Name: 相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学ぼう、相関光顕微鏡と体積電子顕微鏡を用いてミトコンドリアと小胞体の3次元分布を解析する方法。遺伝子改変細胞でのオルガネラ相互作用を可視化し、細胞生物学研究に応用できます。

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本研究は、科学・ICT省(19-BR-01-08)の助成を受けた韓国脳研究所(19-BR-01-08)と、韓国政府(MSIT)の助成を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成を受けたKBRI基礎研究プログラム(No)の支援を受けています。2019R1A2C1010634) SCO1-APEX2とHRP-KDELプラスミドは、ヒョンウ・リー(ソウル大学)によって親切に提供されました。TEMデータは、KBRIの脳研究コア施設で取得されました。

1. SCO1-APEX2およびHRP-KDELプラスミドベクターを用いたパターングリッド培養皿および細胞トランスフェクションを用いた細胞培養
<ol><li>種子1 x 105 HEK293T細胞を35mmガラス格子底培養食に置き、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で37°Cで5%CO2を含む加湿雰囲気中に置き、10%の胎児ウシ血清、100U/mLを補充した。ペニシリン、および100 U/mL連鎖虫菌。</li>
	<li>細胞を播種した翌日、50%-60%の合流性に成長した場合、メーカーの指示に従ってトランスフェクション試薬を使用して細胞にSCO1-APEX210およびHRP-KDEL12プラスミドを導入する(SCO1-APEX2 cDNA 0.5 μg+HRP-KDELプラスミドDNA 0.5 μg/3 μLトランスフェクション試薬)。</li>
</ol>2. パターン培養食に成長する細胞の光顕微鏡検査とAPEX2およびHRP用DAB染色
<ol><li>トランスフェクション後16〜24時間で、すべての培養培地を取り除き、穏やかなピペッティングにより250μLの温かい(30~37°C)固定液(表1)を直ちに加えます。直ちに固定液を取り外し、1.5 mLの新しい固定液に交換してください。氷上で60分間インキュベートし、1mLの氷冷0.1Mカコダイレートバッファー(表1)でそれぞれ10分間3回洗浄する。 注意:アルデヒドの煙は非常に有毒です。換気ヒュームフードの下ですべての作業を実行します。</li>
	<li>冷たい(0-4 °C)20 mMグリシン溶液を1mL加え、氷の上で10分間インキュベートし、その後、冷たい0.1Mのカコジリン酸ナトリウムバッファーの1mLでそれぞれ5分の3回の洗浄を行います。</li>
	<li>新鮮な1x DAB溶液(0.3Mカコジレート溶液の3.33 mL+ 30%H2 O2 + 5.67 mLの冷水+1mL 10x DAB溶液)を調出します。</li>
	<li>新たに調製した1x DAB溶液(ステップ2.3)の500μLを加え、反転光顕微鏡で明るい茶色の汚れが見えるまで約5~45分間氷の上でインキュベートします(図1A)。</li>
	<li>DAB溶液を静かに取り出し、1mLの冷たい0.1Mカコダイレートバッファーをそれぞれ10分間洗い出します。</li>
	<li>位相コントラスト反転顕微鏡(または明視野光顕微鏡)を使用して、100倍以上の倍率でDAB染色を可視化します。マーカー ペンを使用して、対象領域 (ROI) が配置されているガラスの下部にマークを付けます (図 1B,C)。</li>
</ol>3. EMブロックのサンプル調製
<ol><li>ステップ2.1-2.6に記載されているように細胞培養およびDAB染色を行う。</li>
	<li>2%の1 mLでサンプルを修正した後、4°Cで1時間のOsO4を減少させます。 注意:OsO4の煙は非常に有毒です。換気ヒュームフードの下ですべての作業を実行します。</li>
	<li>ステップ 3.2 の間に新しい TCH ソリューション (表1) を準備し、0.22 μm フィルターを通過します。 注意:TCHの煙は非常に有毒です。換気ヒュームフードの下ですべての作業を実行します。</li>
	<li>固定剤を取り出し、室温(RT)でそれぞれ5分間蒸留水の1 mLで3回すすいでください。</li>
	<li>RTで20分間、予め調製および濾過されたTCH溶液の1mLに細胞を置きます。</li>
	<li>RTでそれぞれ5分間、蒸留水1mLで細胞を3回すすいでください。</li>
	<li>RTで30分間蒸留水中の2%の一三酸化オスミウムの1mLに細胞を2回露出させる。</li>
	<li>固定液を取り除き、RTでそれぞれ5分間蒸留水の1 mLで3回すすいで、1%のウラニル酢酸(水性)の1mLを加え、暗闇の中で4°Cで一晩放置する。</li>
	<li>RTでそれぞれ5分間蒸留水の1mLで細胞を3回洗います。</li>
	<li>予め暖かいウォルトンの鉛アスパラギン酸溶液(表1)を60°Cのオーブンで30分間使用します。</li>
	<li>予め温めた鉛アスパラギント溶液の1 mLを加えてウォルトンの鉛アスパラギント溶液で細胞を染色し、60°Cで30分間オーブンに入れます。</li>
	<li>RTでそれぞれ5分間、蒸留水1mLで細胞を3回すすいでください。</li>
	<li>2-mLエタノールアリコート(50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%)の等級シリーズでインキュベートRTでそれぞれ20分間。</li>
	<li>エタノールをデカントし、3:1エタノールの1mLで30分間インキュベートする:低粘度埋め込み混合培地をRTに入れ込む。</li>
	<li>培地を取り出し、1:1エタノール:低粘度埋め込み混合培地の1 mLを加える。RTで30分間インキュベートします。</li>
	<li>培地を取り出し、1:3エタノール:低粘度埋め込み混合培地の1 mLを加えます。RTで30分間インキュベートします。</li>
	<li>培地を取り出し、100%低粘度の1mLを加えて、一晩インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを100%低粘度埋め込み混合物に埋め込み、60°Cで24時間インキュベートします。</li>
	<li>超マイクロトームを使用して90nmの厚さのセクションを準備します。</li>
	<li>200 kV で TEM の下のグリッドを観察します。</li>
</ol>4. SEMイメージング用インジウムスズ酸化物コーティングカバースリップのシリアル断面と取り付け
<ol><li>
基板の調製
	<ol>
<li>イソプロパノールで30~60sの優しい撹拌により、インジウムスズオキシド(ITO)コーティングガラスカバースリップ(22mm x 22mm)を洗浄します。</li>
		<li>カバースリップを取り除き、余分なイソプロパノールを排出し、乾燥するまでほこりのない環境に残します。</li>
		<li>プラズマコーターを使用して、ITOコーティングされたガラスカバーリップを1分間光放電で処理します。 注:プラズマ活性化は、基板表面に親水性特性を付与します。これは、セクションが基板に取り付けられているときにセクションのしわの形成を防ぐために、基板上の水の非常に薄いフィルムを作成します。</li>
		<li>ITOコーティングされたガラスカバーを基板ホルダーに差し込み、ナイフボートに入れます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
サンプルブロックのトリミングとシリアル断面
	<ol>
<li>サンプルブロックを超マイクロトームのサンプルホルダーに挿入し、トリミングブロックにセットします。</li>
		<li>カミソリブレードを使用して、ターゲット位置の周囲にあるすべての余分な樹脂を取り除きます(ステップ2.6、図1D-Gで識別)。ブロック面の形状は台形または長方形にする必要があります。先頭エッジと末尾エッジは絶対に平行でなければなりません(図 1H,I)。</li>
		<li>サンプルホルダーをウルトラマイクロトームのアームに挿入し、ダイヤモンドナイフをナイフホルダーに入します。ITOガラスカバーをリボンキャリアに差し込み、ハンドルでキャリアをクランプします(図1J)。リボンキャリアをナイフボートにセットし、濾過された蒸留水でナイフボートを満たします(図1K)。</li>
		<li>ホルダーのハンドルを慎重に押して、ITOガラスの端をナイフに近づけることで、ナイフのスライドでキャリア位置を調整します(図1L)。</li>
		<li>断面を切断した後、断面プロセスを停止し、チューブのクランプスクリューをゆっくりと開き、水のボート(毎秒1滴の水の流量)を排出します。</li>
		<li>リボン回収プロセスを完了した後、クランプ装置のハンドルで基板を取り外し、リボンを乾かします(図1M)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SEMでのイメージングとSEMイメージスタックの位置合わせ
<ol><li>ITOコーティングされたカバースリップを粘着カーボンテープでアルミスタブに取り付けます。粘着カーボンテープでガラス表面と表面を密封し、10nmの厚い炭素層(図1N)でコーティングします。</li>
	<li>5 kVの低加速度電圧でのフィールド放出SEMのITOコーティングされたカバースリップと、BSEの効率的な収集に適した作業距離を観察します。</li>
	<li>仮想スタックオプションを使用して、シリアルイメージをイメージ J ソフトウェア (Fiji)13に読み込みます。新しい TrakEM14を開き、イメージ スタックを TrakEM にインポートします。マウスの右ボタンをクリックし、整列メニューを選択します。</li>
	<li>次に、イメージ範囲 (最初のイメージから最後のイメージまで) を選択します。自動位置合わせを終了し、整列したデータセットを保存し、エクスポートを選択して、選択したイメージ範囲 (最初のイメージから最後のイメージまで) からフラット イメージをコンパイルします。最後に、画像 J メイン メニューにフラット イメージ データを AVI 形式で保存します。 注:補足ムービー 1と補足ムービー 2は、それぞれ SEM イメージ スタックとトリミングされたイメージ スタックを示します。</li>
</ol>6. 連続画像からのミトコンドリアとERのセグメンテーション
<ol><li>IMOD15ソフトウェアで3dmodを起動し、画像ファイルを開きます。</li>
	<li>ZaP ウィンドウで、マウスの中央ボタンを使用してミトコンドリアと ER の輪郭を描画します。</li>
	<li>セグメント化されたボリュームを視覚化するには、[モデルビュー] ウィンドウ (補足ムービー3) を開きます。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

EMを用いたナノメートル分解能で特定のタンパク質の細胞局在を決定することは、タンパク質の細胞機能を理解するために重要です。一般に、EMを介した標的タンパク質の局在化を研究する2つの技術がある。一つは、1960年からEMで使用されている免疫金技術であり、もう一つは最近開発された遺伝子組み換えタグ16を用いた技術である。従来の免疫ゴールド技術は、標識タンパク質の位置を示すために抗体共役金粒子または量子ドットを採用してきました。しかしながら、高品質の抗体の要求と樹脂および固定性の影響を受ける抗体の浸透効率のために、この技術は著しく制限される17.具体的には、免疫金標識は、主に、enブロック金属染色および強いオスミウム固定を伴わずに超薄型断面の表面に制限されるため、この技術は現代の3DEM18に直接適用できない。SBEMおよびアレイ断層撮影を含む最近の3DEM法をタンパク質標識と共に使用するために、このプロトコルで遺伝的にコードされたEMタグを利用した。遺伝的にコード化されたタグは、固定前に目的の部位に...

ミトコンドリアおよび小プラズム網膜(ER)は、膜結合細胞小器官である。その接続は、その機能のために必要であり、彼らのネットワークに関連するタンパク質は1について説明されています。ミトコンドリアとERの間の距離は、光顕微鏡2を用いて約100nmと報告されている。しかし、最近の超解像顕微鏡3および電子顕微鏡(EM)4の研究は、約10〜25nmでかなり小さいことを明らかにした。超解像顕微鏡で達成される分解能はEMより低く、特異的な標識が必要である。EMは、ミトコンドリアとERとの間の接続の構造研究に十分に高分解能コントラストを達成するのに適した技術である。しかし、従来の透過型電子顕微鏡(TEM)では薄い切片が約60nmまたは薄くなければならないため、Z軸情報が限られているのが不利です。十分なEM Z軸イメージングのために、3次元電子顕微鏡(3DEM)を使用することができる5.しかし、これは、少数の熟練した技術者だけが習得した非常にトリッキーな作業である、細胞全体の薄いシリアルセクションの数百の準備を含みます。これらの薄いセクションは壊れやすいフォルバーフィルムコーティングされた1穴TEMグリッドに集められている。フィルムが1つのガードで壊れた場合、シリアルイメージングとボリュームの再構築は不可能です。シリアルブロック面走査型電子顕微鏡(SBEM)は、ダイヤモンドナイフ(Dik-SBEM)または集集型イオンビーム(FIB-SEM)のいずれかで走査型電子顕微鏡(SEM)真空チャンバ内の破壊的なブロック断面を使用する3DEMの一般的な技術です。6.しかし、これらの技術はすべての施設で利用できないため、シリアル断面とSEMを使用して配列断層撮影7を提案します。アレイ断層撮影では、超マイクロトームを使用して切断されたシリアルセクションは、TEMグリッドの代わりにガラスカバースリップに転送され、光顕微鏡とSEM8を介して視覚化されます。バックスキャッタ電子(BSE)イメージングのシグナルを増強するために、四酸化オスミウム(OsO4)固定細胞を用いたen blocEM染色プロトコルを利用し、オスミオフィリックチオカルボヒドラジエード(TCH)9を用いて画像を得ることを可能にした。ポスト埋め込み二重染色。
さらに、ミトコンドリアマーカーSCO1(シトクロムcオキシダーゼ集合タンパク質1)-アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2(APEX2)10分子タグを用いて、EMレベルでミトコンドリアを可視化した。APEX2は約28kDaであり、大豆アスコルビン酸ペルオキシダーゼ11に由来する。これは、光顕微鏡で緑色蛍光タンパク質タグ付きタンパク質が使用されるのと同じ方法で、EMレベルでの特定のタンパク質の詳細な位置を示すために開発されました。APEX2は、3,3' -ジアミノベンジジン(DAB)を、過酸化水素(H2O2)の存在下でタグの部位で不溶性オスミオフィリックポリマーに変換する。APEX2は、細胞全体の深さを通してタンパク質局在化を伴うEMにおける従来の抗体標識の代替として使用することができる。言い換えれば、APEX2タグ付きタンパク質は、超凍結切除後の免疫金標識および透過化なしに、特定の浸透11によって可視化することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)はまた、H2O-依存性重合DABを局所沈殿物に触媒する敏感なタグであり、OsO4による処理後のEMコントラストを提供する。ER標的ペプチド配列HRP-KDEL(lys-asp-glu-leu)12を用い、細胞全体でERを可視化した。減少したオスミウムおよびTCH(rOTO法)を用いた遺伝的タグおよびenブロック染色を利用する我々のプロトコルを評価するために、同時にオスミケーション効果を用いて、rOTO enブロック染色における各遺伝的タグの使用の有無にかかわらず膜コントラストを比較した。 アレイ断層撮影とAPEXおよびHRPによるDAB染色を用いた3DEMは、それぞれ他の目的のために利用されていますが、ミトコンドリアおよびERラベリング用の3DEMとDAB染色用の配列断層撮影を組み合わせたため、当社のプロトコルはユニークです。具体的には、APEXタグ付き遺伝子の有無にかかわらず5つの細胞を同じセクションで示し、細胞に対する遺伝子改変の効果を調べに役立った。

<table><tbody><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>EMS</td><td>16200</td><td>ヒュームフードでのみ使用</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>EMS</td><td>19210</td><td>ヒュームフードでのみ使用</td></tr><tr><td>カコジル酸ナトリウム</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム 4% 水溶液</td><td>EMS</td><td>16320</td><td>ヒュームフードでのみ使用</td></tr><tr><td>エポン 812</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>EMbed 812- 20 ml/ DDSA- 16 ml/ NMA- 8 ml/ DMP-30 - 0.8 ml</td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム ライカARTOS 3D</td><td>ライカ</td><td>ARTOS 3D</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>EMS</td><td>22400</td><td>有害化学物質</td></tr><tr><td>クエン酸鉛</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>35mm グリッドカバースリップ皿</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD</td><td></td></tr><tr><td>グローディスチャージャー</td><td>Pelco</td><td>easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>Formvar カーボンコーティング 銅グリッド</td><td>テッドペラ</td><td>01805-F</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>シグマ</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>プロメガ</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>SIGMA</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime; -ジアミノベンザミジン(DAB)</td><td>SIGMA</td><td>D8001</td>危険な<td>化学物質</td></tr><tr><td>30%過酸化水素溶液</td><td>メルク</td><td>107210</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサシアノフェレートカリウム(II)三水和物</td><td>SIGMA</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um シリンジフィルター</td><td>ザルトリウス</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>チオカルボニルジヒドラジド</td><td>SIGMA</td><td>223220</td><td>ヒュームフードでのみ使用</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>フルカ</td><td>10193426</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン酸</td><td>SIGMA</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>酸化インジウムスズ(ITO)コーティングガラスカバースリップ</td><td>SPI</td><td>06489-AB</td><td>fragilガラス</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ</td><td>ライカ</td><td>AT-4</td><td></td></tr><tr><td>インベテッド光学顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>ECLipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Auriga</td><td></td></tr></tbody></table>

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

ミトコンドリアや小プスミック網膜(ER)などの細胞小器官は、様々な機能を実行するネットワークを作成します。これらの高度に湾曲した構造は、細胞の状態に応じて動的ネットワークを形成するために様々な形状に折り畳まれています。ミトコンドリアとERの間のこのネットワークの可視化は、超解像蛍光イメージングと光顕微鏡を用いて試みられた。しかし、限られた分解能は、ミトコンドリアとERの間の膜を詳細に観察するには不十分である。透過電子顕微鏡は、細胞小器官の観察のための良好な膜コントラストとナノメートルスケールの分解能を提供します。しかし、高度に湾曲した小器官の3次元(3D)構造を評価する場合、非常に時間がかかります。そこで、強化されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ2とワサビペルオキシダーゼ染色を用いて、相対光電子顕微鏡(CLEM)と体積電子顕微鏡技術を用いてミトコンドリアとERの形態を観察した。enブロック染色法、超薄型連続断面(アレイ断層撮影)、体積電子顕微鏡を用いて3D構造を観察した。このプロトコルでは、ミトコンドリアとERの詳細な構造研究を行うためにCLEMと3D電子顕微鏡の組み合わせを提案する。

図 1は、このプロトコルのスケジュールとワークフローについて説明します。プロトコルは7日間必要です。ただし、SEM イメージングに費やされる時間によっては、この値が増加する可能性があります。細胞透過のために、細胞の合流は、グリッドプレート全体の底部を覆わないように制御されるべきである(図1A)。高い細胞密度は、光顕微鏡およびEM観察の間に目的の細胞の同定を妨げるかもしれない。我々は、APEX2およびHRPを発現する遺伝的にタグ付けされたプラスミドを使用して、培養皿内の多数の培養細胞の中から効率的にトランスフェクトされた細胞を選択した。HEK293T細胞を培養し、共トランスフェクト細胞におけるSCO1連結APEX2(ミトコンドリア間膜空間[IMS])およびHRP結合KDEL(ER)の発現を確認した。軽微小顕微鏡では、APEX2トランスフェクト細胞を褐色に染色したが、トランスフェクションのない細胞は染色されていないままであった(図1Aおよび図2)。これにより、培養細胞集団におけるDAB染色(CLEM)に使用...

我々は、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ2およびワサビペキシダーゼ染色を含む相関光および体積電子顕微鏡を用いて遺伝子改変後の全細胞におけるミトコンドリアおよび小和性網膜の分布を研究するためのプロトコルを提示し、同じセクション内の標的遺伝子の有無にかかわらず細胞のシリアル断面、および電子顕微鏡によるシリアルイメージング。

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

この体積電子顕微鏡法は、3次元構造の観察を必要とする生物学的研究を行うために使用される。イメージを取り返す前にロッド、野手ビュー、サンプルストレージを提供します。Fx2 Asanは、脱衰弱を触媒してターゲット構造の電子試験を増加させ、特定の対象を特定するために使用できるパスステージを設計しました。これらの粒子は、相関光と3次元電子顕微鏡技術を組み合わせて、膜状の小器官と宿主細胞の相互作用を調べる。トランスフェクション後16~24時間、250マイクロリットルの30~37度の固定液で培養液を静かに洗浄します。洗浄液を1.5ミリリットルの新鮮な固定溶液に素早く交換し、培養液を氷の上に30分間置く。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき氷冷0.1モルカコチル酸緩衝液の1ミリリットルで30分間の洗浄で細胞をすすぐ。最後の洗浄の後、氷冷0〜4度20ミリモルグリシン溶液を1ミリリットル加え、氷の上に10分間のインキュベーションを行い、その後、洗浄ごとに新鮮で冷たい0.1モルナトリウムカコチル酸緩衝液を1ミリリットルで3回5分間洗浄します。次に、500マイクロリットルの新しく調製されたDAB溶液で細胞にラベルを付けます。そして、約5〜45分間氷上の細胞をインキュベートします。逆光顕微鏡下で薄茶色の汚れが見える場合は、1回の洗浄で1ミリリットルの新鮮な冷たい0.1モルナトリウムカコチル酸緩衝液で細胞を3回洗い流します。次に、位相差反転顕微鏡を使用して、DAB染色を100倍以上の倍率で可視化し、対象領域が配置されているガラスの底部に印を付けます。電子顕微鏡用ブロック試料調製物については、まず、4度で1時間四酸化オスミウムを2%減少させた1ミリリットルで細胞を後固定する。固定の終わりに、3回の5分間の洗浄と1回の新鮮な蒸留水で細胞を洗い流します。20分間濾過TCH溶液の1ミリリットルで細胞を処理する前に.インキュベーションの終わりに、ちょうど実証したように蒸留水で細胞を3回洗浄し、2%減少した四酸化オスミウムで30分のインキュベーションで細胞を固定します。2回目の固定の終わりに、蒸留水で細胞を3回洗浄し、1ミリリットルの酢酸水溶液を光から保護した摂氏4度で一晩で覆います。翌朝、60度の1ミリリットルの摂氏1ミリリットルで染色する前に、蒸留水で細胞を3回洗い、ウォルトンの鉛アスパラギンス溶液を60°Cのオーブンで30分間温めた。インキュベーションの終わりに、蒸留水で細胞を3回洗浄します。20分2ミリリットルエタノールアリコートのグレードシリーズで培養を行います。最後の100%エタノール暴露後、3~1エタノールの1ミリリットルで30分間、室温で低粘度埋め込み混合物培地にインキュベートする。インキュベーションの終了時に、培地を1対1のエタノールの1ミリリットルに置き換え、室温でさらに30分間インキュベーションするために低粘度埋め込み混合物培地にします。次に、培地を1~3個のエタノールの1ミリルターで、低粘度埋め込み混合物培地に対して、室温でさらに30分間交換する。次いで、培地を1ミリリットルの100%低粘度埋め込み培地で一晩交換し、続いて、60°Cで24時間混合した低粘度でサンプルを埋め込む。透過型電子顕微鏡分析では、翌日、超ミクロトームを使用して90ナノメートルの厚い切片を得て、200キロボルトの透過電子顕微鏡下でグリッドを観察します。サンプル調製を開始する前に、きれいなインジウムスズオキシドは30〜60秒間イソプロパノールで穏やかな攪拌でガラスカバーリップをコーティングしました。攪拌の終わりに、余分なアルコールを排出し、ほこりのない環境にカバーリップを置きます。カバーリップが乾燥しているときは、プラズマコーターを使用してカバーリップを1分間放電します。次にカバーリップを基板ホルダーに挿入し、基板ホルダーをナイフボートに入れます。走査型電子顕微鏡のサンプルを得るために、埋め込まれたサンプルブロックをウルトラミクロトームのサンプルホルダーに挿入します。そして、ホルダーをトリミングブロックにセットします。カミソリの刃を使用して、ブロックの面が台形または長方形になるように、ターゲット位置の周りに余分な樹脂をトリミングします。先頭と末尾のエッジは、互いに厳密に平行にする必要があります。多数のシリアルセクションを取得するのは容易ではありません。ただし、リーディング エッジと後続エッジは完全に平行である必要があります。次に、サンプルホルダーをウルトラミクロトームのアームに挿入します。ナイフホルダーにダイヤモンドナイフを入れ、ナイフボートにろ過蒸留水を入れます。次に、ホルダーのハンドルを慎重に押して、カバーリップの端がナイフに近づくようにキャリアの位置を調整します。サンプルを入手した後、切り抜きプロセスを停止し、チューブのクランプスクリューをゆっくりと開け、水上ボートを排出します。リボンの収集プロセスが完了したら、クランプ装置のハンドルで基板を取り外し、リボンを乾かします。目的のタンパク質を発現する遺伝的にタグ付きプラスミドを用い、タグ付きタンパク質の染色後にトランスフェクトされた標的細胞の同定を可能にする。その後、コ相対光電子顕微鏡法を用いて、標識された細胞培養をさらに可視化することができる。例えば、SCO1-APEX2によって生成された暗い汚れは、ミトコンドリアのマトリックス空間ではなくミトコンドリア膜間空間においてのみ観察される。コードトランスフェクト細胞は、SCO1-APEX2およびHRP-KDELプラスミドの両方を用いて、ミトコンドリア膜間空間および小胞体において高密度の電子信号を発現する。しかし、SCO1-APEX2にトランスフェクトされた細胞では小胞体染色は認められていない。走査型電子顕微鏡による逐次イメージングでは、大面積の後方散乱電子検出器を用いてアレイ全体の画像全体の概要を作成します。次に、対象となる領域が最初のセクションに配置され、他のすべてのセクションに反映されます。最後に、5つの標的細胞を含む対象領域を5ナノメートルの画像化されたピクセルで画像化する。拡大は、ゴルジ装置、ミトコンドリア、およびエンドポラス系レチクルムなどの詳細な細胞下構造を明らかにする。シリアルイメージングは、異なるZプレーンで小胞子ミトコンドリア接点が起こることを明確に明らかにします。相関光と電子顕微鏡を使用して特定のターゲット構造を特定の識別法の影響を調べる方法を理解しておく必要があります。これらの染色技術と体積電子顕微鏡を組み合わせることで、特にユーロウイルスにおける細胞相互作用を調査するために、より大きなスケールのEMに使用できる。グルタルアルデヒド、またエンテロサイドおよびTCHは非常に有毒ですので、防護服を着用し、これらの材料を使用する際にヒュームフードで動作するようにしてください覚えておいてください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

CLEMの技術はマイクロインジェクション分子の影響を受け、膜、細胞小器官、および細胞内構造の超微形態を分析するように適合されています。このメソッドでは、複数ナノメートルの分解能にミリメートルできるようにマイクロマニピュレーション/マイクロインジェクションの強力な技術、共焦点蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を組み合わせたものです。この技術は、多種多様なアプリケーションに適している。...

マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。...

ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

私たちは、生きた細胞の共焦点イメージングにより、小胞体（ER）に常駐トランスフェクションし、蛍光タンパク質の分布や移動性を調査するために使用して画像化のアプローチについて説明します。また、超微細構造、この細胞内区画のアーキテクチャにその発現の効果を分析する。...

培養細胞における小胞体サブドメインの可視化

量子ドット(QD)ナノ粒子をエポキシ包埋ヒト病理組織の相関免疫細胞化学的研究に使用できる方法が説明されています。私たちは、広視野蛍光光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡で可視化される市販の抗体フラグメント標識量子ドットを採用しています。...

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

ここでは、固定された細胞内小胞体とミトコンドリアの間に内因性の相互作用を視覚化し、高感度で定量化するための手順について説明します。プロトコルは、ミトコンドリア関連膜界面での75 /電位依存性アニオンチャネル/シクロフィリンD複合体イノシトール1,4,5-三リン酸受容体/グルコース調節タンパク質を標的と現場での近接連結アッセイに最適化されています。...

小胞体とミトコンドリアの相互作用の研究によって、<em&gt;その場で</em固定された細胞における&gt;近接ライゲーションアッセイ

肝臓または他の組織の細胞から肝細胞細胞小器官間の膜接触部位の三次元的詳細を取得するための簡単で包括的なプロトコル。...

連続部電子顕微鏡を用いた肝細胞細胞内細胞小器官間接触部位の3次元特性評価

ここでは、細胞の超微細構造に関連する希少タンパク質の局在を調査するためのツールとして、内因性蛍光標識に基づく最適化されたオンセクション相関光電子顕微鏡法のプロトコルを紹介します。このアプローチの威力は、バフィロマイシン処理を行わない飢餓細胞における内因性LC3の超微細構造局在によって実証されています。...

オンセクション相関光電子顕微鏡による内因性LC3の超微細構造局在

このプロトコルは、ミトコンドリアクリステを再構築して、高精度、高解像度、および高スループットの3Dイメージングを実現する方法について説明します。...

膵臓癌細胞のミトコンドリアの微細構造変化を可視化する3次元技術

mScarletと呼ばれる蛍光タンパク質を使用したEponの埋め込み後相関光および電子顕微鏡の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、蛍光と超微細構造を同時に維持できます。この技術は、さまざまな生物学的用途に適しています。...

Epon Post Embedding 相関光電子顕微鏡

このプロトコルでは、網膜光受容体末の構造的特徴に焦点を当てて、体積電子顕微鏡用の網膜サンプルを調製するための詳細な手順について説明します。...

体積電子顕微鏡法のための網膜サンプルの調製

このプロトコルは、相関光顕微鏡と電子顕微鏡を使用して、それぞれmEosEMとAPEX2で標識されたミトコンドリアとリソソームの相互作用を視覚化するメカニズムを説明しています。...

ミトコンドリアとリソソーム間の相互作用を可視化するための2色相関光顕微鏡と電子顕微鏡法

学ぼう、相関光顕微鏡と体積電子顕微鏡を用いてミトコンドリアと小胞体の3次元分布を解析する方法。遺伝子改変細胞でのオルガネラ相互作用を可視化し、細胞生物学研究に応用できます。

相関光と体積電子顕微鏡によるミトコンドリアと小体網膜イメージング

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