (GEMMs) ...

マウスオルガノイド培養は、従来の細胞培養よりもインビボ細胞組織によく似ています。がん研究では、オルガノイドは2D細胞株よりも元の腫瘍をモデル化し、新しい薬物治療を開発するためにインビトロで潜在的な癌療法をテストするために使用することができます。男性マウス泌尿生殖器系のエンブロック抽出のために膀胱の両側の脂肪パッドをつかみ、睾丸を露出させるために上方に引っ張る。各睾丸を尿生殖器領域の残りの部分から慎重に解剖する。膀胱を穏やかに持ち上げて、尿生殖器領域が一緒に上昇し、下の尿道を露出させる。膀胱を保持しながら、下側前立腺の下側に向けて尿道を切開する。泌尿生殖器領域全体が腹腔から放出されます。泌尿生殖器系を除去した後、泌尿生殖器系のすぐ後ろおよび脊柱の両側に位置する骨盤リンパ節が露出する。リンパ節を取り除くために、リンパ組織の下でまっすぐな鉗子を配向し、引き上げる。次に、直腸をまっすぐ鉗子でつかみ、直腸を引き上げて結腸全体を解明し、腸間膜リンパ節の転移性病変を探す。全体のイリウムが除去されたとき胃を露出させるために十二指腸を引っ張り続けます.食道を切って胃を完全に取り除きます。リンパ節に転移性病変が認められた場合は、これらの節を腸から慎重に解剖してPBSに貯蔵する。胃が取り除かれたとき、脾臓は4%パラホルムアルデヒドで貯蔵するために腹部の後側から収穫することができる。PBSに保存するための肝臓を除去します。転移性病変を含む腎リンパ節と一緒に脊椎の両側から腎臓を取り除きます。胸腔を露出させるために、慎重にリブケージに沿って横隔膜を切断します。胸腔内で放出される陰圧は、心臓と肺を露出させます。胸骨を引き上げて胸部腔をさらに開きます。胸部の歯房に沿って胸腔の腹側面をスキャンし、胸部リンパ節の転移病変が存在する場合は解剖を行います。胸骨を保持しながら、心臓と肺にアクセスするために腹側肋骨ケージを切り取り、心臓を引き上げて肺の下を切り取る。完全に心臓と肺を除去するためにブロックは、気管内の前血管のすべてを切断します.肺組織や肺転移病変を損傷することなく、PBSの容器に慎重に心臓を移す。前立腺腫瘍の解剖のために、尿生殖器領域を解剖顕微鏡下に置く。一対のストレート鉗子と湾曲した鉗子を使用して、尿生殖領域を後部表面に反転させます。尿道のピンク赤色で識別できる前立腺近位領域を見つけます。尿道をしっかりとつかんで、曲面鉗子で尿生殖組織を操作できるようにします。精嚢の基部を見つけて、慎重に取り除きます。次に、鉗子の湾曲した側を使用して、精管とできるだけ多くの脂肪と結合組織を取り除きます。尿道と近位前立腺領域をしっかりと保持しながら、尿道から膀胱を取り除くために細かい尖ったはさみを使用してください。真っ直ぐな鉗子で近位前立腺領域と尿道をしっかりと保持し、前立腺前立領域を鉗子の湾曲した側で把握し、組織を膀胱および残りの前立腺からしっかりと引き離す。前立腺前立腺組織をPBSに入れ、腹側前立腺領域を見つけます。同じように腹側前立腺領域を除去する。側側領域が側側領域と区別できる場合は、両側の前立腺領域の横方向を除去する。次に、後元の前立腺領域を取り除き、4%パラホルムアルデヒドに近位前立腺領域を配置します。みじん切り後、腫瘍片を15ミリリットルの消化バッファーに入れ、摂氏37度で1時間半から2時間の消化を行います。消化の終わりに、遠心分離によって消化された組織を沈降させ、上清を捨てる。チューブをフリックして細胞ペレットを緩めます。摂氏37度で5分間、10マイクロモルY-27632 ROCK阻害剤を補充したプリ温めたトリプシンの1ミリリットルで細胞を再懸濁する。インキュベーションの終わりに、標準的なP1000ピペットチップで組織スラリーを5回トリチュレートする。さらに5分間のインキュベーションとトリチュレーションのために、チューブを水浴に戻します。マトリックスドームメッキの場合は、消化した細胞を9ミリリットルの冷媒で洗浄し、遠心分離によって細胞を採取する。カウントのための新鮮な媒体の1ミリリットルで細胞を再懸濁します。そして、カウントした後、再び遠心分離によって細胞を収集します。適切な量のマトリックスで腫瘍細胞を希釈します。慎重に55°Cの各ウェルにマトリックスセル溶液の200マイクロリットルをドロップし、6ウェルプレートを温めました。ドームを室温で2分間固めてから、プレートを37°Cのインキュベーターで20分間逆さまにします。ドームが完全に固まった場合は、各ウェルにアンドロゲンR1881とROCK阻害剤を補った前立腺オルガノイド培地の2ミリリットルを追加します。プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。蛍光解剖画像は、緑色蛍光タンパク質、またはGFP発現を、固形前立腺腫瘍によって明らかにし、腫瘍細胞がCreを発現することを示す。同じ動物の肝臓と肺は、これらの腫瘍が原発性前立腺腫瘍に由来することを示すGFPを発現する転移性腫瘍を示す。このマウスの骨盤リンパ節は、トマトではなくGFPを発現し、この転移性腫瘍がリンパ節を追い越し、正常組織が残していないことを示している。固形前立腺腫瘍から生成された小オルガノイドの1日目に、腫瘍オルガノイド培養に存在するトマトおよびGFP発現細胞の両方で形成し始める。しかし、前立腺腫瘍オルガノイドが完全に形成された7日目以降までに、オルガノイドはGFPを発現するがトマトは発現せず、オルガノイドは正常な上皮細胞からではなく、Cre発現腫瘍細胞に由来していることを示唆している。1日目に、トマトおよびGFP発現細胞の両方の体液充填前立腺腫瘍から生成された小さなオルガノイドの培養物がオルガノイド培養物内に存在する。しかし、体液で満たされた前立腺腫瘍のオルガノイドは、7日目以降にGFPまたはトマトのいずれかを発現し、Creを発現しない細胞から形成されたオルガノイドを示す。前立腺組織を収穫する際に向きを保つために、常に膀胱と尿道の位置に注意してください。その生成後、オルガノイドは画像化アプリケーション、分子生物学分析および薬物スクリーンに使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

腫瘍由来のオルガノイドは、腫瘍の病理学的特徴と臓器特異的な細胞系統を維持できる3D細胞培養モデルの一種です。このプロトコルの例では、科学者が遺伝子操作マウスモデルから前立腺腫瘍からオルガノイドを生成する様子を見ていきます。...

腫瘍からのオルガノイドの調製:3D In Vitro腫瘍モデル

このビデオでは、培養膀胱腫瘍オルガノイドのマウス膀胱への同所性移植について説明し、腫瘍の発生に対する臓器環境の役割を研究します。...

膀胱腫瘍オルガノイドモデル:レシピエントマウス膀胱への膀胱オルガノイドの同所性移植法

一次マウス結腸腫瘍オルガノイドを確立するための簡単​​な方法が記載されている。通常のコロンは上皮ないのに対し、この方法では、結腸腫瘍細胞が生き残ると限られた成長因子を含む培地中でオルガノイドに成長するという特徴を利用しています。...

プライマリマウス大腸腫瘍のin vitroオルガノイド培養で

マウス前立腺オルガノイドは、分化を調節するメカニズムを評価する有望な文脈を表す。本論文では、前立腺オルガノイドを確立するための改善されたアプローチについて述べ、(1)オルガノイドからタンパク質リサートを採取する方法、および(2)全マウント共焦点顕微鏡のためのオルガノイドを修正および染色する方法を紹介する。...

オルガノイド培養を用いたマウス前立腺上皮細胞の分化能力の評価

ここで提示する前立腺上皮オルガノイドにおける薬理学的応答を研究するためのプロトコルである。オルガノイドは生体内生物学によく似ており、患者の遺伝学を再現し、魅力的なモデルシステムとなっています。前立腺オルガノイドは、野生型前立腺、遺伝子操作されたマウスモデル、良性ヒト組織、および進行前立腺癌から確立することができる。...

遺伝子型と突然変異プロファイルを薬理学的応答に変換するツールとしての前立腺オルガノイド培養

患者のBMPC標本および骨転移性前立腺癌の異種移植片の三次元培養は、嚢胞、回転楕円および複雑な腫瘍様オルガノイドをもたらす元の腫瘍の機能的不均一性を維持する。本稿は、異種患者由来サンプルの3D培養とIFCを用いた解析のための最適化戦略とプロトコルを提供します。...

患者前立腺癌骨転移標本及びその異種移植片に由来する3次元(3D)オルガノイドの確立と解析

このプロトコルは、発癌性癌誘発性マウス膀胱癌に由来する膀胱腫瘍オルガノイドの三次元体内培養を確立するための詳細な実験ステップを提供する。腫瘍オルガノイドの受動法、遺伝子工学、および正体移植を含む培養方法が記載されている。...

マウス膀胱腫瘍オルガノイドの培養、操作、および正体移植

このプロトコルでは、一次正常および腫瘍乳腺組織から差動遠心分離によって上皮オルガノイドを生成するためのアプローチについて説明します。さらに、包埋オルガノイドの3次元培養および免疫蛍光イメージングのための説明書が含まれています。...

継代なしの正常および腫瘍乳腺組織からのマウスおよびヒト上皮オルガノイドの生成とイメージング

患者の腫瘍から生成されたオルガノイドをマウスの肝臓に同所的に注入します。非腫瘍性肝組織の切除は、腫瘍が位置する肝臓組織に再生環境をもたらします。...

肝臓再生が腫瘍増殖に及ぼす影響を調査するための肝細胞癌患者由来オルガノイド異種移植モデル

前立腺がんの不均一性と治療抵抗性は依然として課題です。主要な親腫瘍の特徴を保持する患者由来オルガノイド(PDO)を生成するためのプロトコルについて説明します。この標準化されたモデルは、薬物スクリーニングと精密医療の進歩をサポートします。...

患者由来前立腺癌オルガノイドの確立と維持:詳細な実験プロトコル

このプロトコルは、2Dで培養されたマウス前立腺オルガノイドモデルの生成を記述しています。この検査には、オルガノイド解離、細胞シーディング、分化、上皮の完全性評価、そして尿路病原性大腸菌による体外感染が含まれます。このモデルは頂端のアクセス性を提供し、宿主と病原体の相互作用の研究に適しており、従来の3Dオルガノイドシステムの制約を克服します。...

宿主-病原体相互作用を研究するためのマウス前立腺オルガノイドモデルの生成

学ぶ前立腺癌マウスモデルの解剖法と腫瘍オルガノイド生成プロトコル。オルガノイドは元の腫瘍を再現し、がん治療薬のスクリーニングに活用できる有用な研究モデルです。

前立腺癌の遺伝子組み換えマウスモデルからの腫瘍オルガノイドの生成

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