Name: マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶマクロファージによるアポトーシス胸腺細胞の貪食解析法。C57BL/6マウスからの細胞調製とefferocytosis効率評価、阻害剤効果の検討を含む免疫学研究に応用可能な実験プロトコルです。

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シャオ・ラボの研究は、医学部からの革新的な賞と、シンシナティ大学の内部医学部門からの若手教員パイロット賞と NIDDK/NIH からのグラント DK K01_095067 によって支えられています。

実験マウスを、我々のマウスコロニーにおいて飼育および維持した。すべての動物の仕事は、シンシナティ大学の制度的動物ケアと使用委員会 (IACUC) のガイドラインに従って行われました。
1. CFSE 標識されたアポトーシス胸腺細胞の調製
<ol><li>Euthanize を10分間吸入して 2つのナイーブ C57/B6 マウスを解剖し、胸腔を開いて、湾曲した微細先端鉗子を有する胸腺を rpmi1640 培地培地 10 mL を含む組織培養ペトリ皿に取り出し (引き抜く)。</li>
	<li>顕微鏡のスライドの2つの曇りの端に対して全体の胸腺を粉砕し、100μ m の細胞ストレーナーを介して懸濁液を濾過することにより、単一細胞懸濁液を得る。</li>
	<li>10 mL の胸腺懸濁液を 50 mL チューブに集め、300 x gで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を除去し、1x PBS の 40 mL で再懸濁し、血球計数器で細胞数をカウントする。</li>
	<li>300 x gで5分間遠心分離し、上清を除去します。</li>
	<li>再懸濁は、1つの細胞懸濁液として 50 mL チューブ中に 20 mL の 1x PBS (2 x 10 8 細胞以上の場合は、残りの細胞を別の 50 ml チューブ中の 1 x PBS で再懸濁) にしました。</li>
	<li>5μ m の CFSE を、CFSE ストック溶液 (2.5 mM) の40μ l を 1x PBS の 20 mL にピペットで50し、チューブ 2-3 回を反転させることによってよく混ぜることによって、別の 1 mL (20 mL) の 1x PBS を1つの容積 (20ml) で作ります。</li>
	<li>ステップ1.7 から CFSE の20ml をステップ1.6 からの細胞懸濁液の20ml に加える (CFSE の最終濃度は現在2.5 μ m である)。 注:20 mL の細胞懸濁液ごとに、20 mL の CFSE チューブが必要です。</li>
	<li>細胞と CFSE 混合チューブを 2-3 回反転させ、室温で2分間の暗所で混合物をインキュベートしてから、10 mL の熱不活性化ウマ血清を加えて反応を停止する。</li>
	<li>室温で5分間 300 x gで 50 mL チューブ混合物を遠心分離します。 注: CFSE ラベリングが成功すると、セルペレットは淡黄色になります。</li>
	<li>上清を取り除き、40 mL の細胞ペレットを 1x PBS で再懸濁し、血球計数器で細胞数をカウントする。</li>
	<li>細胞懸濁液を 300 x gで5分間遠心し、上清を廃棄する。</li>
	<li>40 mL の RPMI1640 培地培地で再び細胞ペレットを洗浄する。</li>
	<li>上清および再懸濁細胞を RPMI1640 培地組織培養培地 (RPMI1640 培地、20 mM HEPES、10% FBS (熱不活性化)、20 mM グルタミン、および1x ペン/喉頭炎) で除去し、100 mM組織培養皿にて 7 x 106 細胞/ml の濃度で行う。 注: より多くの細胞が得られる場合、別の 100 mm のティッシュの培養皿は必要である。</li>
	<li>5% の CO2 で供給される組織培養インキュベーター内で、最終濃度1μ m の細胞懸濁培養にスタウロスポリンを加え、37° cで4時間培養する。</li>
</ol>2. 腹膜マクロファージの作製
<ol><li>2つの C57B6 マウス (または実験室にある任意の遺伝子操作マウス) を、0日目に 3% 熟成したチオグリコール酸の1ml と共に腹腔内に注入する。</li>
	<li>Euthanize はステップ1.1 のように5日目にマウスを切断し、腹部の皮膚を切り取って皮を開け、腹膜をそのまま残す。10 ml の洗浄緩衝液 (RPMI1640 培地、2% FBS、0.04% EDTA) を 18 G 針で取り付けた10ml シリンジを使用して腹腔内にすばやく押し込むことによって腹膜腔を洗い流す。</li>
	<li>同じ針/シリンジで洗浄緩衝液をゆっくりと回収し、洗浄緩衝液を 50 mL チューブに集めます (詳細はヤンセンラボの第15条を参照してください)。</li>
	<li>腹膜 gavage を 1x PBS で2回洗浄し、RPMI1640 培地の組織培養培地中の腹膜マクロファージを、再懸濁プレートの各ウェルに 2 x 106 細胞/ml およびアリコート500μ l の密度で注入する。プレートを2時間組織培養インキュベーター内に残します。</li>
	<li>500μ l のフレッシュカルチャー培地を2回吸引し、交換することにより、浮遊細胞を取り除きます。</li>
	<li>必要に応じて、マクロファージ培養の各ウェルに図の凡例に示されている濃度で TAM 受容体チロシン阻害剤、RXDX-106 を追加し、別の2時間インキュベートします。</li>
</ol>3. アポトーシス性胸腺細胞による腹膜マクロファージの共培養
<ol><li>ステップ1からアポトーシス胸腺細胞を収集し、RPMI1640 培地培地で3回洗浄する。アポトーシス誘導の効率は、アネキシン V/7-AAD キットを使用してこの段階で測定することができます。</li>
	<li>プロトコル #2 からマクロファージ培養物の各ウェルに 0-12 x 106 個の細胞 (500 μ l 培地) を分配し、実験的な配置に従って (例えば、図 1を参照)。これにより、24ウェルプレートの各ウェルにおける 1 mL の全培養体積が可能になる。アポトーシス胸腺細胞の添加直前にブロッキング抗体を培養に加える。</li>
	<li>培養液を 5% CO2 で供給した組織培養インキュベーター中で4時間37° cで混合する。</li>
	<li>自由浮遊アポトーシス細胞を除去するために 1x PBS (500 μ m EDTA を含む) で培養の各ウェルを洗浄します。</li>
	<li>この段階で、CD11b でプレート結合マクロファージを染色する。<ol>
<li>染色バッファー (1x PBS, 1% BSA) を用いてプレート結合マクロファージを1回洗浄する。</li>
		<li>各ウェルに2μ l の CD11b を含む200μ l の染色緩衝液を加えます。</li>
		<li>プレートを4° c で20分間インキュベートします。</li>
		<li>染色緩衝液でプレートの各ウェルを3回洗浄する。</li>
		<li>200μ l の染色緩衝液を加え、蛍光顕微鏡下での画像分析のためにプレートを進行させる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>あるいは、PBS に 1% リドカインの1ml を加え、37° c で10分間インキュベートすることによって、プレート結合性マクロファージを切り離します。</li>
	<li>繰り返しピペッティングを使用して、プレート結合マクロファージをデタッチします。</li>
	<li>マクロファージ懸濁液を24ウェルプレートの各ウェルからの個々の5ml の丸底 FACS チューブに移す。</li>
	<li>300 x gで5分間遠心します。</li>
	<li>上清を除去し、2μ l の CD11b (染色バッファー中の1:200 希釈) を含む200μ l の染色緩衝液を加えた。</li>
	<li>染色バッファー内の細胞懸濁液を4° c で20分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞懸濁液を染色緩衝液で2回洗浄する。</li>
	<li>200μ l の染色バッファーを加え、フローサイトメーターを用いて FACS 分析を行い、CFSE 陽性マクロファージの割合を分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).</li>
<li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+death+and+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li>
<li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+cancer%3A+from+pathogenesis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).</li>
<li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research%3A+Where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li>
<li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li>
<li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li>
<li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+TAM+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076(2013).</li>
<li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative%2C+Gas6%2C+are+ligands+for+the+Tyro+3%2FAxl+family+of+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li>
<li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptor+tyrosine+kinases%3A+biologic+functions%2C+signaling%2C+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li>
<li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors%2C+Gas6%2C+and+protein+S%3A+roles+in+inflammation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li>
<li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li>
<li>Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mer+receptor+tyrosine+kinase+is+expressed+on+discrete+macrophage+subpopulations+and+mainly+uses+Gas6+as+its+ligand+for+uptake+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells.</a> Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).</li>
<li>Scott, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+clearance+of+apoptotic+cells+is+mediated+by+MER%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER.</a> Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).</li>
<li>Klarquist, J., Janssen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bm12+Inducible+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus+%28SLE%29+in+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice.</a> Journal of Visualized Experiment. (105), e53319(2015).</li>
<li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+expression+of+tyro3%2C+axl%2C+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Macrophage+%28Houst%29%22%5BJournal%5D)">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance%3A+progress+and+conundrums%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+in+Pathology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561(2015).</li>
<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li>
<li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li>
<li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagocytes%3A+neutrophils+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li>
</ol>

作者は何も開示することはありません。

アポトーシスは、多くのシグナルカスケードを含み、タンパク質の発現、分泌、および輸送を誘導する高度に保存された細胞死プロセスです。アポトーシスは、しばしば細胞形態変化17に関連する。アポトーシス細胞は、食細胞を誘引するサイトカインおよびケモカインを積極的に放出し、貪食のプロセスを開始し、タイトコントロール18の下で非常に複雑な経路である。一方、壊死細胞死は、炎症反応を引き起こす危険信号を放出する1.アポトーシス細胞の欠損または長期のクリアランスは、これらの細胞19の二次壊死につながる。したがって、アポトーシス誘導におけるタイミングは、実験において非常に重要である。細胞アポトーシス20を誘導するための多数の方法がある。しかしながら、誘導の持続時間および強度は、細胞型に依存する。最大の最適条件を決定するために滴定実験を設定することをお勧めします (90-95%)アポトーシスの生産。アネキシン-V/7-AAD...

私たちの体は、毎日1-10 のアポトーシス細胞を生成します。このような多数のアポトーシス細胞は、免疫応答が静止したままである方法でクリアされなければならない。アポトーシス細胞のクリアランスを適時に確保するために、多数の種類の組織の居住細胞および循環細胞がアポトーシス細胞1を巻き込むメカニズムを開発する。アポトーシスの機能不全調節は、様々な炎症性疾患および自己免疫2の発症および進行に関与している。アポトーシスはまた、癌の発症の病因および従来の治療法3,4に対するその後の耐性において重要な役割を果たす。アポトーシス細胞の除去は、一般に抗炎症反応を促進し、これは免疫学的許容寛容に結合し得る5。アポトーシス細胞クリアランスの障害は、自己免疫を促進し、ヒトおよびマウス6の両方における全身性自己免疫疾患の発症に寄与する。
細胞がアポトーシスを受けると、それらは内部リーフレットから膜の外側リーフレットにホスファチジルセリン (PtdSer) を暴露する。PtdSer は、その後、表面受容体を介して食細胞によって認識されるであろう。1ダース以上の受容体がアポトーシス細胞の貪食を認識および/または促進することが同定されている。一般に、アポトーシス細胞クリアランスには少なくとも3種類の表面受容体が関与する: テザリング受容体は、アポトーシス細胞を認識する。貪食のくすぐり, 開始します。chaperoning 受容体は、全体のプロセス7を促進する。TAM 受容体チロシンキナーゼ (TAM RTKs) は、 Tyro-3、 xl、およびMer から成り、主に免疫系8の骨髄細胞によって発現される。TAM RTKs の主な機能は、テザリング受容体としての役割を果たし、アポトーシス細胞や破片の貪食除去を促進することです。当社グループは、長年にわたり自己免疫の設定において、TAM 媒介性アポトーシス細胞クリアランスを研究してきました。ビタミン K 依存性タンパク質成長停止特異的タンパク質 6 (Gas6) およびプロテイン S (ProS) は、TAM 受容体9,10に結合し、活性化する。Gas6 は、心臓、腎臓、および肺で生成されます。長所は主に肝臓11で生産される。TAM は、Gas6/ProS の N 末端がアポトーシス細胞上の PtdSer に結合するような方法でアポトーシス細胞を認識し、Gas6/プロの C 末端は食細胞の表面に固定された TAM 受容体に結合します。他の受容体と共に、アポトーシス細胞の貪食が12に生じる。Mer はリガンドの長所と Gas6 の両方に結合することができますが、Gas6 は、抗 Mer 抗体13によってブロックすることができる、アポトーシス細胞の mer 媒介マクロファージ食のための唯一のリガンドであると思われることがわかりました。マクロファージはプロの食細胞です。マクロファージによるアポトーシス細胞の迅速なクリアランスは、細胞内抗原に対する炎症や自己免疫反応の阻害にとって重要である。Mer 受容体チロシンキナーゼは、マクロファージ貪食およびアポトーシス細胞14の効率的なクリアランスにとって重要である。マウス脾臓では、Mer は主にマージナルゾーンおよび有形の体マクロファージ13上に発現する。
ここで提示されるプロトコルは、細胞のアポトーシスを誘導し、プロセスと efferocytosis の効率を測定する方法を示すための基本的な方法を説明しています。これらのプロトコールは、異なる起源のアポトーシス細胞の貪食における他の細胞型による efferocytosis の研究に容易に適応することができる。

<table><tbody><tr><td>Ack溶解バッファー</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mer antibody</td><td>R&D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (clone M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 mM)</td><td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>Frosted slides</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>馬用血清(熱不活化)</td><td>Invitrogen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5647</td><td>1x PBS</td></tr><tr><td>PBS、1x</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>Selleck Chemicals</td><td>CEP-40783</td><td></td></tr> <tr><td>に 1% バッファーを調製スタウロスプリン(100mg)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2541-100</td><td>DMSOの214.3 mlを100mgに加えて、1mMのストッキング溶液を作ります</td></tr><tr><td>チオグリコール酸ミディアムブリューワー 修正</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>243010</td><td>1&acuteで3%チオグリコール酸緩衝液を準備します。PBSをオートクレーブ滅菌し、3ヶ月間暗所で保存します。</td></tr></tbody></table>

マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

細胞のアポトーシスは自然なプロセスであり、胚発育、恒常性調節、免疫寛容誘導、および炎症の解決において重要な役割を果たします。体内のアポトーシス破片の蓄積は、時間をかけて全身性自己免疫疾患につながる慢性炎症反応を引き起こす可能性があります。アポトーシス細胞の障害は、様々な自己免疫疾患に関与している。アポトーシスクリアランスは、生理的条件下で稀に検出される複雑なプロセスである。それは豊富な表面受容体とシグナル分子を含みます。アポトーシス細胞クリアランスの過程を研究することは、洞察力のある分子メカニズムとその後の生物学的反応をもたらし、新しい治療法の開発につながる可能性があります。ここでは、アポトーシス胸腺細胞の誘導に関するプロトコール、腹膜マクロファージの調製、およびフローサイトメトリーおよび顕微鏡法によるアポトーシス細胞クリアランスの解析について説明します。すべての細胞は特定の段階でアポトーシスを受け、多くの住宅および循環細胞はアポトーシスの破片を吸収することができます。したがって、ここで説明するプロトコルは、多くのアプリケーションで、アポトーシス細胞の結合および他の多くの細胞型による摂取を特徴付けるために使用することができる。

腹膜マクロファージを媒介とするアポトーシス胸腺細胞の貪食の解析腹膜マクロファージおよびアポトーシス細胞を調製し、プロトコールで説明したように共培養した。マクロファージを、氷上で20分間にわたって PE 共役抗 CD11b 抗体で剥離および染色した。その後、マクロファージをフローサイトメーターで洗浄・処理した。見られるように、アポトーシス細胞が培養物に加えられなかったとき、右下の象限に CFSE 陽性マクロファージは存在しない (図 1Aおよび図 2、最初のパネル)。チオグリコール酸を刺激した腹腔マクロファージは、アポトーシス細胞を巻き込む可変容量を有する。マクロファージの最大 30% が CFSE チャネルで陽性を示し、この実験で CFSE 標識されたアポトーシス細胞を摂取したことを示した (図 1)。CFSE 陽性マクロファージが異なる強度のために右下の象限に広がることに注意する価値があり、...

ここでは、アポトーシス胸腺細胞および腹膜マクロファージを調製するためのプロトコールを提示し、efferocytosis の効率および特異的阻害剤媒介性貪食のアポトーシス胸腺細胞のブロッキングを分析する。このプロトコルは、人工ビーズおよび細菌を含む他の粒子の細胞媒介性クリアランスにおいて広範な適用を有する。

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

私たちの体は毎日1〜100億個のアポトーシス細胞を生成します。これらの細胞の効率的なクリアランスは、細胞の破片を除去し、在庫を維持するのに役立ちます。この方法は、多くのアプリケーションにおいて、他の多くの貪食細胞タイプによるアポトーシス細胞結合および摂取を特徴付けるために用いることができる。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の上級技術者であるユクサン・ジェンです。胸腺細胞を収穫するには、ナイーブC57ブラック6マウスの胸腔を開いた後、曲面した細かい先端鉗子を使用して胸腺を引き出す。10ミリリットルのRPMI培地を含む組織培養皿に臓器を入れます。2つの顕微鏡スライドの曇った端に対して胸腺全体を粉砕し、得られた組織懸濁液を70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブにフィルター処理します。遠心分離によって胸腺細胞を収集し、40ミリリットルでペレットを再中断します。カウント後、再び遠心分離し、50ミリリットルチューブあたり新鮮なPBSの20ミリリットルで8細胞に最大2倍10倍まで再懸濁する。細胞に、チューブあたりPBSの20ミリリットルで5ミクロモルCFSEをラベル付けします。チューブを2〜3回反転させ、胸腺細胞を光から保護された室温で2分以下にインキュベートする前に混合します。インキュベーションの終わりに、10ミリリットルの加熱不活化馬血清で反応を停止し、遠心分離によって細胞を収集する。標識された細胞を40ミリリットルの新鮮なPBSで再中断し、その後40ミリリットルの培地で追加の洗浄を行う。培地洗浄後、胸腺細胞を7倍10回にして、培養培地濃度のミリリットル当たり6細胞に再懸濁し、100ミリの組織培養皿に細胞を播種する。次に、1つのマイクロモル最終濃度で細胞培養にスタウロスポリンを加え、4時間組織培養インキュベーターにプレートを入れます。腹膜マクロファージ分離の場合、5日目に腹膜を乱すことなく腹部皮膚を開く前に、ゼロ日目に3%熟成チオグリコール酸の1ミリリットルで腹腔内に2つのC57黒6マウスを注入する。腹腔を洗い流すために、18ゲージ針を装備した10ミリリットルのシリンジを使用して、10ミリリットルの洗浄バッファーを空洞に素早く押し込み、50ミリリットルのチューブに回収するための洗浄バッファーをゆっくりと吸引します。腹膜洗浄をPBSで2回洗います。腹膜マクロファージを、組織培養培地濃度のミリリットル当たり6個の細胞に対して2倍10回で再懸濁する。次の種子500マイクロリットルのマクロファージを24ウェルプレートの各ウェルに入れ、2時間組織培養インキュベーターにプレートを入れる。インキュベーションの終わりに、上清を吸引して浮遊細胞を除去し、各ウェルに500マイクロリットルの組織培養培地を加える。培養物の各ウェルに500マイクロリットルの培地で6回の胸腺細胞に直ちに0〜12倍10を加え、4時間組織培養インキュベーターにプレートを入れる。インキュベーションの終わりに、新鮮なPBSでそれぞれをよく2回洗い、フリーの浮遊アポトーシス細胞を取り除き、続いて染色バッファーで1回洗浄します。次に、プレート結合マクロファージに、十分に適した抗CD11b抗体を補った200マイクロリットルの染色バッファーで標識し、プレートを摂氏4度で20分間置きます。本代表的な実験では、チオグリコール酸刺激性腹膜マクロファージの最大30%が、これらの食細胞がCFSE標識アポトーシス細胞を摂取したことを示すCFSEチャネルで陽性シグナルを示した。アポトーシス細胞のマクロファージ巻き込みの顕微鏡観察は、個々のマクロファージ内のアポトーシス細胞の数が異なることを示す異なる強度のために、CFSE陽性マクロファージが右下象限に広がるにつれて、アポトーシス細胞を摂取するマクロファージの能力を調べるために不可欠である。マクロファージに対するアポトーシス細胞の比率が高くなると、アポトーシス細胞を摂取するマクロファージの数が増えるだけでなく、より多くのアポトーシス細胞を摂取するマクロファージの能力も高まります。別の実験では、CFSE標識アポトーシス胸腺細胞がマクロファージ培養物に4時間添加されたときに、マクロファージの約15%がCFSE陽性となった。Mer抗体は用量依存的にマクロファージ・エフェロサイトーシスをブロックし、全体的な閉塞は現在の設定におけるefferocytosis効率の約30%を占める可能性がある。さらに、新たに承認されたTAM受容体阻害剤は、約100ナノモル濃度までの用量依存的な方法でマクロファージ・エフェロサイトーシスを減衰させる。この数は、直接エフェロサイトスの効率に影響を与えるとして、常にアポトーシス細胞の割合を確認することを忘れないでください.食細胞性マクロファージは、ウエスタンブロットによってさらに分析され、巻き込みプロセスによって調節されるシグナル伝達分子を調べ、巻き込みのダイナミクスを研究するための顕微鏡検査によって分析することができます。

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

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Fixed Cell Efferocytosis Assay:蛍光顕微鏡を用いたマクロファージによるアポトーシス細胞のエフェロサイトーシス取り込みを研究する方法

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腹膜マクロファージによるアポトーシス性胸腺細胞のエフェロサイトーシスの解析

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がん細胞に対する事前活性化CD8+ T細胞の細胞毒性を研究するためのIn vitroアッセイ

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隣接セル受けてアポトーシス細胞死との相互作用によって生細胞に誘導されるイベントを細胞内シグナルの同定

本明細書では、 ショウジョウバエの分散胚細胞を用いた食作用アッセイを記載する。これにより、in vivoでの貪食レベルを簡単かつ正確に定量化し 、アポトーシス細胞の貪食に必要な新しい分子を同定することができます。...

アポトーシス細胞の食作用アッセイショウジョウバエ胚

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マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

ここで前の活性化 cd8 陽性の細胞毒性を調査するプロトコルについて述べるリアルタイム顕微鏡を介してアポトーシスがん細胞を検出することにより癌細胞に対して細胞の+ T。このプロトコルは、骨髄細胞による T 細胞抑制の背後にあるメカニズムを調査し、免疫抑制の骨髄系細胞の封鎖を介してT...

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

神経変性疾患は、調節不変のミクログリア機能に関連付けられている。本稿では、iPSCマクロファージによる神経芽細胞細胞の貪食のインビトロアッセイについて概説する。量的顕微鏡読み出しは、ライブ細胞タイムラプスイメージングと固定細胞高含有イメージングの両方について説明されています。...

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PMA分化型THP-1マクロファージのLPSおよびATP誘発死とその検証

学ぶマクロファージによるアポトーシス胸腺細胞の貪食解析法。C57BL/6マウスからの細胞調製とefferocytosis効率評価、阻害剤効果の検討を含む免疫学研究に応用可能な実験プロトコルです。

マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

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