Name: 背景散乱を最小限に抑えた高分子X線結晶学用オールインワンサンプルホルダー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶ 高分子X線結晶学の新規オールインワンサンプルホルダー。結晶成長から回折データ収集まで操作不要で実施でき、背景散乱を最小限に抑えた高品質データ取得が可能。標準24ウェルプレート対応。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、ビームタイムアクセスとサポートのためにヘルムホルツ・ゼントルム・ベルリンが運営するBESSY IIと、サンプル環境と技術設計の部門が設計と建設、3Dプリンター施設へのアクセスを支援してくれたことに感謝したいと思います。

注意:後続のすべての作業では、サンプルホルダーへの汚染の可能性があるため、黄色のポリイミド箔を保護されていない指で触れてはならないことが非常に重要です。また、保護された鉗子の使用を強くお勧めします。
1. サンプルホルダー
<ol><li>3種類のサンプルホルダーのいずれかを使用します。 注: 新開発サンプルホルダーの 3 つの異なるバージョンを図 1に示します。それらのすべては、黒いプラスチックサポート構造、外側に気密COC箔、内側に微多孔構造ポリイミド箔が含まれています。タイプ1(図1A)には固定された外側のプラスチックリングが含まれていますが、タイプ2および3(図1B、1C)の場合、外輪は自動サンプル搬送システムで使用するために指定されたそれぞれのブレークポイントで機械的に切断することができます(赤色を参照)。図 1Bの矢印)。サンプルホルダーの設計は黄色のポリイミド箔の複数の結晶化の滴の組み立てを可能にする。材料は可視光に対して非常に透明であるため、結晶化実験の監視を損ないません。21 μmの厚いポリイミド箔はまた5 μmの気孔を特色にし、後で浸すことによって簡単な結晶操作を可能にする。X線の透過は、高分子結晶学において一般的に使用される回折データ収集エネルギーにおいて全て1.0に近いため、回折実験における背景散乱に対する箔の寄与はごくわずか28である。</li>
</ol>2. 結晶化ドロップの設定
<ol><li>湿った糸くずのない布を使用して、清潔でほこりのない表面を作成します。箱からサンプルホルダーを1つ取り出し、黄色い箔を上向きにして、裏側のCOCホイルの損傷や不要な穿刺を避けるために、清潔な表面にそっと置きます。</li>
	<li>一般的に使用されるカバースライドで行われるように、黄色の箔に最大推奨体積2μLの結晶化滴を設定します。ピペットを使用してホイルの破裂やピアスを避けるために、滴を穏やかに置きます。タイプ1(図2A)のサンプルホルダーには最大3滴を配置できますが、タイプ2と3のサンプルホルダーには推奨最大値(図2C)があります。</li>
	<li>サンプルホルダーを裏返し、24ウェルのリンブロスタイルのプレートのプレグリース付きキャビティに置きます。サンプルホルダーの位置補助具(図1Aの赤い矢印を参照)を使用して、最適な位置に導きます。</li>
	<li>不要な蒸発を避けるために、サンプルホルダーの正しい位置を確認してください(図2A)。</li>
</ol>3. 結晶成長の観察
<ol><li>透過光顕微鏡の下に結晶化板を配置することにより、偏光器の有無にかかわらず、実験の妨害なしに結晶成長を監視する(図4)。</li>
	<li>SBSフットプリントプレートで使用するために設計されたタイプ3(図1C)の小型の18mmサンプルホルダーを使用する場合は、SBSフットプリントプレートを処理できるイメージングロボットを使用して、より自動化された方法で結晶の成長を監視します。</li>
</ol>4. 結晶操作
注:透過光顕微鏡の下で後続のすべてのステップを実行することをお勧めします。
<ol><li>
クライオ保護
	<ol>
<li>細かいカニューレを使用して外側のCOC箔をそっと突き刺します。内側の黄色の箔が手つかずのままであることを確認します。穿刺は、操作されるドロップのすぐ隣にある必要があります (図3A,3C)。</li>
		<li>細かい紙の芯を使用し、突き穴に挿入します。黄色のポリイミドホイルに触れるまで、芯を慎重に前方に押します。芯は穿き付いたホイルと接触しておいてください。芯は、すべての余分な溶液を吸い取ります。完全な液体除去に要する時間は、溶液および母液組成物の粘度に依存する(図3B)。</li>
		<li>すべての液体が吸い取られた後、ゆっくりと紙の芯を引き込みます。それは母酒の除去後に見えないかもしれないので、ドロップの位置を覚えておいてください。</li>
		<li>標準的なピペットを取り、クライオ保護溶液の少量、最大を適用します。3 μL、押し出された先端(例えば、ゲルローディングチップ)を使用して、同じ穴を通す。液体が分配されたら、先端を引き込みます。黄色の箔の多孔性は、箔全体に拡散を可能にします。あなたの結晶の凍結保護を達成する時間は非常に採用されたソリューションとそのコンポーネントに依存します。</li>
		<li>自己治癒型COCホイルを再シールするには、保護された指を約1sの穴にそっと置き、穿刺を横切ってスライドさせます。高温と組み合わせてわずかな圧力は、大きすぎない穿刺の再シールを促進します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
リガンド浸漬 注:余分な母酒は、リガンド浸漬前に除去することができる。この操作を行うには、4.1.1 から 4.1.3 に記載されている手順に従います。<ol>
<li>反応管内の所望の濃度で母酒中のリガンドを溶解する。</li>
		<li>不溶性粒子を除去するために、12,000 x gで溶液を10分間回転させます。必要に応じて、温度制御遠心分離機を使用します。</li>
		<li>ボリュームをゆっくりと最大にします。3 μLのリガンド含有溶液を、長い押し出されたピペット先端を用いてCOC箔とポリイミド膜との隙間に含有する。先端を引き込みます。</li>
		<li>自己修復COCホイルを再シールするには、保護された指を約1sの穴にそっと置き、穿刺を横切ってスライドさせます(4.1.5も参照)。</li>
		<li>膜全体の拡散を可能にするために、しばらくの間実験をインキュベートします。浸漬時間は、拡散溶液およびその成分29の粘度に大きく依存する。</li>
		<li>手順 4.2.1 から 4.2.5 を複数回繰り返し、その後異なるリガンドを浸します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 周囲温度でのその現場回折データ収集
注: 溶媒の散乱を最小限に抑えるには、データ収集の前に余分な溶液を除去してください。
<ol><li>事前に確立された条件30と安定した湿度制御ビームライン環境を確保してください。</li>
	<li>透明なCOC箔を鉗子を使って指定したポイントでゆっくりと持ち上げ、ヨーグルトカップから蓋を取り除くように剥がします(図6B)。</li>
	<li>サンプルホルダーをキャビティからゆっくりと持ち上げ、すぐに予め用意された磁気サンプルホルダーベースに挿入します。この手順には接着剤は必要ありません (図6B)。</li>
	<li>穏やかな圧力をかけて、ベース内のサンプルホルダーの正しい位置を確保します。</li>
	<li>サンプルホルダーをビームラインゴニオメーターに取り付け、ホルダーの正しい位置を確認します。ゴニオメーターの形状に応じて、サンプルホルダーは回折実験中にシャドウを引き起こすことなく、最大160°回転させることができます。</li>
	<li>ペーパーウィックを使用し、余分な母酒を除去するために裏側から黄色のポリイミド箔を穏やかに触れます。その段階では、リガンド浸漬またはクライオ保護も同様に行われる可能性があることに注意してください。これで、サンプルを中心に回回しデータを収集する準備ができました。</li>
	<li>取り外し可能な外輪を持つサンプルホルダーを使用する場合は、外輪を保持して穏やかな圧力をかけ、指定されたブレークポイントでブレークオフします(図6C)。これで、サンプルを中心に回回しデータを収集する準備ができました。</li>
</ol>6. 低温でのその現場回折データ収集
注: 手順 4.1.1 を実行して、サンプルから残留母酒を除去することをお勧めします。4.1.3 に。溶媒の散乱を最小限に抑えるために、次の手順を続行する前に。ほとんどのサンプルは、以前のクライオ保護31なしで液体窒素に移され得る。凍結保護が必要な場合は、手順 4.1.1 を参照してください。4.1.5 に。
<ol><li>鉗子を使用して指定されたポイントでCOC箔をゆっくりと持ち上げ、それを剥がします(ステップ5.1.2を参照)(図6A)。</li>
	<li>サンプルホルダーをキャビティから取り外し、磁気サンプルホルダーベースに取り付けます。穏やかな圧力は、正しく、堅い継手を保障するために適用されてもよい(ステップ5.1.5、図6Bを参照)。 注:対称的に配置された断裂点は、穏やかな圧力を加えることによってサンプルホルダーの外輪を簡単に取り外すことを可能にします(ステップ5.1.8.、図6Cを参照)。今、サンプルホルダーは準備ができて、液体窒素に突入することができます。サンプルホルダータイプ2および3(図1B、1C)の形状は、ロボット支援サンプル取り付けに使用できる標準的なSPINEサンプルバイアルへの転送を可能にします(図6D)。</li>
</ol>

<ol><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li>
<li>Mac Sweeney, A., D'Arcy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+mounting+protein+crystals+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).</li>
<li>Kalinin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sample+mounting+technique+for+room-temperature+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).</li>
<li>Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+gentle+method+for+mounting+crystals+in+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).</li>
<li>Pflugrath, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+cryocrystallography-methods+for+cooling+and+mounting+protein+crystals+at+cryogenic+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures.</a> Methods. 34 (3), 415-423 (2004).</li>
<li>Garman, E. F., Schneider, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+Cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Macromolecular Cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).</li>
<li>Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ab+initio+crystallographic+structure+determination+of+insulin+from+protein+to+electron+density+without+crystal+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).</li>
<li>Martínez-Rodríguez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+crystallographic+studies+of+an+active-site+mutant+hydantoin+racemase+from+Sinorhizobium+meliloti+CECT4114%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).</li>
<li>Hope, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryocrystallography+of+biological+macromolecules%3A+a+generally+applicable+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+B%3A+Structural+Science%22%5BJournal%5D)">Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method.</a> Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).</li>
<li>Teng, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+free-standing+thin+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).</li>
<li>Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O'Neill, K., Gillilan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+mounts+for+high-throughput+macromolecular+cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).</li>
<li>Jian-Xun, Q., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+loopless+mounting+method+for+cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Physics+B%22%5BJournal%5D)">An improved loopless mounting method for cryocrystallography.</a> Chinese Physics B. 19 (1), 010601(2010).</li>
<li>Kitatani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Technique+of+Manipulating+a+Protein+Crystal+Using+Adhesive+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Express%22%5BJournal%5D)">New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material.</a> Applied Physics Express. 1 (3), 037002(2008).</li>
<li>Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+adhesive+sample+holders+for+advanced+crystallographic+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).</li>
<li>Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+as+a+protein+crystal+mounting+material+to+reduce+background+scatter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).</li>
<li>Parkin, S., Hope, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+Cryocrystallography%3A+Cooling%2C+Mounting%2C+Storage+and+Transportation+of+Crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals.</a> Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).</li>
<li>Papp, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+compact+and+precise+sample+holder+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Scientific Reports. 5, 10451(2015).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+macromolecular+crystallography+using+a+micro-patterned+silicon+chip+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).</li>
<li>Zarrine-Afsar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Crystallography on a chip.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).</li>
<li>Mueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixed+target+matrix+for+femtosecond+time-resolved+and+in+situ+serial+micro-crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Structural+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography.</a> Structural Dynamics. 2 (5), 054302(2015).</li>
<li>Feld, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Z+polymer+sample+supports+for+fixed-target+serial+femtosecond+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).</li>
<li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-plate+protein+crystallization%2C+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).</li>
<li>Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+high-performance+X-ray+transparent+crystallization+plates+for+in+situ+protein+crystal+screening+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).</li>
<li>Aller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+diffraction+in+high-throughput+structure+determination+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).</li>
<li>Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrystalDirect%3A+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li>
<li>Antimonov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-area+Kapton+x-ray+windows%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+X-Ray%2FEUV+Optics+and+Components+X%22%5BJournal%5D)">Large-area Kapton x-ray windows.</a> Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F(2015).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+dyes+into+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Penetration of dyes into protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).</li>
<li>Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raoult%27s+law+revisited%3A+accurately+predicting+equilibrium+relative+humidity+points+for+humidity+control+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Raoult's law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).</li>
<li>Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cryocooling+of+naked+crystals%3A+are+cryoprotection+agents+always+necessary%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary?</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).</li>
<li>Mueller, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macromolecular+crystallography+beamlines+at+BESSY+II+of+the+Helmholtz-Zentrum+Berlin%3A+Current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+Plus%22%5BJournal%5D)">The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives.</a> The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141(2015).</li>
<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration%3A+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li>
<li>Yano, O., Yamaoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenic+properties+of+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Cryogenic properties of polymers.</a> Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).</li>
</ol>

報告されたサンプル保有者に関する特許出願は、ヘルムホルツ・ゼントルム・ベルリンによって、以下の登録番号および登録日をドイツ特許商標庁に提出しました: DE 10 2018 129 125.6、登録日 11月20日2018年;DE 10 2018 125 129.7、登録日 2018年10月11日;DE 10 2017 129 761.8、登録日 2017年12月13日。その後、PCTルートを介した国際特許出願は、DE 10 2017 129 761.8の優先度を使用して、PCT/DE2018/101007が出願されている。2018年12月6日に、2018年12月6日に「DE 2018 106 955.1」というユーティリティモデルの登録が行われました。サンプルホルダーは、ジェナバイオサイエンス、イエナ、ドイツによって商品名XtalToolとXtalTool /HTの下で市販されています。

結晶化実験に適しています。新しいサンプルホルダーは、24ウェルリンブロタイププレート(タイプ1および2)または各ウェルの直径が18mm(タイプ3)の24ウェルSBSフットプリントプレートのいずれかを使用して、標準的な吊り下げドロップ結晶化実験に使用できます。それらは標準的な顕微鏡カバーのスリップの代わりに使用することができる。非晶質COC箔はシステムの気密性を保障する。結晶化実験のモニタリングは、透過性箔を用いるので透過光顕微鏡を用いて可能である。私たちの知るなか、24ウェル結晶化プレートには他のサンプルホルダーは存在せず、結晶操作や回折実験を可能にし、それが成長するドロップから結晶を機械的に除去することなく、結晶を除去します。この分野の多くの研究者は、96ウェルの座り落ち板に比べて大きなドロップ量を使用できるため、結晶最適化のためにこのようなプレートに依然として依存しているため、これは特に重要です。これらのより大きな滴量では、より大きな結晶が得られる可能性がある。
結晶操作のための適合性。外側のCOC箔の自己治癒特性と内側の黄色のポリイミド箔の微多孔構造により、結晶環境にアクセスでき、結晶を機械的に他の容器に移すことなく操作することができます。これにより、サンプルホルダーが非常に便利になります。私たちが知っている唯一の他のシステムは、この間接的で穏やかな結晶へのアクセスを可能にする、CrystalDirectシステム26です。しかし、CrystalDirectは、特殊な96ウェル結晶化プレートを使用する必要があるため、柔軟性が低くなります。結晶が成長している箔は、結晶化実験を封印するのと同じであり、自己治癒ではありません。これは、リガンドまたは凍結保護剤の結晶への送達のためのレーザーアブレーションによって箔に突き刺さった開口部が開いたままになり、液体蒸発の可能性が高まることを意味します。これは、COC箔が何度も貫通しても結晶が直接環境にさらされるわけではない設計とは対照的です。
周囲温度での現場回折実験に対する適合性。サンプルホルダーは、結晶化プレートから直接前方に取り外し、磁気ベースに貼り付け、ビームラインゴニオメーターに置くことができます。室温での回折実験の場合、サンプルを定義された湿度33の空気流に入れることをお勧めします。結晶の周りの母酒は、背景の散乱を減らすために、ゴニオメーターにサンプルホルダーを置く前に除去することができる。このようなセットアップは、時間の安定しています。
100 K での操作および貯蔵のための使用済み材料の適合性。サンプルホルダーの製造に使用される材料もポリイミドフィルムも、低温34まで冷却することによって悪影響を受けません。したがって、低温(例えば、100K)でサンプルホルダーを使用しても、深刻な問題は発生しません。
100 K での現場回折実験の適合性.窒素流れの100Kでのデータ収集の場合、サンプルホルダーは前の段落と同様に結晶化プレートから取り出し、磁気ベースに貼り付け、ビームラインゴニオメータ上の100Kの気体窒素流れに入れる必要があります。必要に応じて、サンプルは凍結保護されてもよいが、裸のサンプルの場合、これはほとんどの場合31で必要でない可能性がある。100 K での実験では、外側のプラスチック リングを取り外すことができるため、サンプルホルダータイプ 2 および 3 の方が適しています。したがって、それらはより小さいサイズであるため、アイシングが起こりにくいはずです。ただし、タイプ1のサンプルホルダーであっても使用できます。実験小屋で湿度が高すぎず、ホルダーのアイシングが適切に整列していることを考えると、実際には問題ではありません。
制限事項。サンプルホルダーの幾何学は160°の総回転範囲の回転方法によって妨げられない回折データのコレクションを可能にする。これは、ほとんどの結晶システムで完全な回折データセットを取得できるように十分です。これが不可能な場合は、結晶を超えるデータをマージする必要があります。結晶を一緒に成長させる場合、個々の結晶の一部だけが露出するように、入射X線ビームのサイズを調整することができるかもしれません。極端な場合は、MeshAndCollect アプローチ35と同様のデータ収集戦略に頼る必要があります。要約すると、サンプルホルダーに関連する特定の制限がありますが、ほとんどの場合、これらを克服することができます。もちろん、状況が発生する可能性は常に高く、いずれも不可能です。このような場合、他の結晶取り付け方法に頼る必要があるかもしれません。
我々は、高分子結晶学のための新しいタイプのサンプルホルダーを説明し、様々な用途のためのサンプルホルダーの適合性を実証しました。タンパク質結晶のシンプルで再現性の高い取り扱いとサンプルホルダーのユニークな特性を考慮すると、これらのサンプルホルダーは、高分子用サンプルホルダーの武器庫に貴重な追加となると考えています。結晶。

生物高分子の三次元構造に関する知識は、すべての基礎生物学的、生化学的、生物医学的研究において重要な基礎となる。これは、例えば創薬など、このような研究の特定の翻訳的側面にも及ぶ。原子分解能X線結晶学でこのような三次元情報を得るためのすべての方法の中で、利用可能なすべての構造情報の90%がX線によって寄与しているという事実によって証明されるように、最も強力で最も顕著なものです。結晶学1.X線結晶学の主な前提条件は、同時にその主な制限は、回折品質の結晶を製造し、回折実験のために準備する必要があることです。このステップは、まだメソッドの主要なボトルネックの 1 つを構成します。
歴史的に、タンパク質結晶からの回折データは周囲温度で収集されていました。個々の結晶は、データ収集の前にガラスまたは石英毛細血管に慎重に移され、母酒は結晶が乾燥しないように毛細血管に添加され、毛細血管は2、3、2、3、密封された。 4.1980年代以降、X線放射の電離特性と高分子結晶の放射線感受性が差し迫っているため、周囲温度でのデータ収集が方法に厳しい限界を与えるようになった。その結果、高分子結晶を100Kまで冷却し、このような低温5,6で回折データを収集することで、放射線損傷の影響を軽減するアプローチが開発されました。低温での作業では、毛細血管のサンプルの取り付けは、熱伝達率が低いため実用的ではなくなりました。それにもかかわらず、毛細血管の使用にも継続的な取り組みがあり、特に反拡散結晶化実験から、低温回折作業7、8のために、それにもかかわらず、標準となりました。高分子結晶学におけるアプローチは、薄い有線ループ9、10の中に母酒の薄膜によって保持される高分子結晶を取付ける。このループベースの取り付けに対して、多くの改良点(リソグラフィループや類似構造11の導入など)が時間をかけて行われてきましたが、1990年代初頭に開発された基本原理は現在でも使用されています。今日の高分子結晶のほとんどの回折データ収集は、まだこのアプローチ5に依存していると安全に述べられているかもしれません。
時間が経つにつれて、ループベースの取り付け方法のいくつかの興味深い新しい開発や変更がありましたが、これらのアプローチは、これまでのところ、コミュニティで広く採用されていません。一つは、より低い背景散乱12、13、14を達成するために開発された結晶のいわゆるループレスマウントです。もう一つは、グラフェンシースを使用して結晶性サンプルを包み、乾燥から保護することです。グラフェンは、その非常に低いX線散乱背景15のために、その点で適した材料です。
最近では、サンプルマウントの分野の開発は、主にサンプルスループット16を増加させる目的でマウントを標準化することに焦点を当てたか、例えば、複数のサンプル17を保持することができるマウントの設計に焦点を当てました。シリコンフレーム上のパターン化された膜は、主にシリアル結晶学18、19、20、21、22の分野で何百もの小さな結晶を保持することができる。
これまでに説明したサンプル取り付け方法はすべて、ある程度の手動介入が必要であり、これはサンプルに機械的損傷を引き起こす固有の危険性があることを意味します。そのため、結晶の回折データを成長環境内で収集できるように、サンプル環境をエンジニアリングすることで新しいアプローチが求められています。そのような方法の1つは、その現場またはプレートスクリーニング23、24で呼ばれ、すでに世界中の様々なシンクロトロン源25で多数の高分子結晶学ビームラインで実施されている。しかし、この方法の使用は、結晶板の幾何学的パラメータと計測器のサンプルポイントの周りに利用可能なスペースによって制限されます。
さらに別のアプローチは、いわゆるCrystalDirectシステム26で実現されています.ここで、結晶化滴全体が自動的に収穫される。結晶が成長した箔は、レーザーを使用してカスタムカットされ、サンプルホルダー27として直接使用されます。
ここで説明する作業では、ユーザーが成長室からデータ収集装置に結晶性サンプルを移動させ、サンプルを簡単に操作できるようにするサンプルホルダーを開発することを目的としていました。高分子結晶学の分野の多くの研究者は、大規模なスクリーニングキャンペーンで特定された条件を変更することによって結晶成長を最適化するために24ウェル結晶化フォーマットをまだ使用しているので、新しいサンプルホルダーは、この形式と互換性があります。以下では、新しいサンプルホルダーの設計について説明し、その中のデータ収集およびリガンド浸漬用のサンプルホルダーの取り扱いと性能を実証する。最後に、この新しいサンプルホルダーの適合性と、さまざまな作業手順の制限について説明します。

<table><tbody><tr><td>AF Satetiss</td><td>RS Components</td><td>101-5738</td><td>lint-free paper, multiple retailer</td></tr><tr><td>Cannula</td><td>Dispomed Neoject</td><td>25 G 5/8" 0.5 x 16, Ref:10026</td><td>Multiple retailer</td></tr><tr><td>COC foil</td><td>HJ-Bioanalytik GmbH</td><td>900360</td><td></td></tr><tr><td>ComboPlate</td><td>Greiner Bio-one / Jena Bioscience</td><td>662050 / CPL-131</td><td>グリース抜きプレート, 複数小売店</td></tr><tr><td>Cryoバイアル</td><td>イエナ バイオサイエンス</td><td>CV-100</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ リサーチ プラス&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>3123000012</td><td>0.1 - 2.5 & マイクロ;L容量</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30125150</td><td>1.5 mL g-Safe エッペンドルフ品質、メーカー参照番号</td></tr><tr><td>鉗子 ウスベック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10750313</td><td></td></tr><tr><td>GELoader エッペンドルフ品質</td><td>エッペンドルフ</td><td>30001222</td><td>押出&nbsp; チップ (0.2 - 20 & マイクロ;L)、メーカー参照番号</td></tr><tr><td>磁気 CryoVials</td><td>分子寸法</td><td>MD7-402</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>R21</td><td></td></tr><tr><td>紙芯</td><td>dental2000</td><td>64460</td><td>紙芯のセット、複数の小売業者</td></tr><tr><td>Rotiprotect Nitril-eco&nbsp;</td><td>カールロス</td><td>TC14.1</td><td>パウダーフリー、複数の小売業者</td></tr><tr><td>SuperClearプレートイ</td><td>エナバイオサイエンス</td><td>CPL-132</td><td>プレグリースプレート</td></tr><tr><td>UHUスーパーグル</td><td>ーUHU GmbH&Co KG</td><td>45545</td><td>メーカー参照番号、複数小売業者</td></tr><tr><td>VeroBlackPlus</td><td>Alphacam</td><td>OBJ-40963</td><td>メーカー参照番号</td></tr><tr><td>XtalTool&nbsp;</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>X-XT-101</td><td>サンプルホルダーセット</td></tr><tr><td>XtalTool HT</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>X-XT-103 / X-XT-104</td><td>SPINE対応サンプルホルダーセット</td></tr><tr><td>XtalToolBases</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>X-XT-105</td><td>マグネティックサンプルホルダーベースセット</td></tr></tbody></table>

背景散乱を最小限に抑えた高分子x線結晶学用オールインワンサンプルホルダー

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

高分子X線結晶学(MX)は、生体高分子の高分解能三次元知識を得るための最も顕著な方法である。この方法の前提条件は、高位の結晶性標本を高分子から増殖させ、回折実験に備える必要があることです。この調製手順は、典型的には、それが成長した溶液から結晶を除去し、リガンド溶液または凍結保護溶液に結晶を浸漬し、実験に適したマウント上に結晶を固定することを含む。この手順の深刻な問題は、高分子結晶がしばしば機械的に不安定で、むしろ壊れやすいということです。その結果、このような壊れやすい結晶の取り扱いは、構造決定試行において容易にボトルネックとなりうる。このような繊細な結晶に加えられた機械的な力は、分子の規則的なパッキングを妨げる可能性があり、結晶の回折力の損失につながる可能性があります。ここでは、結晶の取り扱い工程を最小限に抑え、構造判定実験の成功率を最大化するために開発された新しいオールインワンサンプルホルダーを紹介します。サンプルホルダーは、一般的に使用される顕微鏡カバースリップを交換することにより、結晶滴のセットアップをサポートしています。さらに、リガンド浸漬、凍結保護、複雑な形成などのインプレース結晶操作を可能にし、結晶化キャビティを開かず、結晶処理を行わずに行えます。最後に、サンプルホルダーは、周囲温度と低温温度の両方で現場のX線回折データの収集を可能にするために設計されています。このサンプルホルダーを使用することで、結晶化から回折データ収集に至る途中で結晶を損傷する可能性が大幅に減少します。

サンプルホルダータイプ1は、24ウェルリンブロスタイルのプレートの井戸に収まるように設計されています。個々のサンプルホルダーには、ウェルの縁に最適な位置を確保するために、外縁の両側に位置決め補助剤が含まれています(図1A、図2A)。最大体積2μLの個々の結晶化滴を最大3個まで、黄色のポリイミド箔(図2B)に配置することができる。タイプ 2 および 3 のサンプルホルダーの場合は、最大体積 2 μL の最大値をそれぞれ 2 滴ずつ設定することをお勧めします。24のサンプルホルダーは1つの24ウェルリンブロ版(図3D)に合うことができる。
サンプルホルダータイプ1を用いて24ウェルリンブロプレート上の結晶化実験を行った。1 μLの卵白リソザイム溶液(15mg/mL)を、サンプルホルダー上の黄色ポリイミド箔上に50mM NaAc pH 4.7、500mM NaCl及び25%(w/v)PEG-6000を含む母液の1μLと混合した(表1)。この低下は母酒の500μLに対して293Kで平衡化し、5時間後に40〜50μmの大きさの結晶が観察された(図4)。結晶成長は、偏光子の有無にかかわらず透過光顕微鏡(図4)を用いて観察することができる。高透明フィルムは、従来の光顕微鏡または自動結晶イメージングシステムの両方を使用して、結晶成長条件の最高の観察と監視を保証します。紫外線を用いて結晶成長観察を行った。
結晶の周りから母酒を取り出した後、卵白リソザイム結晶を含むサンプルホルダーを結晶化板から採取し、HZB-MXビームライン14.332上の湿度制御気流に入れた。回折データは、13.8 keVエネルギーで150μmビームを用いて周囲温度で収集し、4 x 1010光子/秒、画像あたり5秒の露光時間を使用した。一般的な回折画像を図5に示します。回折画像上の高い背景散乱は検出できません。さらなる実験的な詳細と関連するデータ処理統計を表 2に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig1.jpg"> 図 1: 新しいサンプルホルダーの概略図。サンプルホルダーは、非晶質環状オレフィン共重合体(COC)箔で外側に覆われた黒いプラスチック支持体で構成されています。この箔(青色で着色)は、非常に透明で自己治癒です。それはまた実験のガスの堅さを保障する。内箔(黄色で着色)は、X線に対して非常に透明であるバイオ不活性ポリイミドで作られています。この箔に、結晶化滴を置くことができる。サンプルホルダーの外縁には、赤い矢印(パネルA)によって示される2つの位置決め補助剤が含まれており、結晶化プレートの個々のプレグリースキャビティ上にサンプルホルダーを正確に配置することができます。(A) 固定外付けサポートリング付きの直径22mmのサンプルホルダー(タイプ1)。(B) 取り外し可能な外部サポートリング付きの直径22mmのサンプルホルダー(タイプ2)。(C) 取り外し可能な外部サポートリング付きの直径18mmのサンプルホルダー(タイプ3)。後者の2つはSPINEの標準を使用して自動化されたサンプル取付けロボットとハイスループットの方法でそれらを使用するために開発された。指定されたブレーク ポイントは、パネルBの赤い矢印で強調表示されます。パネルCの黒い矢印は、位置マーカーを示します。黄色箔の外周に突出ピンは、製造プロセス中にポリイミド箔を整列させるために必要です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig2.jpg"> 図 2:サンプルホルダーは、一般的に使用される顕微鏡カバースリップと同様に、24ウェルリンブロプレート上で使用することができます。それは空洞の気密を密封する。配置補助は、キャビティ上のサンプルホルダーの正しい位置を保証します(パネルAの赤い矢印)。タイプ1のサンプルホルダー(パネルB)に最大3個の個別滴を配置できますが、タイプ2または3のサンプルホルダーに配置される推奨される最大ドロップ数は2個です。各ドロップの最大推奨体積は 2 μL<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig2large.jpg" target="_blank">です。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig3.jpg"> 図 3:24タイプ1のサンプルホルダーは、24ウェルプレートにフィットします。サンプルホルダーは、示されているように24ウェルプレート上の2つの向きに配置することができます(パネルD)。 カニューレは、同じ穴(パネルB)に優しく挿入されたペーパーウィックを使用して、結晶化ドロップ(パネルAおよびC)から余分な酒を除去するために、背面のCOC箔を貫通するために使用されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig4.jpg"> 図 4: 偏光子を搭載した透過顕微鏡を介して観察された鶏卵白リソザイム結晶の画像。個々の結晶は、沈殿タンパク質溶液から容易に判別される。この画像の結晶は平均サイズが40 μm x 50 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig4large.jpg" target="_blank">です。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig5.jpg"> 図 5:サンプルホルダー上で成長したリソザイム結晶の典型的なX線回折画像。X線に曝露する前に、すべての過剰な母酒は結晶の周りから除去された。回折データは、97.5%相対湿度の湿度制御サンプル環境を用いて、電子貯蔵リングBESSY II32でBL14.3の周囲温度で収集した。サンプルホルダーによる高い背景は観察できません。イメージの破線は、解像度リングを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig6.jpg"> 図 6:サンプルホルダーは回折データ収集のために準備される。まず、COCフィルムを鉗子を用いて穏やかに持ち上げ、次いで剥がす(パネルA)。続いて、サンプルホルダーを空洞から取り出し、マーカー(パネルB)で示されるまで磁気ベースの中央穴に挿入する。 中央部に保持することにより、外輪に緩やかな圧力が加えられ、対称的に配置された指定されたブレークポイント(パネルC)を使用して中央部を解放する。除去後、サンプルホルダーは液体窒素に突入し、標準的なSPINEバイアルに移すことができます。例えば、パックに配置すると、自動サンプル取り付けロボットが通常のサンプル(パネルD)として認識するシンクロトロンサイトに搬送できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig6large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>結晶化の詳細</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>メソッド</td>
			<td>ハンギングドロップ、蒸気拡散法</td>
		</tr>
<tr>
<td>プレートタイプ</td>
			<td>スーパークリアプレート</td>
		</tr>
<tr>
<td>温度 (K)</td>
			<td>293の</td>
		</tr>
<tr>
<td>タンパク質濃度 (mg mL-1)</td>
			<td>15歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>貯留液の組成</td>
			<td>50 mM NaAc pH 4.7, 500 mM NaCl, 25 % (w/v) PEG-6000</td>
		</tr>
<tr>
<td>ドロップの体積と比率</td>
			<td>2 μL 合計、1:1 比(タンパク質:母酒</td>
		</tr>
<tr>
<td>貯水池の体積</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>インキュベーション時間</td>
			<td>12 時間</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:記載された結晶化実験の実験詳細。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>データの収集と処理</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>波長(Å)</td>
			<td>0.89429</td>
		</tr>
<tr>
<td>温度 (K)</td>
			<td>293の</td>
		</tr>
<tr>
<td>検出 器</td>
			<td>ラヨニクス MX225 CCD</td>
		</tr>
<tr>
<td>結晶検出器距離(mm)</td>
			<td>120の</td>
		</tr>
<tr>
<td>画像あたりの回転範囲(°)</td>
			<td>0.5年</td>
		</tr>
<tr>
<td>総回転範囲(°)</td>
			<td>120の</td>
		</tr>
<tr>
<td>画像あたりの露光時間(s)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>スペース グループ</td>
			<td>P43 212</td>
		</tr>
<tr>
<td>単位セル パラメータ (Å)</td>
			<td>a = 79.01、 b = 79.01、c = 37.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>モザイク (°)</td>
			<td>0.07</td>
		</tr>
<tr>
<td>解像度範囲 (Å)</td>
			<td>39.50 ~ 1.35 (1.37 ~ 1.35)</td>
		</tr>
<tr>
<td>反射の総数</td>
			<td>191940 (8932)</td>
		</tr>
<tr>
<td>一意の反射の数</td>
			<td>27020(1292)</td>
		</tr>
<tr>
<td>完全性 (%)</td>
			<td>99.88(99.20)</td>
		</tr>
<tr>
<td>多様 性</td>
			<td>7.1 (6.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>平均 I/σ(I)</td>
			<td>15.0件(1.9)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rミース35 (%)</td>
			<td>6.3 (107.0)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rピム36 (%)</td>
			<td>2.4 (40.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/237 </td>
			<td>99.9(68.5)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ISA38
</td>
			<td>16.1年</td>
		</tr>
<tr>
<td>ウィルソン B ファクター (Å2)</td>
			<td>17.0年</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 回折データ収集および処理統計。

適切な処理プロトコルと共に高分子X線結晶学のための新しいサンプルホルダーが提示される。このシステムは、結晶の成長、結晶浸漬、および結晶操作や取り付けを必要とせずに、周囲および低温の両方で回折データ収集を可能にします。

背景散乱を最小限に抑えた高分子X線結晶学用オールインワンサンプルホルダー

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

このサンプルホルダーは、結晶の成長やX線回折データの収集に使用できます。このサンプルホルダーは、MXコミュニティで広く使用されている24ウェルプレートでの使用のために作られました。非常に重要な側面は、操作が必要ないことです。ここで説明したこれらの側面を特徴とするサンプルホルダーは、以前は存在しませんでした。何かを見ることは、単にそれについて読むよりもはるかに優れています。ビデオを見ることで、見込み客は新しいサンプルホルダーの特徴と複雑さをすぐに把握することができます。まず、湿った、糸くずのない布を使用して、きれいな、ほこりのない表面を作成します。箱から1つのサンプルホルダーを取り出し、裏側COCホイルの損傷や不要な穿刺を避けるために、きれいな表面に黄色の箔を上に向けてそっと置きます。一般的に使用されるカバースライドで行われるように、黄色の箔に結晶化滴を設定します。ピペットを使用してホイルの破裂やピアスを避けるために、滴を穏やかに置きます。タイプ 2 およびタイプ 3 サンプル・ホルダでは、推奨される最大の 2 つのドロップが推奨されます。タイプ 1 サンプルホルダーには、最大 3 滴を配置できます。サンプルホルダーを裏返し、24ウェルのリンブロスタイルのプレートのプレグリースキャビティに置きます。サンプルホルダーの位置決め補助器を使用して、最適な位置に導きます。不要な蒸発を避けるために、サンプルホルダーの正しい位置を確認してください。透過光顕微鏡下に結晶板を置くことにより、偏光子を使用しなくても、実験の妨害を受けることなく結晶成長を監視する。透過光顕微鏡で凍結保護を行います。細かいカニューラを使用して外側のCOC箔をそっと突き刺します。内側の黄色のホイルが手つかずのままであることを確認してください。穿刺は、操作されるドロップのすぐ隣にする必要があります。突いた穴に細かい紙の芯を挿入します。黄色のポリイミド箔に触れるまで、慎重に芯を前方に押し出します。穿穿ホイルと接触して芯を保ちます。芯はすべての余分な解決策を吸い取るでしょう。完全な液体除去に要する時間は、溶液の粘度および母液組成物に依存する。すべての液体を吸い取った後、紙の芯をそっと引き込みます。母液を取り出した後には見えない場合があるので、ドロップの位置を覚えておいてください。同じ穴を通して押し出された先端を使用して、少量の凍結保護剤溶液を適用するために標準的なピペットを取ります。自己治癒COC箔を再シールするには、保護された指を穴の上に約1秒間そっと置き、穿刺を横切ってスライドさせます。温度の上昇と組み合わせてわずかな圧力は、大きすぎない穿刺の再密封を促進します。リガンドを母液中のリガンドを反応管内で所望の濃度で溶解する。不溶性粒子を除去するために、12,000倍gで10分間溶液を回転させます。必要に応じて、温度制御された遠心分離機を使用します。長い押し出しピペットチップを使用して、COC箔とポリイミドフィルムの間の隙間に最大3マイクロリットルのリガンド含有溶液を穏やかに配置し、先端を引き込みます。自己治癒COC箔を再シールするには、保護された指を穴の上に約1秒間そっと置き、穿刺を横切ってスライドさせます。膜全体に拡散を可能にするために、しばらくの間、実験をインキュベートします。浸漬時間は、拡散溶液の粘度とその成分に大きく依存します。リガンド浸漬工程を複数回繰り返し、その後異なるリガンドを浸します。溶剤の散乱を最小限に抑えるには、データ収集前に余分な溶液を除去します。事前に確立された条件で安定した、湿度制御されたビームライン環境を保障しなさい。周囲温度での回折データ収集を行うために、鉗子を使用して指定された点で透明なCOC箔を静かに持ち上げ、それを剥がします。サンプルホルダーをキャビティからそっと持ち上げ、すぐに事前に用意された磁気サンプルホルダーベースに挿入します。このステップでは接着剤は必要ありません。ベース内のサンプルホルダーの正しい位置を確保するために穏やかな圧力を適用します。取り外し可能な外輪を持つサンプルホルダーの場合は、外側のリングにつかまって穏やかな圧力をかけ、指定されたブレークポイントで断ち切ります。これで、サンプルはセンタリングと回折データの収集の準備が整いました。サンプルホルダーをビームラインゴニオメータに取り付け、ホルダーの正しい位置を確認します。ゴニオメータの形状に応じて、回折実験中に影を落とすことなく、サンプルホルダを最大160度回転させることができます。紙の芯を使用し、余分な母液を取り除くために裏側から黄色のポリイミド箔を軽く触ります。これで、サンプルはセンタリングと回折データの収集の準備が整いました。周囲温度に対して行われる極低温での現場回折データ収集に備え、サンプルを液体窒素に突っ込み、SPINE互換バイアルに移します。サンプルホルダータイプ2と3のジオメトリは、ロボット支援サンプル取り付けに使用できる標準的なSPINEサンプルバイアルへの転送を可能にします。サンプルホルダータイプ1とタイプ2は、24ウェルのリンブロスタイルのプレートの井戸に収まるように設計されています。個々のサンプルホルダーは、ウェルの縁に最適な位置を確保するために、外側の縁の両側に位置付け補助を含みます。24ウェルリンブロスタイルのプレートは、母液の500マイクロリットルに対して293ケルビンでの低下を平衡化するためにタイプ1サンプルホルダーと一緒に使用されました。偏光子の有無にかかわらず透過光顕微鏡を用いて5時間後に40〜50ミクロンの結晶を観察した。鶏卵白リソチーム結晶を有するサンプルホルダーを、HZB-MXビームライン14.3の湿度制御気流に配置した。典型的な回折画像をここに示します。回折画像上の高い背景散乱は検出できません。ポリイミド箔の汚染を避けなければならないことが重要です。また、試料ホルダを正確に配置し、結晶操作を注意深く行うことが重要である。サンプルホルダーは、微小分子結晶学において最も重要なステップの1つである非常に繊細な結晶の取り扱いを可能にする。その使用はサンプルを破壊する可能性を大幅に減少させる。

an-all-one-sample-holder-for-macromolecular-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

タンパク質微結晶を用いたX線結晶解析のためのプロトコールが提示されている。精製後又はcelluloにおける微結晶-grown インビボで分析する2つの例が比較されます。...

タンパク質結晶の微結晶化および<em&gt;セルロで</em&gt;回折

肺炎球菌から炭水化物基質結合タンパク質の豊富な生化学的および構造解析を実行するための合理化されたプロトコルが表示されます。...

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

このメソッド小角 x 線散乱 (SAXS) x 線結晶構造解析によってクローニング、表現、および構造決定のための組換え Nsa1...

S. 酵母から Nsa1 の非構造化領域をモデル化する x 線小角散乱と x 線結晶解析を組み合わせること

このプロトコルでは、作製し、室温での x...

シリアル結晶の結晶 x 線回折その場その場での動的光散乱のためのマイクロ流体チップ

ビームライン セットアップ ラウエ (多色放射) または回折 (単色放射) を使用して単一の結晶または粉末試料の急速な二次元 x 線蛍光と x...

・鉱物及び岩石試料の蛍光を放射光 x 線回折

以降構造決定、蛍光タンパク質セルリアンの多くの小さい水晶採集部分回折データ セットの構成で使用するための完全な回折データ セットを取得する MeshAndCollect...

MeshAndCollect を使用して蛍光タンパク質セルリアンの構造解析

ここでは、いくつかの放射光ビームラインで自動スクリーニングおよびデータ コレクションは、使用可能なオプションを使用する方法をについて説明します。科学者が、放射光に冷凍サンプルを送る回折特性を上映、データ...

完全自律型の特性と生体高分子の結晶からのデータ収集

本論文では、透析法とX線回折実験を用いて、オンチップタンパク質結晶化のために開発されたマイクロ流体チップの製造プロトコルについて詳しく述べる。微細加工プロセスにより、半透膜再生可能なセルロース透析膜を、チップの2層間の任意の分子量カットオフと統合することが可能になります。...

In Situ X線回折研究のためのマイクロダイアルシスによるチップ上のタンパク質の結晶化

データの信号対雑音比は、マイクロクリスタルからのX線回折測定を行う上で最も重要な考慮事項の1つです。VMXmビームラインは、このような実験のための低ノイズ環境とマイクロビームを提供します。ここでは、VMXmおよび他のマイクロフォーカス高分子結晶結晶ビームライン用のマイクロ結晶を取り付け、冷却するためのサンプル調製方法について述べる。...

VMXmビームラインにおける微結晶のサンプル調製パイプライン

ここでは、長波長高分子X線結晶構造解析実験のために、ダイヤモンド光源のビームラインI23上の真空端局への極低温サンプル調製および結晶の移送のためのプロトコルを提示する。...

ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

このホワイトペーパーでは、水晶ベースのフラグメントスクリーニングのための完全なXChemプロセスについて、アクセスの申請から始まり、その後のデータ配布までのすべてのステップについて説明します。...

ダイヤモンド光源のXChem施設における効率的なフラグメントスクリーニングの実現

学ぶ 高分子X線結晶学の新規オールインワンサンプルホルダー。結晶成長から回折データ収集まで操作不要で実施でき、背景散乱を最小限に抑えた高品質データ取得が可能。標準24ウェルプレート対応。

背景散乱を最小限に抑えた高分子X線結晶学用オールインワンサンプルホルダー

さらに動画を探す