ヒト線維筋組織を可視化するホスホトン酸調製のマイクロX線コンピュータ断層撮影の使用
2019年9月5日
マイクロX線コンピュータ断層撮影は、損傷を受けていないヒト標本から3次元情報を得る上で有効であるが、軟部組織の観察に限られた成功を収めている。ホスホトン酸造影剤の使用は、この問題を解決することができます。この造影剤を実装し、ヒトの繊細な線維筋組織(靭帯を保持する内巣)を調べた。
我々は、眼窩領域内の繊細な構造であるヒトオービキュラリス保持靭帯の非侵襲的な調査において軟部組織のコントラストを高めるために、ホスホトゥンジン酸を用いたmicroCTを実施する。このプロトコルは、人間の軟部組織の非侵襲的な調査の研究者を支援するために最適化されており、合理的な費用で実行するのは簡単です。サンプルを入手するには、まず、色鉛筆を使用して、サンプル採取用の皮膚の切断領域を示します。
マークされた線が内側のキャンパスに内側に延び、横方向のキャンパスに延び、下まぶたの上側の境界に優れ、軌道縁から線の下1センチメートル下に劣っていることを確認します。次に、ブレードを使用してマークされたラインに沿って顔のティッシュを切断し、ブレード先端が骨に触れるのに十分な深さがあることを確認します。採取されたサンプルには、皮膚、皮下組織、筋肉、脂肪、骨膜が含まれなければならない。
収集時に、室温で5〜7日間、すぐに10%ホルマリンでサンプルを固定します。固定期間の終わりに、サンプルを5~7ミリメートルの厚さ3個でスライスします。針と黒糸を使用して、サンプルの方向を後の時点で決定できるように、各サンプルの超側側を縫います。
1濃度につき1日、上昇エタノール濃度系列でサンプルを脱水し、染色されるまで70%エタノール溶液中にサンプルを残します。マイコン断層撮影スキャンが予定される1週間前に、2.1グラムのPTAを210ミリリットルの70%エタノールに加え、1分間に55〜60回転でシェーカーに溶液を置きます。スライスした各部分に70ミリリットルのプラスチック容器を3個用意します。
染料がアルコール溶液に溶解したら、容器に溶液を充填する。1%PTAの各容器に1つの標本を入れ、5〜7日間毎分55〜60回転でサンプルを振ります。染色が完了したら、サンプルを新鮮な70%エタノールで1週間保管し、スキャンの準備をします。
マイクロCTスキャンの場合は、パラフィルムでサンプルをラップして乾燥を防ぎ、サンプルをスキャナートレイに置きます。スキャナのソース電圧を70キロボルト、ソース電流を114マイクロアンペア、アルミニウムフィルタを0.5ミリメートル、画像ピクセルサイズを20平方マイクロメートル、ピクセルを2,240 x 2,240、エクスポージャーを500ミリ秒、回転ステップを0.3度に設定します。次に、スキャンを開始します。
スキャンが完了したら、再構築ソフトウェアを開き、[アクション] と [データセットを開く] を選択して、スキャンしたファイルを起動します。[設定]タブを選択し、リングアーティファクトの削減を7に設定し、ビーム硬化補正を行います。再構築を開始するには、[開始] を選択します。
最終的なデータは、指定されたフォルダに格納されます。再構築の最後に、ファイルサイズ変更ソフトウェアを開き、[ソース データ セット] を選択して再構築されたファイルを起動します。[宛先データ セット] タブで jpg を選択し、[画質] オプションの [補間なし] の [1/2 サイズ変更] オプションを選択し、[イメージ圧縮] タブでスライド バーを 100 に調整して変換を開始します。
3D 再構築の場合は、3D ボリューム レンダリング ソフトウェアを開き、[アクション] と [ボリューム データのロード] を選択します。明るさとコントラストレベルを調整するには、[関数の転送エディタ]タブのヒストグラムで形状転送機能を変更します。次に、[オプションと照明]を選択し、[影]アイコンと[サーフェス照明]アイコンを選択して、リアルなモデリングトーンを実現します。
クリックしてドラッグし、右クリックしてドラッグして3D画像を移動および回転させて最適なビューを見つけ、必要に応じてズームインまたはズームアウトします。Shift キーを押しながらドラッグして、断面画像を表示する場所をスライドさせます。[ライト]アイコンをオンにして、表示に最適な照明を見つけるために照明表示バーを調整し、[ライト]アイコンをオフにして[照明]タブを閉じます。
[オプション] タブで、[表示とクリッピング ボックス] を選択して、最終イメージのボックスを非表示にします。次に、画像を保存するアクションと画像の保存を選択します。このORLの詳細な再構築は、PTA調製物を用いたmicroCTによって実証され、真皮と骨膜の間に斜めに伸びる靭帯性線維筋構造の視覚化を可能にした。
コロナの観点では、繊維の量と複雑さは横に増加します。水平ビューでは、樹状の形成を伴う精巧なメッシュワークが観察される。矢状の観点では、ORL繊維の厚みは劣って減少する。
全体として、この多方向観測は、ORLが、その位置に応じて繊維の数と厚さのばらつきを持つ連続プレートの多層メッシュワークで構成されていることを証明しています。染色の持続時間が検体の体積に比べて不十分な場合、最終像は、試料の中央領域に空の穴を含み得る。PTA以外の他のエージェントを使用することができ、異なるエージェントは異なるメリットまたは染色機能の興味を持っています。
したがって、実験に従って染色領域を最適化すると便利です。
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概要
本研究では、ヒト標本における軟組織の可視化を向上させるため、造影剤としてホスホタングスト酸を用いたマイクロX線コンピュータ断層撮影（microCT）の使用について実証します。具体的には、眼窩領域内の繊細な線維筋構造である眼輪保持靱帯に焦点を当てます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- イメージング技術
背景
- MicroCTは、損傷のないヒト検体の3次元イメージングに有効です。
- 従来のmicroCT法では、軟組織の可視化が困難でした。
- ホスホタングスト酸を用いることで、軟組織イメージングのコントラストを改善できます。
- 眼輪保持靭帯は繊細な構造であるため、慎重な取り扱いが必要です。
研究目的
- 非侵襲的イメージングにおける軟組織のコントラストを向上させる。
- ヒト軟組織を研究する研究者にプロトコルを提供する。
- 繊細な線維筋組織の研究を促進する。
使用した手法
- ホスフォトングステン酸を用いたmicroCTの実施。
- ヒト眼輪保持靭帯からのサンプル採取。
- 皮膚上の切開部位をマークするための色鉛筆の使用。
- 皮膚、皮下組織、筋肉、脂肪、および骨膜を含む慎重な剥離。
主な結果
- ホスホタングスト酸を用いた軟組織コントラストの向上に成功した。
- 脆弱な組織の非侵襲的な調査に向けた最適化プロトコルを構築した。
- 本手法の実現可能性と費用対効果を実証した。
- ヒト軟組織に関する今後の研究に向けた信頼性の高いアプローチを提供した。
結論
- ホスホタングステック酸を用いたMicroCTにより、軟組織のイメージングが大幅に改善されます。
- この手法は、繊細なヒト組織を扱うさまざまな研究に応用可能です。
- 今後の研究において、本プロトコルを基盤としてイメージング技術のさらなる高度化が期待されます。
よくある質問
産業上の重要性
本手法は、繊細なヒト軟組織の非破壊的な3D可視化を可能にするものであり、組織切片作成によって空間的関係性が損なわれるという、前臨床ターゲットバリデーションにおける主要な制限を解消します。筋線維構造のコントラストを向上させることで、疾患メカニズムに関連する組織構築を明確にし、初期創薬におけるメカニズム的なリスク低減を支援します。このアプローチは、ヒトに関連するシステムにおいて組織レベルの表現型を評価するための、スケーラブルで再現可能なプラットフォームを提供します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 物理的な切片作成によるアーティファクトを排除し、ヒトの線維筋組織における構造的仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： 定量的な3D形態計測データを提供し、ターゲットエンゲージメントモデルのリスクを軽減する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 化合物スクリーニングにおいて一貫した読み取り結果を得るための、標準化され再現性のある組織標本を作製する。
- 運用的価値： 定義された染色期間（5–7 days）および検体厚（5–7 mm）のパラメータを通じて、アッセイの標準化を支援する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：ヒト組織の完全性を維持して縦断的解析を可能にすることで、発見的研究と前臨床ワークフローを橋渡しします。
- 運用的価値：解釈のばらつきを低減する共有可能な3Dデータセットを提供し、部門横断的な連携を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットバリデーションから前臨床評価に至るディスカバリーコンティニュアムに適合し、組織を消費する処理を行うことなく、組織応答の反復的な評価を可能にします。
- 基礎生物学研究：ヒト組織における靱帯ネットワークの空間的構成を明らかにすることで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：化合物の効果を比較するための定量的な構造出力（例：繊維の太さ、メッシュ密度）を提供します。
- 解析：用量反応モデリングに有用な3D再構築および体積測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：摘出組織から解析に至るまで解剖学的忠実性を維持し、バイオマーカーに準拠した組織フェノタイピングを支援します。
- 企業での再利用：初期最適化後、複数の組織タイプ（例：神経、癌、心臓）に適用可能な再利用可能なイメージングプロトコルを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：軟組織ターゲットのバリデーションにおけるメカニズム的な曖昧さを排除し、予測の信頼性を高める。
- 運用上の価値：標準化された固定、脱水、および染色プロトコルにより、再現性を確保する。
- 戦略的価値：創薬パイプラインの早期段階でヒトに関連する構造データを提供し、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：バリデートされた組織レベルの表現型に基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にする。
実施上の注意点
- 組織切片作成およびmicroCT操作の専門知識が必要です。
- 電圧・電流設定の調整が可能なmicroCTスキャナーおよび再構成ソフトウェアへのアクセスに依存します。
- 一貫性を保つため、染色期間（5–7 days）および検体厚（5–7 mm）について、チーム間での合意が必要です。
- 密度や脂質含有量の異なる組織に適用する場合、適応上の検討事項が含まれます。
- 検体量に対して染色が不十分な場合に生じる中心部アーチファクトなどの実用的な制限事項があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Sample Acquisition
1:34
Staining and Phosphotungstic Acid (PTA) Preparation and Micro-Computed Tomography (microCT) Scanning
3:26
Data Reconstruction and Optimization
4:21
3D Reconstruction
5:31
Results: Representative 3D Orbicularis Retaining Ligament (ORL) Images
6:23
Conclusion
