インビトロバス発酵システムを用いて内生生物とヒト腸内細菌叢との相互作用の解析
2019年8月23日
ここで説明する内生生物とヒト腸内微生物叢との相互作用をインビトロバッチ発酵システムを用いて調べるプロトコルである。
当社のプロトコルは、高スループットと内生剤とヒト腸内微生物叢の相互作用の迅速なスクリーニングに広く使用することができます。低コストで、ホストの新陳代謝による干渉効果の回避この手順は、診断に使用される可能性があります。
まず、BIF EPSとデンプンを磁気攪拌機の熱湯に個別に溶解し、1リットル当たり8グラムの濃度を両立させます。調製した塩基性培養培地に、VI、BIF EPS溶液を100ミリリットル加えて、培養VI BIF溶液を作る。培養VIデンプン溶液を作るためにデンプン溶液の100ミリリットルを追加します。
炭素源で2つの媒体をオートクレーブし、炭素源を制御しない媒体を摂氏121度で15分間オートクレーブする。彼らは室温に冷却し、干し草とシステインを追加することができます。各培地の5ミリリットルのサブサンプルを培養管に移す。
そして嫌気性のインキュベーターで保管してください。残りのメディアは摂氏4度で保存します。ヒトの便サンプルを調製するには、新鮮な便サンプルの1グラムをガラスビーカーのpH 7で0.1モル嫌気性PBSの10ミリリットルに移します。
その後、スラリーを達成するためにそれを攪拌するためにガラス棒を使用しています。嫌気性チャンバーでは、3つの調製された発酵培地に、濾過された便スラリーの500マイクロリットルを個別に加える。その後、摂氏37度でインキュベートします。
24時間と48時間後、嫌気室に発酵サンプルを2ミリリットル収集します。そして、チャンバーの外の遠心分離機を6000倍Gで、3分間行う。上清を多糖類分解解析および短鎖脂肪酸測定に使用する新しい遠心管に慎重に移します。
遠心分離ペレットを摂氏80度で保存します。各プレコートシリカゲル60 TLCアルミニウム板に発酵上清の0.2マイクロリットルをロードし、広げるために渦巻く。その後、乾燥するために熱気とヘアドライヤーを使用してください。
サンプルプレートの一方の端を20ミリリットルのギ酸に浸します:n-ブタノール:水溶液は、電気泳動がほぼ他方の端まで延びるまで数分間浸します。その後、鉗子でプレートを取り出し、ヘアドライヤーで乾燥させます。その後、オルシノール試薬にプレートを2分間浸して染めます。
そして、再び乾燥します。プレートを120度のベーキングオーブンに移し、3分間加熱します。次に、プレートの写真を撮って、TLCバンドを測定してEPSの劣化を評価します。
SCFA生産に対するEPSの効果を調べるために、発酵した上清の1ミリリットルを2ミリリットルの遠心管に加え、各サンプルに25重量/体積%の25重量/体積%を0.2ミリリットル加えます。溶液を完全に混合する渦。混合物を13,000倍Gで20分間遠心分離する。
その間、120ミリモル酢酸、プロピオン性、酪酸、同位体、バリック、およびイソ球酸の溶液をチューブに調製する。次に、調製した各酸の1ミリリットルを、25重量/体積%のメタリン酸の1.2ミリリットルを含むチューブに加えます。そして、標準的なカクテルとしてガスクロマトグラフィー器具のサンプルボトルにそれらをロードします。
遠心分離機からチューブを取り出し、上清を新鮮なチューブに移します。0.22ミクロンフィルターを搭載したシリンジを使用して、ガスクロマトグラフィー分析のために上澄みを新しいチューブにフィルターします。本研究では、粘膜EPSの産生がPYGプレート上のビフィズス菌ロンガム培養で、72時間の嫌気性インキュベーション後に観察された。
培養用擦り傷の遠心分離、続いてエタノール沈殿および乾燥により、セルロース様EPSの回収が行われた。TLC分析の結果、ヒトの便微小生物によるデンプンの分解速度はBIF EPSよりも速いことが明らかになった。主な座標分析は、培養VI BIFおよび培養VIデンプン群を示し、互いに別々にクラスター化し、EPSおよびデンプンの可用性がヒトの便細菌群を異なって形成することを示す。
効果サイズに関する線形判別分析は、ジェネラコリンゼラ、コプロコッカス、パラバクテロイド、およびロドシュードモナスが培養VIデンプンサンプルよりも培養VI BIFサンプルに有意に豊富であったことを示す。さらに、GC測定は、酢酸、プロピオン性、同位体、酪酸、イソ球酸、およびババラ酸を含む発酵培養物から測定されたSCFAを示す。24時間48時間の発酵後、6つのSCFA濃度のうち5基は類似しており、培養VIBIF、培養VIデンプン、および培養VI群間で統計的に異ならなかった。
しかしながら、培養VIデンプン基よりも培養VIBIF群においてプロプリオン酸濃度が有意に高く、48時間の発酵後であった。この実験を嫌気条件下で行い、固いサンプルをできるだけ早く嫌気性インキュベーターに移します。TLC試薬の一部は危険です。
それらを使用するように注意する必要があります。
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概要
本プロトコルでは、in vitroバッチ発酵システムを用いて、エンドバイオティクスとヒト腸内細菌叢との相互作用を調査します。本手法はハイスループットかつ迅速なスクリーニング向けに設計されており、ホストの代謝による干渉を最小限に抑えることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- 腸内健康
- メタボロミクス
背景
- エンドバイオティクスはヒトの健康において重要な役割を果たしている。
- 腸内細菌叢は代謝プロセスに大きな影響を与える。
- これらの相互作用を理解することは、診断に役立つ可能性がある。
- 現在の手法は、宿主の代謝による干渉によって制限される可能性がある。
研究目的
- エンドビオティックと微生物叢の相互作用を研究するためのプロトコルを開発すること。
- これらの相互作用の高スループットスクリーニングを可能にすること。
- 研究のための低コストな代替手段を提供すること。
使用方法
- BIF EPSとデンプンの熱水への溶解。
- 発酵用培地の調製。
- 相互作用研究におけるバッチ発酵システムの利用。
- 腸内細菌叢に対するエンドバイオティクスの影響のモニタリング。
主な結果
- BIF EPSおよびデンプン溶液の調製に成功したこと。
- 信頼性の高い発酵プロトコルの確立。
- 本プロトコルの診断への応用の可能性を実証したこと。
- エンドバイオティクスと微生物叢の相互作用に関する知見。
結論
- 本プロトコルは、微生物叢研究における有用なツールとなります。
- これにより、代謝相互作用の理解が促進されます。
- 今後の応用により、診断能力が向上する可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
本プロトコルは、エンドバイオティクスと腸内細菌叢の相互作用の高スループットかつ低コストなin vitroスクリーニングを可能にし、動物モデルへの依存度を下げ、宿主代謝による干渉を最小限に抑えます。微生物コミュニティの変化と代謝産物生成に関する定量的なデータを提供することで、マイクロバイオーム調節療法のリスク低減に不可欠な初期段階のターゲットバリデーションを支援します。このアプローチは、化合物の細菌叢への影響に関するメカニズムの理解がリード化合物の選定やポートフォリオ決定に寄与する、前臨床探索ワークフローに直接的に適用可能です。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： プレバイオティクスや薬剤などのエンドバイオティクスがヒト腸内細菌叢をどのように調節するかを解析することを可能にし、標的仮説の検証を支援します。
- 運用的価値： 16S rRNAシーケンシングやSCFA定量などの汎用的な手法を用いて、再現性があり、メカニズムに関する有用な情報を得られるデータを生成します。
- 予測的価値： 構造の異なる炭水化物（例：EPSとデンプン）に対する微生物の反応を区別し、構造活性相関の評価を補助します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：微生物叢介在性の化合物分解を一貫して評価するための、標準化された嫌気的発酵条件を提供する。
- 運用の価値：サンプル調製が簡便であり、TLCやGCのような拡張可能な読み取りが可能なため、ハイスループットフォーマットに対応している。
- アッセイの即応性：定量可能なアウトプット（SCFAプロファイル、コミュニティの変動）を生成し、スクリーニングキャンペーン全体で化合物の効果を比較するために使用できる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナル価値： ヒト糞便接種物を使用することで、動物モデルと比較してヒトの生理学的条件への適合性が向上します。
- メカニズムによるリスク低減： エンドバイオティクスに対する特定の微生物応答者（例：Collinsella、Coprococcus）を特定し、バイオマーカーに関連した作用機序を裏付けます。
- 前臨床の連続性： 用量および時間依存的なプロファイリング（24h/48h）を可能にし、後続のモデルにおける安全性および有効性のウィンドウに関する情報を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットバリデーションからリード最適化に至る創薬の探索的な一連の流れに適合しており、特に、in vivoでの挙動を予測するために微生物叢が介在する代謝の理解が不可欠な、マイクロバイオーム活性化合物において有用です。
- ディスカバリーバイオロジー： 化合物の曝露を微生物組成および機能の測定可能な変化に結びつけることで、ハイポセシス駆動型のエンドバイオティクススクリーニングを支援します。
- スクリーニング： 多糖類分解のためのTLCおよびSCFA定量のためのGCを直交的なリードアウトとして用いることで、微生物叢の相互作用の迅速な評価を可能にします。
- 分析： 多変量データ（16Sシーケンシング、SCFA濃度）を生成し、処置効果の統計的比較および有意な変動の特定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： ヒト由来の微生物叢を使用することで、マウスモデルよりも臨床応用に向けた予測の信頼性を向上させます。
- エンタープライズ再利用： 本プロトコルはさまざまなエンドバイオティクス（医薬品、プレバイオティクス、多糖類）に適応可能であり、治療領域を横断して再利用可能なプラットフォームとなります。
運用および企業への影響
- 科学的価値：分解パターンと微生物応答者の直接的な観察を通じて、微生物叢とエンドバイオティックの相互作用におけるメカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値：低コスト、嫌気的ワークフロー、および標準化されたサンプリングにより、再現性とラボ間の比較可能性を向上させる。
- 戦略的価値：薬物の有効性や毒性に影響を及ぼし得る微生物叢介在性の代謝を特定することで、より早期のgo/no-go判断を可能にする。
- ポートフォリオへの影響：有益な微生物叢およびSCFAプロファイルへの影響に基づいた、リスク調整済みの化合物の優先順位付けを支援する。
実施上の考慮事項
- サンプルの完全性を維持するために、嫌気性微生物学および無菌操作の専門知識が必要です。
- 完全な読み取りパネルを得るには、TLCプレート、ガスクロマトグラフィー、および16S rRNAシーケンシングのインフラへのアクセスが必要です。
- ラボ間での標準化には、一貫した糞便ドナーの処理および嫌気培養条件が必要です。
- 他のエンドバイオティクス（endobiotics）へ適応させるには、発酵条件下での溶解性と安定性の試験が必要となります。
- 実用上の制限として、ドナーの微生物叢の変動や、危険なTLC試薬（例：orcinol、formic acid）の慎重な取り扱いが挙げられます。
バイオファーマ FAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
