Name: 癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶ 3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価法。ハンドドロップ法や免疫組織化学用包埋などの最適化プロトコルを用いて、がん細胞の増殖と死滅を効率的に調査し、in vitroからin vivoへの翻訳を改善する。

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私たちは、優れた技術支援を受けたカトリーヌ・フランクリン・マークとアネット・バルテルスと、図1Dで実験を行ったアスビョーン・ノハル・ニールセンに感謝しています。この作品は、アイナー・ウィラムセン財団、ノボ・ノルディスク財団、フォンダシオン・ジュチュム(すべてSFP)によって資金提供されました。

<ol><li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240 (4849), 177-184 (1988).</li>
<li>Mueller-Klieser, W., Freyer, J. P., Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+glucose+and+oxygen+supply+conditions+on+the+oxygenation+of+multicellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Influence of glucose and oxygen supply conditions on the oxygenation of multicellular spheroids.</a> British Journal of Cancer. 53 (3), 345-353 (1986).</li>
<li>Gaedtke, L., Thoenes, L., Culmsee, C., Mayer, B., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+reveals+differences+in+protein+expression+in+spheroid+versus+monolayer+cultures+of+low-passage+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis reveals differences in protein expression in spheroid versus monolayer cultures of low-passage colon carcinoma cells.</a> Journal of Proteome Research. 6 (11), 4111-4118 (2007).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000293(2008).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+create+the+correct+microenvironment%3A+three-dimensional+heterotypic+collagen+assays+for+human+breast+epithelial+morphogenesis+and+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia.</a> Methods. 30 (3), 247-255 (2003).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews in Molecular and Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Jacobi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+three-dimensional+cancer+cell+cultures+mirror+drug+responses+in+vivo%3A+lessons+learned+from+the+inhibition+of+EGFR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Organotypic three-dimensional cancer cell cultures mirror drug responses in vivo: lessons learned from the inhibition of EGFR signaling.</a> Oncotarget. 8 (64), 107423-107440 (2017).</li>
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<li>Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+intermediates+between+monolayer+culture+and+in+vivo+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: intermediates between monolayer culture and in vivo tumor.</a> Cell Biology International. 23 (3), 157-161 (1999).</li>
<li>Andersen, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+acid-extruding+ion+transporters+in+regulation+of+breast+cancer+cell+growth+in+a+3-dimensional+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Roles of acid-extruding ion transporters in regulation of breast cancer cell growth in a 3-dimensional microenvironment.</a> Molecular Cancer. 15 (1), 45(2016).</li>
<li>Swietach, P., Patiar, S., Supuran, C. T., Harris, A. L., Vaughan-Jones, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+carbonic+anhydrase+9+in+regulating+extracellular+and+intracellular+ph+in+three-dimensional+tumor+cell+growths%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of carbonic anhydrase 9 in regulating extracellular and intracellular ph in three-dimensional tumor cell growths.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (30), 20299-20310 (2009).</li>
<li>Walenta, S., Doetsch, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+imaging+in+multicellular+spheroids+of+oncogene-transfected+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolic imaging in multicellular spheroids of oncogene-transfected fibroblasts.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (4), 509-522 (2000).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Groebe, K., Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+induces+novel+proliferative+and+metabolic+alterations+associated+with+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture induces novel proliferative and metabolic alterations associated with oncogenic transformation.</a> International Journal of Cancer. 66 (4), 578-586 (1996).</li>
<li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homogeneous+pancreatic+cancer+spheroids+mimic+growth+pattern+of+circulating+tumor+cell+clusters+and+macrometastases%3A+displaying+heterogeneity+and+crater-like+structure+on+inner+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Homogeneous pancreatic cancer spheroids mimic growth pattern of circulating tumor cell clusters and macrometastases: displaying heterogeneity and crater-like structure on inner layer.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 143 (9), 1771-1786 (2017).</li>
<li>Santini, M. T., Rainaldi, G., Indovina, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+cell+adhesion+and+the+extracellular+matrix+in+the+three-dimensional+growth+of+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, cell adhesion and the extracellular matrix in the three-dimensional growth of multicellular tumor spheroids.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36 (2-3), 75-87 (2000).</li>
<li>Vinci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+establishment+and+analysis+of+three-dimensional+tumor+spheroid-based+functional+assays+for+target+validation+and+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation.</a> BMC Biology. 10, 29(2012).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
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<li>Vaupel, P. W., Frinak, S., Bicher, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+oxygen+partial+pressure+and+pH+distribution+in+C3H+mouse+mammary+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous oxygen partial pressure and pH distribution in C3H mouse mammary adenocarcinoma.</a> Cancer Research. 41 (5), 2008-2013 (1981).</li>
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<li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3D+angiogenesis+model+to+study+tumour+-+endothelial+cell+interactions+and+the+effects+of+anti-angiogenic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a 3D angiogenesis model to study tumour - endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2963(2017).</li>
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<li>Michel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+modeling+of+the+proliferation+gradient+in+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical modeling of the proliferation gradient in multicellular tumor spheroids.</a> Journal of Theoretical Biology. 458, 133-147 (2018).</li>
<li>Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+tumor+culture+systems+for+functional+drug+testing+and+therapy+response+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction.</a> Future Science OA. 3 (2), (2017).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しない。

3D癌細胞スフェロイドの使用は、抗癌剤スクリーニングのためだけでなく、腫瘍内のものを模倣する条件下で癌細胞死と生存率の調節に機械的な洞察を得るための貴重で汎用性の高いツールを証明しています。マイクロ環境。これは、化学療法薬のアクセシビリティ、細胞取り込み、および細胞内効果が、pH、酸素張力、拷問性、および物理的および物理的および腫瘍内の物理化学的状態によって大きく影響を受けるので、特に重要である。化学細胞相互作用9,17.例えば、多くの固形腫瘍25、26、27、28、29で6-6.5以下の値に達することができる細胞外pHの酸性度は、弱い基本的な化学療法を引き起こすドキソルビシン、ミトキサントロン、ツ...

がん生物学における多細胞スフェロイドモデルの使用は数十年前の1、2であるが、近年かなりの勢いを得た。大部分は、がん細胞の表現型が微小環境と特定の成長条件にどれだけ強く依存しているかの認識の増加を反映しています。固形腫瘍の微小環境は、対応する正常組織の微小環境とは根本的に異なる。これには、pH、酸素張力、間質圧、栄養素、廃棄物、分泌シグナル伝達化合物(成長因子、サイトカイン)などの可溶性因子の濃度勾配が含まれます。さらに、細胞外マトリックス(ECM)の組織、細胞間相互作用および細胞間シグナル伝達、および腫瘍3、4の特定の3次元(3D)アーキテクチャの他の態様を含む。 5,6.がん細胞が存在する特定の微小環境条件は、遺伝子発現プロファイルと機能性に大きく影響し、2Dで増殖した細胞の表現型と比較して、3Dスフェロイドの表現型がはるかに密接に模倣していることは明らかである。生体内腫瘍7、8、9、10、11のそれ。2Dモデルは、低酸素症、酸性pH、高乳酸濃度を用いて腫瘍微小環境の既知の側面を模倣しても、腫瘍内で生じる物理化学的パラメータの勾配や3D腫瘍を捕捉できない。アーキテクチャ。一方、動物モデルは高価で、遅く、倫理的に問題があり、一般的に、ヒト腫瘍の状態を要約する能力にも欠点があります。その結果、3Dスフェロイドは、ほとんどの固形癌9、11、12、13、および幅広い特性の研究において中間複雑性モデルとして適用されている。14,15,16,17.
3Dスフェロイドの広く採用されている使用は、抗癌治療の有効性9、18、19、20のスクリーニングアッセイにあります。治療応答は、薬物送達に対する拷問、制限拡散、高い間質圧、酸性環境pHの薬物送達への影響、低酸素症および他の影響の両方を反映して、腫瘍微小環境に特に敏感である。細胞死応答9,17に関する微小環境の態様。3Dスフェロイド内の環境は、これらの特性のすべてが本質的に発達するので、3D細胞培養物を採用し、結果を生体内条件に大幅に改善し、同時に、正味成長の効率的で手頃な価格のハイスループットスクリーニングを可能にします。しかし、癌細胞の薬物応答に関する研究の大半は、依然として2D条件下で行われている。これは、一部のアッセイが3D細胞培養に比較的容易に実装できる一方で、生存率アッセイ、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光分析などの多くが、3Dよりも2Dではるかに便利に行われていることを反映している可能性があります。
本研究の目的は、抗癌剤による治療が癌細胞の生存率および生存に及ぼす効果を3D腫瘍模倣設定で容易に分析するための容易なアッセイと正確なプロトコルを提供することである。具体的には、スフェロイド形成に関する3つの異なる方法を提供し、比較し、続いて成長、生存率、薬物応答の定性的および定量的分析の方法を提供し、比較する。

<table><tbody><tr><td>2-(4-アミジノフェニル)-1H-インドール-6-カルボキサミジン (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td># C10595&nbsp;</td><td>核の染色に</td></tr><tr><td>5-フルオロウラシル (5-FU)</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#F6627</td><td>化学療法における成分</td></tr><tr><td>5-(N-エチルイソプロピル) アミロリド (EIPA)</td><td>Life Technologies</td> <td>#E3111</td><td>NHE1 Antibody</td></tr><tr><td>against PARP and cPARP</td><td>Signaling</td><td>#9542</td><td>Used in Western blotting</td></tr><tr><td>Antibody against Ki-67</td><td>Cell signaling</td><td>#9449</td><td>IHC</td></tr><tr><td>に使用p53</td><td>細胞シグナルに対する抗体&nbsp;</td><td>#2524&nbsp;</td><td>IHCに使用</td></tr><tr><td>&β;-actin Sigmaに対する抗体</td><td>&nbsp;</td><td>A5441</td><td>ウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>Bactoagar</td><td>BD Bioscience</td><td>#214010</td><td>アガロースゲル調製に使用</td></tr><tr><td>Benchmark protein ladder</td><td>Invitrogen</td><td>#10747-012</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Bio-Rad DC Protein Assay kit</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>#500-0113, #500-0114, #500-0115&nbsp;&nbsp;</td><td>ライセートからのタンパク質測定に使用</td></tr><tr><td>B&uuml;rkerチャンバー</td><td>マリエンフェルト</td><td>610311</td><td>細胞計数用&nbsp;</td></tr><tr><td>BX63落射蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td>蛍光イメージングに使用</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 細胞生存率アッセイ</td><td>プロメガ</td> <td>#G9681</td><td>細胞生存率アッセイに使用</td></tr><tr><td>シスプラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#P4394&nbsp;</td><td>化学療法治療における成分</td></tr><tr><td>コーニングスフェロイドマイクロプレート、96ウェル、黒、透明な丸い底、&nbsp;超低アタッチメント、蓋付き、滅菌済み</td><td>Corning</td><td>#4520</td><td>発光測定を終点とするスフェロイドの成長に使用</td></tr><tr><td>Corning 96 well, クリアラウンドボトム,&nbsp;超低アタッチメントマイクロプレート、蓋付き、滅菌済み</td><td>Corning</td><td>#7007</td><td>終点として発光測定を行わずにスフェロイド成長に十分</td></tr><tr><td>Criterion TGX Precast Gels</td><td>Bio-Rad</td><td>5671025</td><td>SDS-PAGEに使用</td></tr><tr><td>ドキソルビシン</td><td>Abcam</td><td>#120629</td><td>化学療法治療の成分</td></tr><tr><td>FLUOStar Optima マイクロプレートリーダー</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>発光の記録に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>VWRケミカルズ&nbsp;</td><td>#9713.1000&nbsp;</td><td>細胞固定に使用</td></tr><tr><td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>Gibco</td> <td>#A1413202</td><td>4 °C に保ちます。固化を防ぐためのC。プロトコルではrBMと呼ばれます。</td></tr><tr><td>熱不活性化FBS</td><td>Sigma</td> <td>#F9665</td><td>成長培地用血清</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>Scientific 画像解析</td></tr><tr><td>Medim Uni-safe casette</td><td>Medim Histotechnologie</td><td>10-0114</td><td>埋め込みスフェロイドの保管に使用</td></tr><tr><td>ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>Roche Diagnostics GmBH&nbsp;</td><td># 11836153001</td><td>溶解バッファーの調製に使用</td></tr><tr><td>MZ16顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>光学顕微鏡画像に使用</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS 4x サンプルバッファー&nbsp;</td><td>Invitrogen</td> <td>#NP0007</td><td>ウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>Pierce ECL ウェスタンブロッティング基質</td><td>Thermo scientific</td><td>#32106</td><td>ウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#P7170-1L</td><td>タンパク質バンド染色に使用</td></tr><tr><td>Prism 6.0</td><td>Graphpad</td><td></td><td>Scientific グラフ作成および統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム (水中1mg/ml溶液)</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td>P3566</td><td>感光性&nbsp;</td></tr><tr><td>滅菌リザーバー、マルチチャンネル</td><td>SPLライフサイエンス</td><td>21002</td><td>スフェロイド形成のための細胞の播種に使用</td></tr><tr><td>スーパーフロストウルトラプラス 接着スライド&nbsp;</td><td>メンゼル-GL&auml;ser</td> <td>#J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>タモキシフェン</td>シ<td>グマ-アルドリッチ</td>の埋め込みに使用される顕微鏡スライドガラス <td>#T5648</td><td>化学療法治療として使用</td></tr><tr><td>トランスブロットターボ0.2 &micro;m ニトロセルロースメンブレン</td><td>Bio-Rad</td><td>#170-4159</td><td>ウェスタンブロッティング</td></tr><tr><td>Tris/Glycine/SDS running buffer&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド&nbsp;</td><td>#161 0732</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>トリプシンEDTA溶液</td><td>Sigma</td> <td>#T4174&nbsp;</td><td>細胞解離酵素</td></tr></tbody></table>

癌細胞の3dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

がん細胞の三次元スフェロイドは、がんの薬物スクリーンとがん細胞生物学に対する機械的な洞察を得るための重要なツールです。この調製の力は、比較的高スループットスクリーニングを可能にするのに十分な速く、安価で汎用性がある一方で、腫瘍の生体内状態の多くの側面を模倣する能力にあります。スフェロイド培養条件は、細胞外の酸性度の増加、乳酸の増加、グルコースおよび酸素の利用可能性の低下を含む腫瘍内の物理化学勾配を、スフェロイド周辺からその中心まで要約することができる。また、生体内腫瘍の機械的特性および細胞間相互作用は、このモデルによって部分的に模倣される。3Dスフェロイドの特定の特性と結果的に最適な増殖条件は、異なるタイプの癌細胞間で大きく異なります。さらに、3Dスフェロイドにおける細胞の生存率と死亡の評価には、2D培養に用いられるものとは部分的に異なる方法が必要です。ここでは、がん細胞の3Dスフェロイドを準備するためのいくつかのプロトコルを説明し、そのような培養物を使用して、抗癌剤の有効性を評価する文脈で細胞の生存率と死亡を評価する。

図1A及び図1Bに概略的に示したスフェロイド形成プロトコルに基づくスフェロイド成長アッセイは、3D腫瘍における抗癌剤治療の効果を分析するための出発点として用いた。模倣設定。スフェロイドが形成される容易さは細胞株特異的であり、一部の細胞株は一貫性のあるスフェロイド22を形成するためにrBMとの補充を必要とする。添加されたrBMの濃度は、スフェロイドの形態に大きな影響を与える可能性があります。図1Cおよび図1Dに示すように、rBMの濃度を0〜4%の間で変化させることは、細胞型依存的な方法でスフェロイドのコンパクト性および形態を変化させる。図 1C</...

ここでは、生体内腫瘍の物理化学勾配を2D培養よりもはるかに優れた3D癌細胞スフェロイドで生存率と死亡を評価するためのいくつかの簡単な方法を紹介する。したがって、スフェロイドモデルは、生体内条件への翻訳を改善した癌薬効の評価を可能にする。

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

ここに示すプロトコルは、3D培養用に最適化されており、3D環境におけるがん細胞の増殖、増殖、死に関連するプロセスの効率的かつ手頃な価格の調査を可能にしています。3D培養を使用する主な利点は、それらがインビトロで腫瘍微小環境の主要な側面を再現するためのユニークな可能性があるということです。3Dスフェロイドは、がん治療研究におけるインビトロとインビボ状態の間の翻訳を改善するためにますます使用されている癌薬スクリーニングのための重要なツールです。プロトコルの中には、ある程度の練習とスキルが必要なものもあります。これは特に、手滴法によるスフェロイドの製造、免疫組織化学用のスフェロイドの埋め込みに当てはまります。これらの手順の重要な要素は、アガロースの一滴にスフェロイドを挿入する方法など、書面で記述することは困難であるとして、視覚的なデモンストレーションは、研究者がこれらの手順を実行するのに役立ちます。調製した細胞懸濁液を15ミリリットルチューブで希釈し、最適な細胞密度を得る。希釈した細胞懸濁液を滅菌貯蔵所に移し、マルチチャネルピペットを使用して、以前に調製したプレートに200マイクロリットルを分配します。5%の二酸化炭素と95%の湿度で摂氏37度でインキュベート。2~3日ごとに、スフェロイドの光顕微鏡画像を取得する。画像を取得した後、各ウェルから使用済み培地の100マイクロリットルを取り除き、100マイクロリットルの新鮮な媒体に置き換えます。まず、氷上の基質膜を解凍する。使用前に、個別に包まれたプレートと貯水池を氷の上に保管してください。次に、調製した細胞懸濁液を15ミリリットルチューブで希釈し、最適な細胞密度を得る。希釈した細胞懸濁液を含むチューブを氷の上に置きます。プラスチック容器に氷を充填し、ボンネットに移します。冷やしたプレートと貯留層を細胞培養フードに移します。プレートと貯水池を氷の上に戻します。均質なゲルを確保するために、rBMを穏やかに再懸濁します。チルドセル懸濁液にrBMの最適濃度を加えます。チューブを反転して、rBMと細胞懸濁液が適切に混合されていることを確認します。次に、この混合物を滅菌貯蔵所に移し、マルチチャネルピペットを使用して、200マイクロリットルを冷蔵、超低アタッチメント、96ウェルプレートの各ウェルに分配します。rBMが硬化したときに細胞が一緒にクラスター化されるように、750回gでプレートを15分間遠心分離します。遠心分離機ソフト降下または最小ブレーキ機能を使用してください。まず、細胞培養皿に6ミリリットルのPBSを加えます。調製した細胞懸濁液を希釈して、適切な希釈液を得る。実用的な希釈は、ミリリットル当たり50,000細胞である。細胞懸濁液を無菌貯留槽に注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用して、細胞培養皿の蓋に最大30滴の懸濁液を慎重に入れ、1滴あたり2000個の細胞濃度を得る。迅速だが制御された動きでは、蓋を反転し、PBSを含む細胞培養皿の上に置きます。5%の二酸化炭素と95%の湿度で摂氏37度で4〜6日間インキュベートします。スフェロイドをタンパク質のライゼまたは埋め込みに使用する場合は、蓋を取り除いて傾け、加熱された媒体を1ミリリットルで滴を洗い流して引っ張ります。得られたスフェロイド含有培地を1.5ミリリットルのチューブに移します。タンパク質のライゼートまたは埋め込みを進める前に、スフェロイドをチューブの底に落ち着かせてください。P200ピペットチップの端部を切り取り、構造を乱すことなくスフェロイドをより簡単にキャプチャします。各条件について、1.5 ミリリットルチューブで 18 ~ 24 個のスフェロイドを最小 12 個引き上げるのが理想的です。チューブを氷の上に置き、回転楕円体を底に落ち着かせる。次に、滅菌細胞実験室から通常の実験室に移ります。スフェロイドを氷冷1 X PBSの1ミリリットルで2回洗浄し、各洗浄ステップの間にPBSを取り除く前に回転楕円体を落ち着かせるようにします。その後、スフェロイドを乱したり除去したりすることなく、できるだけ多くのPBSを吸引する。ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を用いて5マイクロリットルの加熱リシスバッファーをスフェロイド当たり添加します。回転楕円体を30秒間渦盛りし、10秒間素早い遠心分離を行います。これらの渦と遠心分離の間隔を5~10分間繰り返すか、回転楕円体が溶解するまで繰り返します。PI溶液を調製した後、96ウェルプレートの各ウェルから100マイクロリットルの培地を取り除き、スフェロイドを取り除かないようにします。加熱された1つのX PBSを100マイクロリットルずつ各ウェルに加え、その後100マイクロリットルの液体を井戸から取り除きます。この洗浄工程を3回繰り返して、残りの培地を洗い流します。次に、PI溶液を100マイクロリットルずつ各ウェルに加えます。プレートをアルミホイルで覆い、摂氏37度で5%の二酸化炭素と95%の湿度を10〜15分間インキュベートします。この後、前述のように1つのXPBSを加熱して洗浄工程を3回繰り返し、撮像時にPI溶液を洗い流し、バックグラウンド信号を減少させる。蛍光顕微鏡を使用して、回転楕円体を画像化します。イメージングソフトウェア内で、マルチチャンネルメニューを開きます。関連するチャンネルの露出時間を設定し、各チャンネルを調整した後に[設定を読み取り]を押します。Z スタック メニューを開き、イメージのフォーカスを調整して開始と終了を定義します。最初に回転楕円体が焦点を合わせなくなり、イメージが再びぼやけるまで、回転楕円体全体を通して焦点を移動します。次に、ステップサイズを18~35マイクロメートルに調整し、Startキーを押します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、1日目にヒュームフードで回転楕円体を固定します。2日目には、アガロースゲルを電子レンジの水で満たされたビーカーに入れ、加熱し、必要になるまで60度に設定されたベンチトップの加熱プレートでゲルを暖かく保ちます。1回の洗浄につき1ミリリットルの氷冷1 X PBSを使用して、ヒュームフードでスフェロイドを2回洗います。その後、PBSの大部分を吸引する。20マイクロリットルのピペットチップを傾斜で切って準備し、より大きな穴を持つ尖った先端を得る。この後、顕微鏡スライド上にアガロースゲルドロップを作ります。アガロースが固化するのを防ぐために、暖かい加熱ブロックの上にスライドを置きます。変更されたピペットチップを使用して、15〜20マイクロリットルの体積でできるだけ多くのスフェロイドをキャッチします。慎重にアガロースゲルドロップの中央にスフェロイドを注入し、顕微鏡スライドに触れないようにしてください。アガロースゲルを硬化させるために、室温または4度で5〜10分間インキュベートします。ゲルドロップが幾分固まったが、まだ柔らかい場合は、メスを使用して顕微鏡スライドからプラスチック組織カセットに慎重に押し込みます。組織カセットをエタノールで満たされたビーカーに移し、室温で保管します。本研究では、3D培養におけるがん細胞の生存率および死における抗癌治療による変化の分析のための一連の方法が提示される。rBMの濃度が添加され、スフェロイドの形態に大きな影響を与える可能性があります。最大2.5%rBMを添加すると、SKBr-3乳癌細胞におけるスフェロイド形成が可能であり、より高い濃度ではそれ以上の効果はない。対照的に、BxPC-3膵臓癌細胞は、自然に小さなコンパクトなスフェロイドを形成する。この細胞型では、rBMを1.5%以上に増やすと、スフェロイドから突起や膣の突起を伴うより複雑な構造への明確な形態変化が引き起こる。化学療法効果のスクリーニングのためのスフェロイド培養の使用例をここに示す。MDA-MB-231乳癌細胞における生存率の50%減少に必要な用量を決定するために行われる用量応答実験の間に、光顕微鏡画像は2〜3日ごとに取得される。インヒビター濃度の増加に伴う死細胞の空間的配置は、PI染色を用いて可視化することができる。見られるように、対照スフェロイドは限られた壊死性、後期アポトーシスコアを示し、一方死んだ細胞は抑制剤の濃度が増加するにつれてスフェロイド全体に分布する。ここに示すスフェロイド技術は、3Dの浸潤、移動、またはマイクロ泳動解析など、他の多くのアッセイに適用できます。また、線維芽細胞、アディポサイト、または免疫細胞との共培養にも適用可能であり、腫瘍微小環境における細胞相互作用に関する重要な情報を提供することができる。この技術の開発は、遺伝子発現、浸潤、治療支援など、がんの発症の多くの側面における腫瘍微小環境の役割を解明する上で非常に重要である。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

スフェロイドは、2D細胞培養単層モデルと比較して、細胞の環境をより正確に表現するために使用される3D細胞培養モデルの一種です。このプロトコル例では、科学者が結腸直腸がん細胞株からスフェロイドを作製し、生細胞イメージングを適用してスフェロイドの成長を追跡します。...

細胞株からのスフェロイド作製:三次元(3D)細胞培養法

この方法は、スフェロイドから周囲の3Dマトリックスへの癌細胞の浸潤を評価します。 スフェロイドはハンギングドロップ培養法で作製し、基底膜材料とI型コラーゲンからなるマトリックスに包埋します。 その後、スフェロイドからの侵入が監視されます。...

3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ

ここでは、メソッドは、膵臓がん細胞と線維芽細胞、細胞外フラックス アナライザーを使用して代謝機能の測定に続いての 3 次元 (3 D)...

準備と膵臓癌細胞と線維芽細胞の共培養を 3 次元回転楕円体の代謝アッセイ

このプロトコルは、リアルタイムで 3 D 構造化癌細胞 (スフェロイド) に対する免疫療法のリダイレクトされた T 細胞 (T 細胞車)...

車 T 細胞スフェロイド殺害アッセイ

このプロトコルは、患者由来のスフェロイドの生成、および増殖の定量化、細胞傷害性試験、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色および共焦点イメージングを含む下流分析を記述し、薬物を評価するために抗腫瘍治療薬としての候補者の可能性このプロトコルは、各患者および疾患の段階のための特定の薬物の同定と精密医学をサポートする。...

がん幹細胞を標的とする抗腫瘍性薬物スクリーニングのための生理学的患者由来3Dスフェロイド

ここでは、ラクトバチルス細胞遊離上清(LCFS)の抗癌効果を理解する方法が提示されている。大腸癌細胞株は、3D培養でLCFSで治療した場合の細胞死を示す。スキャフォールドの生成過程はスキャフォールドに応じて最適化でき、提示される解析方法は、関係するシグナル伝達経路を評価するのに有用である。...

大腸癌細胞の3次元スフェロイド培養におけるプロバイオティクスの細胞遊離上清を用いた細胞死の評価

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。...

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

本プロトコルは、初代がん細胞から3D腫瘍培養モデルを生成し、細胞生存率アッセイおよび顕微鏡検査を使用して薬物に対するそれらの感受性を評価することを記載しています。...

患者由来の腫瘍サンプルから3次元スフェロイドを樹立し、薬物に対する感受性を評価

再現性の高いスフェロイドを増殖させるためのプロトコルと、画像キャプチャとプロテオミクスを用いた表現型特性評価について紹介します。...

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

本稿では、抗腫瘍抗体の重要ながん細胞死滅機構であるADCC機構を調節する化合物を同定する方法について紹介する。NK細胞の細胞毒性効果は、トラスツズマブの存在下で乳がん細胞スフェロイドで測定されます。画像解析により、スフェロイドの生細胞と死細胞、および標的細胞が同定されます。...

腫瘍スフェロイドモデルにおける抗体依存性細胞傷害性の定量化:創薬への応用

学ぶ 3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価法。ハンドドロップ法や免疫組織化学用包埋などの最適化プロトコルを用いて、がん細胞の増殖と死滅を効率的に調査し、in vitroからin vivoへの翻訳を改善する。

癌細胞の3Dスフェロイド培養における細胞生存率と死の評価

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