Name: 成体マウスの解離と再生:哺乳類のブラステマ形成と腸内形成を調べるための簡単なモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ成体マウスP3切断モデルを用いた哺乳類のブラステマ形成と腸内骨化のメカニズム。蛍光免疫組織化学とマイクロCTで再生過程を解析し、再生医療の理解を深める。

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宗岡研究室とテキサスゲノム医学研究所(TIGM)のメンバーに感謝します。この研究はテキサスA&M大学の支援を受けました。

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</ol>

著者は何も開示していない。

このプロトコルは、成体マウス遠位P3切断の標準化された手順、蛍光免疫組織化学染色を視覚化し、ブラステマ形成および内膜神経化を調査し、シーケンシャルインビボμCTスキャンを記述する。切断後の骨形態、体積、および長さの変化を識別する。P3切断は、ブラセマ形成を引き起こす再生創傷環境を分析するユニークで手続き的にシンプルで再現可能なモデルです。さらに、P3の数字モデルは、従来の骨損傷モデルに対して多くの利点を提供し、内皮内骨化を調べます。
このプロトコルを確実に成功させるには、完全なディジットデカール化を実行する必要があります。数字が完全にデカールされていない場合、それは断面処理中に崩れ、細断されます。さらに、熱検索免疫組織化学は、組織がわずかに剥離したり、スライドから完全に脱落したりする可能性があるという点で問題になる可能性があります。この問題を緩和するために、サンプルは組織学的接着剤を補充した水浴を使用して接着剤スライドに取り付けるだけでなく、使用前に65 °Cに乾燥したスライドを焼く必要があります。最後に、マウスの数字は比較的小さいです。したがって、形態を正確に視覚化し、骨の体積と...

ヒトおよびマウスを含む哺乳動物は、末端ファランクス(P3)1、2、3の遠位切断後に自分の桁の先端を再生する能力を有する。マウスでは、再生応答は切断レベルに依存します。ますます近位桁切断は、P3爪マトリックス4、5、6に近接および近接切断で完全な再生障害が完全になるまで、徐々に減衰した再生応答を示す,7,8.P3再生は、ブラステマの形成によって媒介され、切断された構造9を再生するために形態形成を受ける増殖細胞の集団として定義される。切断によって失われた構造を再生するブラステマの形成は、エピモーフィック再生と呼ぶプロセスで、傷害後の従来の組織修復から多組織レベルのP3再生応答を区別する6、 10.P3再生は、創傷治癒11、12、骨の有面性を含む複雑な再生プロセスを調査するための再現性と手続き的に単純なモデルです 11,12,血管化13、末梢神経再生14、および骨へのブラステマル変換は、内膜神経化15を介して行う。
免疫組織化学を用いたこれまでの研究では、ブラステマが不均一、血管、低酸素、および高増殖性11、13、15、16であることが実証されている。遠位P3切断に続いて、初期の芽細胞は、最初にP3骨膜および内皮に関連し、骨表面15に隣接する堅牢な増殖および新生骨形成によって特徴付けされる。骨の劣化と創傷の閉鎖に続いて、異種芽細胞は、骨膜細胞とエンドストール関連細胞の結合によって形成され、続いて骨を含むブラステマル成分の分化が起こる。15.
傷害に対する骨修復は、典型的には、内軟骨骨化によって、すなわち、その後の骨形成17、18のためのテンプレートを形成する初期軟骨カルスを介して起こる。長い骨内皮形成、すなわち、軟骨中間体を持たない骨形成は、一般的に複雑な気晴らし装置または外科的固定を用いて誘導される19、20である。数字の再生応答は、従来のトラメランブラス系化モデルに対する利点を提供する前臨床モデルである:1)内皮骨化を刺激するために外部または内部固定後損傷を必要としない、2)それは各動物から4桁の数字を用いて行い、動物の使用を最小限に抑えながらサンプルを最大化し、3)生体内マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)解析を容易かつ迅速に行うことができる。
本研究では、再生可能で堅牢な再生応答を達成するために標準化されたP3切断面を示す。さらに、我々は、視芽細胞の形成、再生のコンテキストでの再血管化、および皮骨内形成による骨へのブラステマル変換を可視化するためにパラフィンセクションを使用して最適化された蛍光免疫組織化学プロトコルを実証する。骨化。また、順次生体内μCTを用いて、再生過程における骨形態、体積、長さの変化を同じ桁で同定する方法も示す。このプロトコルの目的は、切断後の哺乳類の芽細胞形成を調査し、イントラメブラヌス骨再生の研究のために、生体内μCTにおける蛍光免疫組織化学および順次2つの技術を実証することである。

<table><tbody><tr><td>プロテインブロック 無血清</td><td>DAKO</td><td>X0909</td><td>すぐに使用できる</td></tr><tr><td>マウス抗PCNA抗体</td><td>Abcam</td><td>ab29</td><td>1:2000 希釈</td></tr><tr><td>ラット 抗CXCR4抗体</td><td>R&D Systems</td><td>MAB21651</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human vWF XIII antibody</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>1:800 希釈</td></tr><tr><td>Rabbit anti-osterix, SP7 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td>1:400 希釈</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Runx2 antibody</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>HPA022040</td><td>1:250 希釈</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>1:500 希釈</td></tr><tr><td>Prolong Gold 退色防止試薬</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Ready to use</td></tr><tr><td>Surgipath Decalicifier 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800400</td><td>すぐに使用できる</td></tr><tr><td>Z-Fix、水性緩衝亜鉛ホルマリン固定剤</td><td>Anatech LTD</td><td>174</td><td>すぐに使用できる</td></tr><tr><td>CD-1 メスマウス</td><td>Envigo</td><td>ICR(CD-1)</td><td>8-12-weeks-old</td></tr><tr><td>vivaCT 40</td><td>SCANCO Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成体マウスの解離と再生:哺乳類のブラステマ形成と腸内形成を調べるための簡単なモデル

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

ここでは、成体マウス遠位末端ファランクス(P3)切断のプロトコルを提示し、皮炎形成とイントラメブラヌス系化を含むエピモーフィック再生の手続き的に単純で再現可能な哺乳類モデルを提示する。蛍光免疫組織化学および順次生体内マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)。哺乳類の再生は、末端ファランクス(P3)の遠位領域を伝える切断に限定される。より近位レベルで切断された数字は、再生に失敗し、線維性治癒および瘢痕形成を受ける。再生応答は、増殖性芽細胞の形成によって媒介され、続いて骨の骨再生を経て、切断された骨格の長さを回復させる。P3切断は、哺乳類のエピモーフィック再生を調査する前臨床モデルであり、線維性治癒を正常な再生応答に置き換える治療戦略の設計のための強力なツールである。我々のプロトコルは、蛍光免疫組織化学を使用して1)早期および後期のブラセマ細胞集団を同定し、2)再生の文脈における再血管化の研究、および3)複雑な骨を必要とせずに内膜骨化を調査する安定化デバイス。また、生体内μCTでシーケンシャルを用いて、切断後の形態変化を調べる高解像度画像を作成し、再生過程で同じ数字の体積と長さの変化を定量化することも実証しています。このプロトコルは、哺乳類におけるエピモーフィック応答と組織再生応答の両方を調査する上で大きな有用性を提供していると考えています。

6/7 DPA(図2A-D)、9DPA(図2E-H)、および10 DPA(図2I-L)でP3桁を再生する成体マウスは、Runx2、OSX、およびPCNAに対する抗体を用いて免疫染色し、骨内骨を可視化した。再生し、CXCR4およびvWFに対する抗体で免疫染色し、ブラステマ形成を可視化する。切断前および再生過程における様々な時点でスキャンされた数字の代表的なμCTレンダリング(図3A、B)および長さの測定値を識別するために使用されるランドマークの識別(図3B)は、以下の通りです。も示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigi...

ここでは、哺乳類のブラセマ形成と内皮形成を調べ、蛍光免疫組織化学と順次生体内マイクロコンピュータ断層撮影により分析した成体マウス末端ファランクス切断のプロトコルを提示する。

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

P3切断は、哺乳類のエピモルフィック再生を調査するための前臨床モデルであり、重要な細胞集団および内因性再生を制御するメカニズムを同定するための強力なツールである。P3モデルは、早期および後期の芽細胞集団の同定、再生中の再血管化の研究、および複雑な骨安定化装置要件のない内経的骨化の調査を可能にする。私と一緒に手順を実証するには、オサマ・クレシ、アリュサ・ファルク、キャサリン・ジンメル、技術者、レジーナ・ブルヌール、私たちの研究室から研究助教授です。8~12週齢のCD-1マウスでつまみつまみへの反応が無いのを確認した後、動物の目に軟膏を塗布し、マウスを10倍の解剖顕微鏡の下に置きます。外科用ポビドネヨウ素と70%エタノールを使用して、各後肢の数字を殺菌し、マイクロシザーを使用して外科現場から毛髪を切り取ります。局所ブピバカインの1マイクロリットルを局所に塗布して外科的部位を麻酔し、後ろ足1本をそっとスプレイして内側の数字表面を露出させる。次に、脂肪パッドに平行な角度でメスを保持し、滅菌番号10メスを使用して、2桁および4桁の末端ファランクスの遠位先端を切断する。切断された各桁にブピバカインを1マイクロリットル加え、マウスを清潔なケージに戻して、創傷のドレッシングなしで完全な再発まで監視して傷を癒すことができる。P3切断面を確実に確保するために、切断時にメスを脂肪パッドに平行に保持し、マイクロCTスキャンを実行して正しい切断長を確認します。適切な実験エンドポイントで、メスを使用して、約2番目の腹側脂肪パッドのインデントで中央ファランクスの骨の途中で数字を切断します。10ミリリットルの新鮮な緩衝亜鉛ホルマリン固定液を含む20ミリリットルのシンチレーションバイアルに組織を24〜48時間移す。そして、ミクロトームを使用して各桁の厚さ4〜5マイクロメートルのセクションを取得し、スライスを38〜41度の水浴に入れ、得られるように組織学的接着溶液を加えます。その後、接着剤スライド上のスライスをキャプチャし、乾燥するために37度の摂氏スライド暖かい上にスライドを置きます。スライドが脱パラフィン化されたら、適切な抗原検索溶液の染色瓶にサンプルを浸し、沸騰が起こらないようにスライドを摂氏95度に25分間加熱します。インキュベーションの終わりに、瓶を室温に戻し、スライドをベースに湿らせたティッシュペーパーが付いた1インチの深い覆われたプラスチック製のスライドボックスに平らに置きます。各サンプルに100マイクロリットルのプリウォームプロテイナーゼKを加えます。各スライドに小さなパラフィルムを覆い、セクションが乾燥しないようにします。摂氏37度で12分後、パラフィンフィルムを慎重に取り出し、ティッシュペーパーのスライドを静かに排出して余分なブロッキング溶液を取り除きます。次に、目的とする一次抗体溶液の100~200マイクロリットルを各スライドに加える。4°Cで一晩インキュベーションのためにパラフィンフィルムで覆われた加湿室にサイトを返します。翌朝、TRIS緩衝生理食肉+TWEENまたはTBSTでスライドを洗浄した後、スライドに適切な二次抗体溶液をラベル付けし、光から保護された室温で45分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、TBSTでスライドを洗い、乾燥させます。その後、100マイクロリットルのアンチフェードマウントメディアを使用して、慎重にドライスライドにカバースリップを配置し、取り付け媒体を乾燥させるために光から保護された室温で平らにスライドを保存します。シーケンシャルin vivoマイクロコンピュータ断層撮影またはマイクロCTの衣装では、マイクロCT動物室に出入りする酸素を可能にするチューブ付きのマイクロCTイメージャーを装備し、流出酸素にイソフルランをトラップするための活性炭フィルターが装備されていることを確認します。Voxelsizeを55ピークキロ電圧で10.5マイクロメートル、180度あたり1,000投影、統合時間が200ミリ秒の連続回転で145マイクロアンペアに設定すると、スキャンあたり最大213スライスになります。スキャナーの準備ができたら、後肢の数字を平らに配置したマイクロCT動物室に麻酔マウスをそっと置き、左側の左足と右側の右側に関連付けられた腹側を閉じます。その後、外科テープを貼って、桁を静かに固定します。スキャンを開始する前に、動物の目に眼科軟膏を適用します。スキャン後、完全な再耐えが行になるまで監視してきれいなケージに動物を戻し、マイクロCT画像再構築のために数時間まで許可します。再構築された3D骨画像の分析のために、マイクロCTで提供されるソフトウェアを使用して、一連のDICOMファイルに画像ファイルを変換します。すべてのファイルが変換されたら、Webブラウザでバッチファイルダウンローダーを使用して、DICOMシリーズを単一のフォルダにダウンロードします。BoneJ プラグインを ImageJ プラグインフォルダーにロードします。DICOM ファイル シリーズ フォルダを ImageJ バーにドラッグ アンド ドロップして、ファイルを開きます。すべてのグレー値を表示する 16 ビットイメージスタックが開きます。ボーンのみを表示するには、[イメージ調整としきい値]をクリックします。上部しきい値バーを右端にスライドさせ、ボーンだけが赤色にハイライトされるまで下限しきい値バーを調整します。下限値は、最大信号強度 32,767 で約 10,000 ~ 13,000 になります。[適用] をクリックし、新しいダイアログ ボックスで [黒の背景] をクリックします。次に、[OK] をクリックします。黒と白の値を表示する 8 ビットのイメージが生成されます。白は骨に対応しています。P3 ボーンの周囲に長方形を描いて選択し、スタックを複製します。3D 画像を生成するには、[プラグイン] と [3D ビューア] をクリックし、フリーハンド選択ツールを使用して、削除するボーンを丸で囲みます。次に、右クリックして[塗りつぶし]を選択し、不要なボーンをイメージからトリミングします。3D レンダリングからボーンボリュームを定量化するには、BoneJ プラグインを開いて[体積分率]を選択します。結果ウィンドウが表示され、骨量がミリメートルで立方体で表示されます。3D レンダリングからボーンの長さを定量化するには、ImageJ マルチポイント ツールを使用します。3D レンダリングのイメージをキャプチャするには、[表示]をクリックしてスナップショットを作成します。次に、イメージを TIF または JPEG ファイルとして保存します。これらの画像では、P3桁を再生する成体マウスの部分を、6日目から7日目、9日目、9日目、10日目の切断時に内経性骨再生および芽腫形成を視覚化する抗体で免疫染色した。ここでは、切断前にスキャンされた数字の代表的なマイクロCTレンダリングと、長さ測定値を識別するために使用されるランドマークを使用して再生の過程で様々な時点で示されています。マウスの数字モデルは遠位のレベルで切断されるときの芽腫形成を引き起こす前回生創傷環境を分析するための強力なシステムである。逆に、数字の近位切断は、再生障害を調査するためのモデルシステムとして、また再生を強化するための試験戦略のためのサイトとして機能する。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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私たちは、明視野ベースの立体顕微鏡を使用して、ゼブラフィッシュの幼生の尾びれの再生のダイナミクスを全組織スケールで捉えるためのプロトコルを提示します。この技術により、単一細胞の分解能で再生ダイナミクスを捉えることができます。この方法は、CCDカメラとタイムラプスソフトウェアを搭載したあらゆる実体顕微鏡に適用できます。...

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アキレス腱切開術と火傷傷の異所性骨化モデルは、外因性因子の適用なしに、外傷誘発性異所性骨形成の信頼性の高い研究を可能にします。...

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本稿では、切断面上に全厚皮膚を直ちに縫合することにより、軸索四肢再生時の創傷表皮形成を抑制する外科的方法を実行する方法を説明する。この方法により、研究者は四肢再生の初期段階における創傷表皮の機能的役割を調査することができます。...

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このプロトコルでは、原子間力顕微鏡(AFM)用のウーパールーパー組織を調製し、無傷および再生中の四肢軟骨のインデンテーション測定を行う方法を示します。...

無傷および再生中のウーパールーパー四肢の軟骨の原子間力顕微鏡測定

マウス骨髄損傷モデルは、出生後の骨形成を膜内骨化で研究するための有用なツールです。この簡略化された外科的プロトコルは、損傷後の新しい骨形成と細胞反応の下流評価のための骨髄アブレーション手順を説明しています。...

マウス骨髄損傷モデルにおける膜内骨化による出生後骨形成の研究方法の改善

本研究の目的は、頭蓋顔面組織再生の研究のために 、Ambystoma mexicanum...

Ambystoma mexicanumモデルにおける頭蓋顔面組織再生研究のための下顎損傷モデルの設計と標準化

学ぶ成体マウスP3切断モデルを用いた哺乳類のブラステマ形成と腸内骨化のメカニズム。蛍光免疫組織化学とマイクロCTで再生過程を解析し、再生医療の理解を深める。

成体マウスの解離と再生:哺乳類のブラステマ形成と腸内形成を調べるための簡単なモデル

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