Name: 筋生検における免疫標識筋線維変性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学ぶ筋生検における免疫標識法を用いて、壊死性筋線維を特定・定量化する手法。IgG取り込み染色により神経筋疾患における筋変性を評価し、mdxマウスモデルで再生・退行プロセスを解明する。

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この作品は、トランスラマッスル・プログラムとの協会フランセーズ・コントレ・レ・ミオパシーによってサポートされました。著者たちは、ペルラ・レイエス=フェルナンデス博士とマシュー・ボロク博士が原稿を注意深く読んでくれたことに感謝している。

実験は、フランスおよび欧州共同体の法律(ライセンス番号11-00010)に従って行われました。
1. トラガカンスガムの調製
<ol><li>ガラスビーカーに6gのトラガカンス粉末を100mLの脱イオン水に溶解する。ホイルで覆い、少なくとも3時間放置し、混合物が急速に粘性になると金属ヘラで手動でかき混ぜます。</li>
	<li>トラガカンス混合物は、水浴またはオーブンで一晩60°Cに残します。乾燥を避けるためにビーカーを慎重に密封してください。アリクォートの前に少なくとも一度かき混ぜる。</li>
	<li>アリコートと保存は4 °Cで最大2週間。</li>
</ol>2. 筋肉のコレクション
注:この実験のために、4週齢の雄のmdxマウスが子宮頸部脱臼によって犠牲になった。この手順は麻酔を必要とせず、現地の法律に従って人道的な殺害方法です。
<ol><li>脛骨前筋(TA)の解剖<ol>
<li>マウスの脚を剃った後、背中にマウスを置き、針でコルクボードに足を固定します。精密はさみ(またはメス)と鉗子を使用して、足から膝までの脚の皮膚を取り除き、脛骨とTAの全長を露出させます。</li>
		<li>はさみで脛骨とTAの間に切開を行います。これは骨からのTAの分離を促進し、エピミシウムに容易なグリップを提供する。精密鉗子を使用して、TAの表面からエピミウム層を慎重に除去する。 メモ:このステップから、TAは乾燥の影響を受けやすくなるかもしれません。</li>
		<li>足首領域で、TA腱を鉗子で他の腱から分離する。TA腱をそっと引き上げて脛骨や周囲の筋肉から隔離します。</li>
		<li>TA腹が完全に分離したら、TA筋肉の近位部分だけが膝に付着するように腱を持ち上げます。近位腱をできるだけ膝の骨に近づける。</li>
		<li>TAを生理線で軽く湿らせたガーゼに入れ、乾燥を避けてから筋肉を凍らせます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プラスチックまたはポリテトラフルオロエチレンビーカーにイソペンタンの70−100 mLを予め冷却し、液体窒素に部分的に浸漬する。ビーカーの底にあるイソペンタンが白い固体になるまで冷やします。</li>
	<li>円形のコルク(20 mm x 11 mm x 8 mm)に、トラガカンスガムを~0.5 mL置きます。凍結工程後に生検を適切に識別できるように、コルクの反対側に慎重に事前ラベルを付けます。</li>
	<li>鉗子、遠位腱を上げてガムにTAを埋め込みます。筋肉の適切な断面を許可するには、コルク表面に垂直な軸で筋肉を保持します。生検が完全にガムに埋め込まれていない場合、凍結切片の質は向上します。TA(腱側)の少なくとも半分がガムによって発見されることを許可する。</li>
	<li>すぐに未凍結、冷たいアイシペンタン層に埋め込まれた筋肉とコルクを浸します。コルクは液体アイノペンタンに浮かびますのでご注意ください。筋肉をイシペンタンに浸す必要があるので、サンプルを逆さまに保持します。完全な凍結を可能にするために、約2分間イモペンタンにサンプルを残します。 注:この段階から、TAは凍結されたままにしておかなければなりません。筋肉をドライアイスに保管してから、-80°Cの冷凍庫に長期保存してください。</li>
</ol>3. クライオセクション
<ol><li>クライオスタット温度を-25°Cに設定します。物体の温度は-20°C前後に保ちます。最適な切断温度(OCT)化合物を使用してクライオスタット内のオブジェクトを固定します。筋肉の腹に達するまで筋肉をトリミングし、7-10 μmのセクションをカットします。 メモ:物体温度の安定化には少なくとも10分が必要です。</li>
	<li>室温(RT)で凍結切片を収集するために使用するガラススライドを保ちます。各スライドに少なくとも 2 つのセクションを収集します。筋肉のセクションは自動的に暖かいガラスのスライドの接触で固執し、解凍します。スライドを取り外し、RT に保管します。</li>
	<li>換気された環境でRTで少なくとも20分乾燥させるセクションを許可します。</li>
	<li>使用するまで-80°Cのガラススライドにクライオセクションを保管してください。</li>
</ol>4. 免疫標識
<ol><li>換気環境で少なくとも15分間RTでスライドを解凍します。</li>
	<li>疎水性ペンでセクション領域を線分化します。疎水性バリアを乾燥させます。</li>
	<li>湿気の多いチャンバーで10分間、2%パラホルムアルデヒドで組織を固定します。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩分(PBS)2xで切片をそれぞれ5分間洗浄する。</li>
	<li>湿気の多い部屋のRTで1時間PBSで希釈した10%ヤギ血清で筋肉切片をブロックします。</li>
	<li>5%ヤギ血清で希釈した一次抗体を用いて湿気の多いチャンバーでRT(または4°Cで一晩)で2時間の切片をインキュベートします。ミオファイバーにおける単純なIgG取り込みラベリングの場合、マウスパンラミニンにウサギ抗体を持つ切片のみをインキュベートする。 注:細胞外マトリックスの他の抗原は、ミオファイバーの周囲の細胞外マトリックスの明確な標識を提供する限り標的化することができる。筋肉再生、炎症、または他のパラメータのマーカーは、抗体がマウス宿主で上昇しない限り組み合わせることができる。分析に使用される顕微鏡は、補助蛍光色を含むべきである。</li>
	<li>各5分間、PBS 3xでセクションを洗浄します。</li>
	<li>ウサギIgG H&Lと緑色蛍光ヤギポリクローナル二次抗体に赤色蛍光ヤギポリクローナル二次抗体を含む切片を、湿気の多いチャンバーでRTで45分間RTにインキュベートします。</li>
	<li>それぞれ10分間PBS 3xで洗浄します。</li>
	<li>100 ng/mL 4',6-ジアミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)を含む蛍光取り付け媒体のセクションを取り付け、各スライドをカバースリップで覆います。</li>
	<li>イメージングする前に4°Cで一晩乾燥させます。</li>
</ol>

<ol><li>Carpenter, S., Karpati, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy%3A+plasma+membrane+loss+initiates+muscle+cell+necrosis+unless+it+is+repaired%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy: plasma membrane loss initiates muscle cell necrosis unless it is repaired.</a> Brain. 102 (1), 147-161 (1979).</li>
<li>Cornelio, F., Dones, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+degeneration+and+necrosis+in+muscular+dystrophy+and+other+muscle+diseases%3A+cytochemical+and+immunocytochemical+data%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber degeneration and necrosis in muscular dystrophy and other muscle diseases: cytochemical and immunocytochemical data.</a> Annals of Neurology. 16 (6), 694-701 (1984).</li>
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<li>Bencze, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+macrophages+enhance+the+regenerative+capacity+of+human+myoblasts+by+modifying+their+kinetics+of+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory macrophages enhance the regenerative capacity of human myoblasts by modifying their kinetics of proliferation and differentiation.</a> Molecular Therapy. 20 (11), 2168-2179 (2012).</li>
<li>Moat, S. J., Bradley, D. M., Salmon, R., Clarke, A., Hartley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newborn+bloodspot+screening+for+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+21+years+experience+in+Wales+%28UK%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Newborn bloodspot screening for Duchenne muscular dystrophy: 21 years experience in Wales (UK).</a> European Journal of Human Genetics. 21 (10), 1049-1053 (2013).</li>
<li>Serrano, A. L., Munoz-Canoves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+dysregulation+of+fibrosis+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation and dysregulation of fibrosis in skeletal muscle.</a> Experimental Cell Research. 316 (18), 3050-3058 (2010).</li>
<li>Rosenberg, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-mediated+pathology+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-mediated pathology in Duchenne muscular dystrophy.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li>
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<li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+blood-brain+barrier+integrity%3A+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives%3F+Frontiers+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%229%22%5BJournal%5D)">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives? Frontiers in Neuroscience.</a> 9. 385, (2015).</li>
<li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> Journal of Cell Biology. 139 (2), 375-385 (1997).</li>
<li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+differences+in+regeneration+of+dystrophic+%28mdx%29+and+normal+muscle+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Age-related differences in regeneration of dystrophic (mdx) and normal muscle in the mouse.</a> Muscle and Nerve. 18 (10), 1147-1154 (1995).</li>
<li>Villalta, S. A., Nguyen, H. X., Deng, B., Gotoh, T., Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifts+in+macrophage+phenotypes+and+macrophage+competition+for+arginine+metabolism+affect+the+severity+of+muscle+pathology+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Shifts in macrophage phenotypes and macrophage competition for arginine metabolism affect the severity of muscle pathology in muscular dystrophy.</a> Human Molecular Genetics. 18 (3), 482-496 (2009).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

筋線維壊死は、正常な筋肉の外傷性運動の一般的な結果である。それは局所的な筋肉前駆者の強力な再生能力によって十分に補償される。しかし、MDのようないくつかの筋肉の状態では、衛星細胞の再生能力は慢性ミネクロシスおよび過剰な線維化によって損なわれる。最近の知見は、筋線維が壊死の調節形態である壊死によって死ぬことを示している。より具体的には、壊性の阻害は、DMD治療のための新しい治療戦略となり得る4.筋肉変性障害における細胞死経路を調べるには、筋細胞死定量の信頼性の高い方法が必要です。このプロトコルは、壊死を受けた筋線維を標識するIgG取り込み免疫蛍光技術を記述する。
壊死を特徴付ける血漿膜完全性の喪失は、損傷関連分子パターンの放出およびアルブミン、IgGおよびIgM15のような血漿タンパク質の取り込みにつながる。IgG取り込みラベリング法の作用機序は、EBDなどの重要な染料の作用機と類似している。壊死性筋線維は透過性になり、注射された重要な色素の血液タンパク質を捕捉しますが、生きている細胞は透...

縞状の骨格筋は、主に筋線維(筋線維)で構成され、特徴的な自発的収縮機能を担います。これらの細胞は、収縮中に発生する機械的ストレスをサポートする多核化された、有糸後の構造です。ミオファイバー膜(サルコレンマ)とその細胞外マトリックスの構造安定性は、組織恒常性のために重要である。衛星細胞は、成熟した骨格筋の主要な筋肉前駆集団を含み、健康な筋肉の静止状態に存在する。筋線維死後、筋再生は、衛星細胞の活性化、増殖、分化、融合を伴う筋細胞によって、最終的に新しい多核性ミオファイバーを形成する衛星細胞によって支持される。
ミオファイバーの消滅は、機械的外傷、虚血再灌流傷害、または筋ジストロフィーを含む複数の筋肉状態で起こり得、そして死細胞1、2の壊死形態に関連している。壊死は、形質膜の急速な透過性および細胞外コンパートメント3における細胞含有量の放出によって特徴付される。これは、適切な細胞シグナル伝達を伴う無秩序なプロセス(すなわち、偶発的壊死)、または調整された細胞内経路(すなわち、調節された壊死)のいずれかから生じ得る。ミオファイバーでは、規制された4プロセスと規制されていない5プロセスの両方が壊死につながる可能性があります。ミオネクロシスの典型的な結果は、損傷関連分子パターンの放出であり、強力な炎症反応を活性化する6。マクロファージの存在は、傷害7に続いて約48時間および72時間で観察される。壊死性残骸のクリアランスにおける彼らの役割に加えて、それらはまた、筋肉再生8、9で重要である。
筋ジストロフィー(MD)は、しばしばサルコレンマ構造の欠陥から生じる病理の異種グループである。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、世界中の3,500人の男性出生のうち約1人に影響を及ぼす若年性X結合疾患であり、サルコレンマにおけるジストロフィン発現の欠如によって引き起こされる。DMD少年の筋肉組織の慢性変性は、極端な筋力低下と早期死亡率につながる。壊死に起因する炎症は、細胞傷害性を増強し、筋線維化および筋機能の喪失を促進する11、12。現在、遺伝子治療などの筋肉変性疾患の根源を標的とした臨床試験中の治療法は、ミオネクロシスの緩和が期待されています。したがって、筋肉の変性を正確に定量する簡単な技術が必要です。
生体内のミオファイバー損失を監視するためにいくつかの方法が日常的に使用されます。血液中のクレアチンキナーゼ(CK)の酵素活性の測定は、筋肉および心臓組織における進行中の壊死の信頼性の高い定量を可能にする。現場では、ヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色は、変性再生リモデリングを評価するために診断に現在使用されている最も一般的な方法です。しかしながら、死細胞のH&E標識の分子基盤は不明のままである。さらに、H&E染色におけるミオファイバー死を示唆する色の改変は比較的微妙であり、信頼性が高く再現性の高い定量化を促進しない。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)などのDNA断片化を明らかにする方法は、不完全な標識壊死3。彼らはまた、ミオファイバーなどの同期細胞の死を監視するために不十分に適応されています。エヴァンの青色染料(EBD)のような重要な染料の注入は、サルコレンマの完全性を失ったミオファイバーを評価するのに有用な代替手段を表すが、一部の実験プロトコルでは必ずしも便利ではない。例えば、血液サンプル中のEBDの存在は、CK測定、比色アッセイの結果に影響を与えることができる。さらに、EBDの細胞内取り込みは、共免疫標識を困難にする。したがって、壊死を受けている筋線維の直接表示を可能にする代替方法が興味深い。
重要な色素の作用機序は、壊死性筋線維における血漿膜完全性の喪失と注入された色素の受動的な取り込みに依存する。同様に、壊死性筋線維は、アルブミンなどの血液タンパク質を取り込み、EBDが強い親和性を有する13、14、免疫グロブリンG(IgG)、およびIgM15である。したがって、ミオファイバー内の血液タンパク質の異常な存在は、その上のミオクロス症のための便利なマーカーを表します。これらのタンパク質を染色することは、重要な染料の使用のための代替手段であることができます。
IgG取り込みを上座でのミオネクロシスのマーカーとして使用することにより、このプロトコルは、mdxジストロフィン欠損マウスの脛骨前(TA)における筋肉変性を評価するために使用される。この方法は、代替技術よりも大きな利点を提示します: 1) 再現性があり、実行が簡単です。2)循環性重要色素の注入などの筋肉採取前の動物治療を必要とせず、3)従来の免疫標識として、共標識と互換性がある。

<table><tbody><tr><td>円形コルクディスク</td><td>ピラミッドイノベーション</td><td>R30001-E</td><td>凍結後にサンプルのIDを決定できるように、コルクに明確にラベルを付けることを忘れないでください</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM3050 sn34</td><td>筋肉の凍結切片化は-20〜-25°Cの間で行う必要があります。</td></tr><tr><td>ダコペン</td><td>ダコ</td><td>S2002</td><td>筋肉部の周りの疎水性バリア。インキュベーション中の培地の分散を防ぎます</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>FST</td><td>91117-10</td><td>/</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG(H + L)抗体、 Alexa Fluor Plus 488</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A-11029</td><td>希釈:1/500</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H + L)抗体 Alexa Fluor Plus 594</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A32740</td><td>希釈:1/500</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td>ブロッキングステップで、PBSで10%希釈します。抗体のインキュベーションには、PBS</td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78-78-4</td><td>凍結培地で5%希釈してください。液体窒素に入れたビーカーで冷やす必要があります。</td></tr><tr><td>mdxマウス</td><td>Jackson Laboratory</td><td>C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J</td><td>MDXマウスは、ジストロフィン遺伝子に対して変異しています。生後3週間から、筋肉は慢性変性によって特徴付けられます</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>イメージャーD1</td> <td>/</td></tr> <tr><td>OCT</td><td>Cellpath</td><td>KMA-0100-00A</td><td>埋め込みマトリックス</td></tr><tr><td>PFA(パラホルムアルデヒド)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>28908</td><td>凍結切片の固定に使用されます(2%または4%PFAを使用できます)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Eurobio</td><td>CS3PBS00-01</td>希釈<td>媒体免疫標識</td></tr><tr><td>精密サイザー</td><td>FST</td><td>fst 14001-12 および fst 14001-14</td><td>筋肉収集に使用</td></tr><tr><td>マウスに対するウサギ抗体 pan-Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9393</td><td>希釈率: 1/1000</td></tr><tr><td>Tragacanth</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1128</td><td>アリコート +4&deg;ハ</td></tr></tbody></table>

筋生検における免疫標識筋線維変性

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

筋線維の壊死(ミオネクロシス)は、筋ジストロフィーを含むいくつかの筋肉疾患の病因において中心的な役割を果たす。筋ジストロフィー病因の原因に対処する治療オプションは、筋肉の変性を緩和することが期待される。そのため、筋生検における細胞死の程度をアッセイおよび定量する方法が必要である。その上でミオファイバー変性を観察する従来の方法は、定量性が低いか、または重要な色素の注入に依存する。本稿では、免疫蛍光プロトコルは、ミオファイバーによる免疫グロブリンG(IgG)取り込みを標的とすることにより壊死性ミオファイバーを染色することを説明する。IgG取り込み方法は、1)損傷関連分子パターンの放出による血漿膜完全性の喪失および2)血漿タンパク質の取り込みを含む、壊死性の破壊を特徴とする細胞特徴に基づいている。マウス断面では、ミオファイバー、細胞外マトリックスタンパク質、マウスIgGの共免疫標識により、壊死性の運命を持つミオファイバーのクリーンで簡単な同定が可能になります。この簡単な方法は、定量分析に適しており、ヒトサンプルを含むすべての種に適用可能であり、重要な色素の注入を必要としません。IgG取り込みによる壊死性ミオファイバーの染色は、他の共免疫標識と対緒することもできる。

ミオファイバーは、ラミニン含有細胞外マトリックスに囲まれている。赤色染色はミオファイバーの周辺を区切り、その同定を可能にする。IgG は緑色で表示されます。核はDAPIで染色され、顕微鏡下で青色に見られる。しかし、核はここに白で示されている(図1)。弱いIgG免疫反応性は、炎症の場合に増加することができる細胞外コンパートメントで期待される。ミオファイバー内の緑色染色はIgGの存在を反映する。
MdxマウスTAは、3週齢における急性ミオネクロシスの一過性期を特徴とし、その後非同期変性再生イベントが続く。その結果、4週齢のmdxマウスのTAは、影響の低い領域を含む異種プロファイルを表示し、同じ断面で一緒に変性および再生領域を表示することが多い(図1a)。影響を受けない/軽度に影響を受けない筋肉領域は、大き...

ここで説明するプロトコルは、筋凍結切片における壊死性筋線維の直接免疫標識のためのプロトコルである。壊死細胞は、免疫グロブリンG(IgG)を含む血清タンパク質に透過性である。ミオファイバーによるIgGの取り込みを明らかにすることで、筋肉の状態に関係なく壊死を起こす筋線維の同定と定量を可能にする。

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

筋線維壊死は、複数の神経筋疾患の特徴であり、病因の中心的な役割を果たしています。筋肉変性を評価するための特定の信頼性の高い方法は、診断および翻訳研究にとって重要です。この非常に適応可能な技術は、そのミオファイバー内の同じセクション内で同時に複数の抗原の標識を可能にする。それは重要な染料で可能である。H&E染色は、信頼性が高く再現可能な活用には適応できない経験的手法です。IgGの取り込み染色は、しかし、壊死性筋細胞に特異的であり、ヒトの生検に適用可能である。この技術は、筋性脳神経症を特徴とする全ての神経筋疾患に関する洞察を提供することができる。興味のある脚から髪を取り除いた後、4週齢のオスのmdx動物をsupineの位置に置き、足をコルクボードに固定します。精密なはさみや鉗子を使用して脛脛知の前部の全長を露出させるために足から膝に足の皮膚を取り除く。はさみを使用して脛目と脛岩前部の間に切開を行います。鉗子を使用して、筋肉の表面から上層を慎重に除去します。足首では、鉗子を使用して脛表リス前腱を他の腱から分離し、腱をそっと引き上げて脛体および周囲の筋肉から分離する。脛表症前腹が完全に分離した場合、脛側前筋の近位部分のみが膝に付着するように腱を保持する。そして、膝蓋骨にできるだけ近い近位腱を穏やかに切断します。乾燥を避けるために、生理液で軽く湿らせたガーゼの上にチバイアリス前部を置きます。70~100ミリリットルのイソペンタンを含むビーカーを、ビーカーの底部のイポペンタンが白色固体になるまで液体窒素の容器に部分的に浸す。凍結後に生検を適切に識別できるようにコルクの反対側に慎重に事前ラベルを付け、約0.5ミリリットルのトラガカンスガムを20%11、8ミリメートルのコルクの円形部分に加えます。鉗子を使用して、歯茎遠位腱側に脛表を埋め込みます。コルク表面に垂直な軸で筋肉を保持します。脛表前部の腱側の少なくとも半分は、ガムによって発見されたままであるべきである。その後、すぐに完全な凍結を可能にするために、チルド、凍結されていないイポランタンに埋め込まれたコルクを約2分間浸します。凍結組織の切片を取得し、クライオスタット温度をマイナス25°Cに設定し、最適な切断温度化合物を使用して、組織をクライオスタット切断ブロックに固定します。筋肉の腹に達するまでサンプルをトリミングします。セクションがキャプチャされると、室温でスライドを配置ガラススライドごとに少なくとも2つのセクションを収集する7〜10マイクロメートルのセクションを得る。換気された環境で、組織を室温で少なくとも20分間乾燥させます。その後、セクションが染色されるまでマイナス80°Cで保管します。組織を免疫標識する。まず、換気環境で最低15分間室温でスライドを解凍する。次に、疎水性ペンでセクションを線分します。湿気の多いチ

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

ここで、我々は、改善された染色質、及びそれによって自動取得し、自由に利用可能なソフトウェアのImageJを用いた繊維集団の定量化を可能にする迅速な筋線維分析、のためのプロトコルを提示します。...

ミオシン重鎖免疫組織化学を使用して、ラット筋断面における筋線維人口分析のための迅速な自動化されたプロトコル

低侵襲の筋肉 (MIME) の埋め込み - ドナー細胞の筋を容易にする新しい実験手法

アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。...

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

骨格筋線維タイプの新式の識別子として浮上している免疫組織化学的染色ミオシン重鎖アイソ フォームの (すなわち、タイプ I、IIA を入力、IIX を入力、IIB を入力)。ここでは、繊維の種類や繊維の形態の迅速な評価を容易にする新しい半自動アルゴリズムとともに汚損のプロトコルを提案する.

マウス骨格筋形態と繊維の種類組成の半自動解析

このプロトコルでは、筋肉幹細胞のインビトロ培養および機能解析方法が記載されており、内因性ニッチとの相互作用のほとんどを維持する。...

成人筋幹細胞機能評価のための単一筋繊維培養アッセイ Ex Vivo

神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。...

全山神経筋接合部の免疫蛍光解析と形態測定解析のための単一骨格筋線維の解剖

増加する証拠は、骨格筋内の脂質の過剰な浸潤が脂肪毒性および糖尿病をもたらすことを示している。ここでは、線維型特異的な方法で脂肪滴のサイズ、密度、および細胞内分布を定量化するために、組織処理、Bodipyによる染色、画像取得、および分析を含む完全なプロトコルを提示する。...

骨格筋中の脂肪滴含量の線維タイプおよび細胞下特異的分析

このプロトコルは、酸化性のヒメスから完全な単一筋繊維を分離し、これらの繊維から得られる高度に精製された筋芽細胞培養を確立することを記述しています。最適化された手法により、マウスあたり約300〜500本の完全な筋線維を確実に取得でき、下流の分子および細胞解析が可能になります。...

酸化的マイオファイバー挙動の評価のための単一線維分離アッセイ

研修生による細針吸引生検（FNAB）の練習は、簡単に利用できる、適切な病変の不足のため、比較的困難です。...

調製と細針吸引生検を実施するためにファントム病変を使用して

学ぶ筋生検における免疫標識法を用いて、壊死性筋線維を特定・定量化する手法。IgG取り込み染色により神経筋疾患における筋変性を評価し、mdxマウスモデルで再生・退行プロセスを解明する。

筋生検における免疫標識筋線維変性

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