背景散乱を最小限に抑えた高分子X線結晶学用オールインワンサンプルホルダー
July 6th, 2019
適切な処理プロトコルと共に高分子X線結晶学のための新しいサンプルホルダーが提示される。このシステムは、結晶の成長、結晶浸漬、および結晶操作や取り付けを必要とせずに、周囲および低温の両方で回折データ収集を可能にします。
このサンプルホルダーは、結晶の成長やX線回折データの収集に使用できます。このサンプルホルダーは、MXコミュニティで広く使用されている24ウェルプレートでの使用のために作られました。非常に重要な側面は、操作が必要ないことです。
ここで説明したこれらの側面を特徴とするサンプルホルダーは、以前は存在しませんでした。何かを見ることは、単にそれについて読むよりもはるかに優れています。ビデオを見ることで、見込み客は新しいサンプルホルダーの特徴と複雑さをすぐに把握することができます。
まず、湿った、糸くずのない布を使用して、きれいな、ほこりのない表面を作成します。箱から1つのサンプルホルダーを取り出し、裏側COCホイルの損傷や不要な穿刺を避けるために、きれいな表面に黄色の箔を上に向けてそっと置きます。一般的に使用されるカバースライドで行われるように、黄色の箔に結晶化滴を設定します。
ピペットを使用してホイルの破裂やピアスを避けるために、滴を穏やかに置きます。タイプ 2 およびタイプ 3 サンプル・ホルダでは、推奨される最大の 2 つのドロップが推奨されます。タイプ 1 サンプルホルダーには、最大 3 滴を配置できます。
サンプルホルダーを裏返し、24ウェルのリンブロスタイルのプレートのプレグリースキャビティに置きます。サンプルホルダーの位置決め補助器を使用して、最適な位置に導きます。不要な蒸発を避けるために、サンプルホルダーの正しい位置を確認してください。
透過光顕微鏡下に結晶板を置くことにより、偏光子を使用しなくても、実験の妨害を受けることなく結晶成長を監視する。透過光顕微鏡で凍結保護を行います。細かいカニューラを使用して外側のCOC箔をそっと突き刺します。
内側の黄色のホイルが手つかずのままであることを確認してください。穿刺は、操作されるドロップのすぐ隣にする必要があります。突いた穴に細かい紙の芯を挿入します。
黄色のポリイミド箔に触れるまで、慎重に芯を前方に押し出します。穿穿ホイルと接触して芯を保ちます。芯はすべての余分な解決策を吸い取るでしょう。
完全な液体除去に要する時間は、溶液の粘度および母液組成物に依存する。すべての液体を吸い取った後、紙の芯をそっと引き込みます。母液を取り出した後には見えない場合があるので、ドロップの位置を覚えておいてください。
同じ穴を通して押し出された先端を使用して、少量の凍結保護剤溶液を適用するために標準的なピペットを取ります。自己治癒COC箔を再シールするには、保護された指を穴の上に約1秒間そっと置き、穿刺を横切ってスライドさせます。温度の上昇と組み合わせてわずかな圧力は、大きすぎない穿刺の再密封を促進します。
リガンドを母液中のリガンドを反応管内で所望の濃度で溶解する。不溶性粒子を除去するために、12,000倍gで10分間溶液を回転させます。必要に応じて、温度制御された遠心分離機を使用します。
長い押し出しピペットチップを使用して、COC箔とポリイミドフィルムの間の隙間に最大3マイクロリットルのリガンド含有溶液を穏やかに配置し、先端を引き込みます。自己治癒COC箔を再シールするには、保護された指を穴の上に約1秒間そっと置き、穿刺を横切ってスライドさせます。膜全体に拡散を可能にするために、しばらくの間、実験をインキュベートします。
浸漬時間は、拡散溶液の粘度とその成分に大きく依存します。リガンド浸漬工程を複数回繰り返し、その後異なるリガンドを浸します。溶剤の散乱を最小限に抑えるには、データ収集前に余分な溶液を除去します。
事前に確立された条件で安定した、湿度制御されたビームライン環境を保障しなさい。周囲温度での回折データ収集を行うために、鉗子を使用して指定された点で透明なCOC箔を静かに持ち上げ、それを剥がします。サンプルホルダーをキャビティからそっと持ち上げ、すぐに事前に用意された磁気サンプルホルダーベースに挿入します。
このステップでは接着剤は必要ありません。ベース内のサンプルホルダーの正しい位置を確保するために穏やかな圧力を適用します。取り外し可能な外輪を持つサンプルホルダーの場合は、外側のリングにつかまって穏やかな圧力をかけ、指定されたブレークポイントで断ち切ります。
これで、サンプルはセンタリングと回折データの収集の準備が整いました。サンプルホルダーをビームラインゴニオメータに取り付け、ホルダーの正しい位置を確認します。ゴニオメータの形状に応じて、回折実験中に影を落とすことなく、サンプルホルダを最大160度回転させることができます。
紙の芯を使用し、余分な母液を取り除くために裏側から黄色のポリイミド箔を軽く触ります。これで、サンプルはセンタリングと回折データの収集の準備が整いました。周囲温度に対して行われる極低温での現場回折データ収集に備え、サンプルを液体窒素に突っ込み、SPINE互換バイアルに移します。
サンプルホルダータイプ2と3のジオメトリは、ロボット支援サンプル取り付けに使用できる標準的なSPINEサンプルバイアルへの転送を可能にします。サンプルホルダータイプ1とタイプ2は、24ウェルのリンブロスタイルのプレートの井戸に収まるように設計されています。個々のサンプルホルダーは、ウェルの縁に最適な位置を確保するために、外側の縁の両側に位置付け補助を含みます。
24ウェルリンブロスタイルのプレートは、母液の500マイクロリットルに対して293ケルビンでの低下を平衡化するためにタイプ1サンプルホルダーと一緒に使用されました。偏光子の有無にかかわらず透過光顕微鏡を用いて5時間後に40〜50ミクロンの結晶を観察した。鶏卵白リソチーム結晶を有するサンプルホルダーを、HZB-MXビームライン14.3の湿度制御気流に配置した。
典型的な回折画像をここに示します。回折画像上の高い背景散乱は検出できません。ポリイミド箔の汚染を避けなければならないことが重要です。
また、試料ホルダを正確に配置し、結晶操作を注意深く行うことが重要である。サンプルホルダーは、微小分子結晶学において最も重要なステップの1つである非常に繊細な結晶の取り扱いを可能にする。その使用はサンプルを破壊する可能性を大幅に減少させる。
概要
高分子X線結晶解析用の新しいサンプルホルダーが導入され、結晶操作なしで様々な温度での結晶成長とその場での回折データ収集が可能になりました。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 高分子X線結晶解析
- 結晶成長技術
- 回折データ収集
背景
- 従来の方法では結晶の操作が必要で、エラーが生じる可能性があります。
- 既存のサンプルホルダーでは実験中の容易な取り扱いができません。
- MXコミュニティでは結晶化に24ウェルプレートが一般的に使用されています。
- 正確な結果を得るためには、結晶成長を妨げることなく監視することが重要です。
研究の目的
- 結晶成長とデータ収集のプロセスを簡素化するサンプルホルダーを提示すること。
- 実験中の結晶操作の必要性を排除すること。
- サンプルホルダーの効果的な使用のためのプロトコルを提供すること。
使用した方法
- サンプルホルダーのための清浄な表面の準備。
- ホルダーへの結晶化滴の配置。
- 透過光顕微鏡を使用した結晶成長の監視。
- 常温および極低温でのその場での回折データ収集。
主要な結果
- 最小限の操作で成功した結晶成長が観察されました。
- バックグラウンド散乱なしで明確な回折画像がデータ収集から得られました。
- 標準的な24ウェルプレートとの互換性を持つように設計されたサンプルホルダー。
- 効果的な冷凍保護とリガンド浸透プロトコルが確立されました。
結論
- 新しいサンプルホルダーはX線結晶解析実験の容易さを大幅に向上させます。
- 結晶化プロセスの効率的な監視と操作を可能にします。
- このイノベーションは収集された回折データの品質を向上させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Macromolecular X-ray crystallography remains a cornerstone for high-resolution structural biology in drug discovery, yet fragile crystal handling introduces significant risk of sample loss and data degradation. This all-in-one sample holder minimizes mechanical intervention during crystal growth, ligand soaking, cryoprotection, and data collection, thereby increasing the likelihood of obtaining usable diffraction data from delicate macromolecular crystals. By reducing handling-induced damage, the tool supports more reliable target structure determination, a critical early step in structure-guided drug design and lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural characterization of fragile macromolecular targets without inducing lattice damage during manipulation.
- Operational Value: Reduces crystal loss during ligand soaking and cryoprotection steps, improving success rates in early-stage target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports in situ monitoring of crystal growth and ligand diffusion under controlled conditions, enabling real-time assessment of compound binding.
- Operational Value: Eliminates need for crystal transfer between plates or mounts, streamlining workflow for high-throughput crystallization screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides structural data from native-state crystals preserved through minimal handling, enhancing confidence in target-ligand interaction models.
- Operational Value: Compatible with standard 24-well Linbro plates and SPINE vials, facilitating integration into automated crystal mounting and beamline pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The sample holder supports a seamless workflow from crystallization drop setup to in situ X-ray diffraction data collection at ambient or cryogenic temperatures, reducing transfer steps between discovery and structural validation stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing via structural observation of ligand-bound states without disrupting crystal integrity during screening.
- Screening: Provides a standardized, reusable platform for drop setup and monitoring, improving reproducibility across crystallization trials.
- Analytics: Yields low-background diffraction images suitable for quantitative electron density mapping and ligand pose validation.
- Translational Research: Maintains crystal viability from ambient screening to cryogenic data collection, supporting continuous structural analysis.
- Enterprise Reuse: Designed for repeated use across multiple targets and campaigns, reducing consumable waste and setup time in shared crystallography facilities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in structural data by minimizing handling-induced artifacts and preserving native crystal packing.
- Operational Value: Standardizes crystal manipulation steps, reducing variability and training burden across multidisciplinary teams.
- Strategic Value: Lowers failure rate in structure determination projects, improving return on investment in target validation efforts.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions based on reliable structural data, reducing late-stage attrition due to incorrect target assumptions.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with micropipette techniques and fluorescence- or transmission-light microscopy for drop setup and monitoring.
- Dependent on access to beamlines equipped for in situ diffraction and humidity-controlled environments.
- Necessitates standardized training to ensure consistent foil piercing, wick use, and resealing procedures across users.
- Must account for variations in mother liquor viscosity when optimizing cryoprotectant and ligand soaking durations.
- Limited to compatible plate formats (e.g., 24-well Linbro-style) and may require adaptation for other crystallization screening platforms.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:37
Setting up Crystallization Drops and Observing Crystal Growth
1:56
Crystal Manipulation
4:23
In Situ Diffraction Data Collection at Ambient Temperature and at Cryogenic Temperature
6:20
Results: Novel Sample Holder in Macromolecular X-Ray Crystallography for Crystal Growth, Crystal Manipulation, and X-Ray Diffraction Data Collection
7:23
Conclusion
