Name: フローサイトメトリーによるBKポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 学ぶ BKポリオマウイルスの非コード制御領域駆動転写活性測定法。HEK293T細胞を用いたフローサイトメトリーによる二重蛍光解析で、抗ウイルス化合物の効果を定量的に評価する手法です。

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著者らは、バーバラ・ブリークマンに優れた技術支援を感謝しています。これらの研究は、デュースブルク・エッセン大学医学部のIFORESプログラムと大学アライアンス・ルール・アンド・メルカトル研究センター・ルール(MERCUR)のRIMURプログラムによって支援されました。著者らは、ヘレネ・セルツニッヒの博士課程のフェローシップと絶え間ない支援に対して、ユルゲン・マンチョット・スティフトゥンに感謝しています。患者材料の収集と使用は、大学デュースブルクエッセン(14-6028-BO)の医学部の倫理委員会によって承認されています。

このプロトコルは、デュースブルクエッセン大学(14-6028-BO)の医学部の倫理委員会によって承認された人間の研究のガイドラインに従います。
1. 血液または尿サンプルの採取とポリオマウイルスDNAの単離
<ol><li>EDTAチューブまたは取得チューブ内の尿中の血液の少なくとも3 mLを収集します。</li>
	<li>2,500 x gで15分間サンプルを遠心分離します。必要に応じて、ピペットプラズマを新しいチューブに入れ、プラズマサンプルを数日間4°Cで保存するか、-20°Cで凍結して長期保存します。</li>
	<li>40 μLのプロテインサーゼKを1.5mLマイクロ遠心分離管に準備し、ピペッティングにより400μLのプラズマを追加します。</li>
	<li>400 μLのリシスバッファーを加え、15sの渦を加えてサンプルをlyseし、56°Cで10分間インキュベートする。</li>
	<li>製造元の指示に従ってDNA採取キットを用いてDNAを分離する。簡単に言えば、アルコールを追加し、DNA結合シリカベースの膜を含むスピンカラムにライサテスをロードします。純粋なDNAを得るために列を数回洗います。</li>
	<li>TE バッファーの 30-50 μL で得られた DNA を溶出します。</li>
</ol>2. 非コーディング制御領域(NCCR)の増幅
<ol><li>物理的に離れた部屋で次の手順を実行します。試薬を準備し、PCRチューブにミックスを分配するために隔離された部屋を使用してください。</li>
	<li>プライマーペアA(表1)を合計体積50μLで使用してPCR前のマスターミックスを準備し、ステップ1.6から以前に単離したDNAを使用します。プレ PCR と入れ子になった PCR のマスター ミックスを準備するためのピペッティング スキームは、表 2に出力されます。</li>
	<li>マスターミックスの45 μLをPCRチューブに分配します。</li>
	<li>単離されたDNAをPCRチューブに5μLを加えます。 注:汚染を避けるために、マスターミックスの準備のために1つ以外の部屋を使用してください。</li>
	<li>表 3に示すように、反応条件を使用して PCR を実行します。35サイクルで脱退、アニーリング、延長を繰り返します。</li>
	<li>入れ子になった増幅の場合は、AgeI および SpeI の制限部位を収容するプライマー ペア B を使用します (表1)。</li>
	<li>手順 2.2 ~ 2.5 で説明したように、入れ子になった PCR を、PCR 前の 5 μL を使用して実行します。</li>
	<li>PCR製品の10 μLを6倍ゲルローディング色素の2μLと混合します。1.5%のアガロースゲルにミックスの10 μLをロードし、60 mAで30分間ゲルを実行します。</li>
	<li>適切なUVドキュメンテーションシステムを使用してゲルを視覚化します。 注:アンプリコンのサイズは、再配置(削除、挿入、または重複)が発生したかどうかに応じて300~500 bpの間であると予想されます(図2C)。</li>
	<li>製造元の指示に従って、PCR精製キットを使用してPCRアンプリコンを浄化します。溶出バッファーの30 μLでPCRアンプリコンを溶出します。</li>
	<li>プライマーペアBを使用してサンガーシーケンシング用のアンプリコンを送信します。</li>
</ol>3. 二重蛍光レポーターへのNCCRのクローニング
<ol><li>表4に記載されているように、精製されたアンプリコン(ステップ2.10)をAgeIおよびSpeIで2時間37°Cで消化する。</li>
	<li>ステップ2.10を繰り返し、消化されたアンプリコンを精製します。</li>
	<li>並行して、表5に記載されているように、プラスミドバックボーン(1.5 μg)をAgeIおよびSpeIで2時間37°Cで2時間消化する。この手順は 1 回だけ実行する必要があります。その後の反応については、-20°Cで消化を凍結します。</li>
	<li>0.8%低溶融アガロースゲルで消化されたプラスミドバックボーンを分析します。 注:40 mAより高い電流でゲルを実行しないでください。もともとプラスミドpEX-K4 2-LTR CD313に由来するスペーサー領域の期待挿入は128 bp(図2C)である。</li>
	<li>長波紫外線(320nm)を用いてDNA断片を可視化し、きれいなメスを使ってバックボーンバンドを切り取ります。低溶融ゲル断片を新しい1.5 mLマイクロ遠心管に移します。DNA損傷を防ぐために、長時間の紫外線曝露時間を避けてください。 注:低溶融アガロースを使用しているので、ライゲーションの前にDNAを精製する必要はありません。</li>
	<li>低溶融アガロース片を含むバックボーンを65°Cで10分間加熱し、ゲル片を溶かし、穏やかな渦で2分ごとに混ぜます。溶融ゲルは、ライゲーションに直接使用することができます。</li>
	<li>表6に示すスキームを用いて、T4 DNAリゲスを16°Cで一晩使用してバックボーンと消化アンプリコンをリゲートする。</li>
	<li>ヒートショック法、LBアンプレート上のプレート細菌、および一晩37°Cの培養を用いて大腸菌の形質転換を行う。</li>
	<li>翌日、3つの陽性クローンを選択し、一晩大腸菌培養(LB-Ampの5mL)と37°Cの培養物を調製する。</li>
	<li>他の場所で説明されているように標準プロトコルを使用してプラスミドDNAを分離し、AgeIとSpeI消化を行って陽性クローンをチェックし、1%アガロースゲル上の断片を視覚化します。スペーサーバンド(128 bp)は、より大きなNCCRシーケンス(300~500 bp、上記参照)に置き換えられます。</li>
	<li>プライマーEGFP-NまたはプライマーペアB(表1)を使用してサンガーシーケンシング用のプラスミドを送信します。</li>
	<li>突然変異が自然に起こる可能性があるため、シーケンス結果とアンプリコンで得られたシーケンス結果を比較します。アンプリコンと比較して同じシーケンスを含むクローンのみを使用してください。</li>
	<li>分子ワークベンチソフトウェア(フリーウェアGENtle 1.9.4またはその他のシーケンス編集プログラム)を使用して、得られたシーケンスを整列および編集します(図3)。</li>
	<li>GENtle 1.9.4 を起動し、[インポート] ボタン(緑色の下向き矢印) をクリックして DNA 配列をインポートします。</li>
	<li>次にツールをクリックし、メニューから[整列]を選択します (ショートカットとして Ctrl キーを押しながら GG を使用)、位置合わせ用の DNA シーケンスを選択します。</li>
	<li>[削除] をクリックして[配列を追加]または[シーケンスを削除]をクリックして、配置にシーケンスを追加します。JN19243815のような原型NCCRコンセンサスシーケンスを含め、一般的に使用されるダンロップ株16からのNCCR配列を使用しないでください。株。 注: NCCR には、翻訳開始コドンが既に含まれています (図3)。</li>
	<li>ツールバーの[アルゴリズム]をクリックして位置合わせの方法を選択し、alustal W. アライメントパラメータを2に一致させる位置合わせパラメータを設定し、ギャップ延長ペナルティ-1;ギャップペナルティ-2をクリックして位置合わせを実行します。 </li>
</ol>4. レポータープラスミドによるHEK293T細胞の一過性トランスフェクションと潜在的な抗ウイルス剤による治療
<ol><li>その後のトランスフェクション実験のために十分な量のプラスミドDNAを調製するために、150mLの一晩培養を調製する。プラスミド分離キットを用いてプラスミドDNAを単離する。あるいは、他のプラスミド精製キットを用いてもよい。</li>
	<li>シード1 x 105 HEK293T細胞を含むDMEM中の10%FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシン(1x)を12ウェルプレートのウェル当たり24時間前にトランスフェクションし、37°Cおよび5%CO2で一晩インキュベートし、トランスフェクション中に活性増殖を維持する。 注:細胞はトランスフェクション時に約80%のコンフルエントでなければなりません。</li>
	<li>減らされた血清培地の250 μLを無菌チューブに入れ、各レポータープラスミドDNAの1 μgを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。</li>
	<li>DNA混合物にトランスフェクション試薬の3μLを加え、ピペッティングで穏やかに混合し、15分間インキュベートします。</li>
	<li>混合物を井戸に滴下し、そっと井戸に分配します。</li>
	<li>4時間後、上清を試験剤と溶媒制御を含む新鮮な培地に置き換えます。分析するまで37°Cでインキュベートします。この例では、mTOR阻害剤INK128(100 ng/mL)およびラパマイシン(100ng/mL)を用いた。</li>
</ol>5. 蛍光顕微鏡とフローサイトメトリー
<ol><li>蛍光顕微鏡下で赤色と緑色の蛍光を細胞で確認してください(図4)。 注:赤色および緑色蛍光は、それぞれ初期および後期のBKPyV遺伝子発現に対応する。</li>
	<li>72時間後トランスフェクション後、上清を吸引し、1mLの冷たいPBSで細胞を2回洗浄する。</li>
	<li>500 μLのトリプシンをゆっくりと加え、細胞の早期剥離を避けるためにプレートを少し回します。この手順は、セルの二重化を避けるために重要です。</li>
	<li>追加した後、同じピペットチップで直接トリプシンを削除します。</li>
	<li>細胞を37°Cで少なくとも5分間インキュベートします。</li>
	<li>3%FCSを含むPBSの1 mLでトリプシン化された細胞を再懸濁し、事前に標識されたFACSチューブに懸濁液を移します。</li>
	<li>FACS 解析の前に DAPI (1 μg/mL) を追加します。</li>
	<li>フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。各サンプルについて、DAPI染色に対して陰性である少なくとも10,000個の生細胞を測定します。</li>
</ol>6. データ分析
<ol><li>フローサイトメトリー解析ソフトウェアにデータをインポートし、クリックしてワークスペースにドラッグしてサンプルを追加します。</li>
	<li>読み込んだファイルをダブルクリックして、グラフプロットを作成します。X 軸と Y 軸をクリックして、FSC-A と SSC-A を選択します。ツールバーのポリゴンをクリックし、セルの母集団をフレーミングして、メインセルの人口をゲートします(図5)。必要に応じて、選択したセルの母集団に名前を付けます (たとえば、"単一セル")。"単一のセル" が新しいワークスペースとして表示されます。</li>
	<li>DAPI陰性(すなわち「生細胞」)の「単一細胞」をゲーティングに進めます。生細胞を同定するために、DAPI染色の有無にかかわらず細胞集団を比較する。どちらのプロットでも FSC-A と太平洋青-A を選択します。</li>
	<li>長方形をクリックしてDAPI陰性細胞集団を選択し、選択した細胞集団に「生細胞」という名前を付け、前述のようにFITC(eGFP)とPE(tdTomato)を示す新しいドットプロットを作成します。</li>
	<li>ツールバーから[クワッド]を選択して、「生きているセル」に象限を追加します。各個体の端に象限の中心をドラッグして、母集団をゲートします。象限は、1) eGFP-tdTOM-, 2) eGFP-tdTOM+, 3) eGFP+tdTOM-, 4) eGFP+tdTOM+を表します。 注:FITCとPEの間の放出スペクトルのスペクトルオーバーレイのために、最初の補償は赤と緑の信号を区別し、正確な結果を達成するために不可欠です。</li>
	<li>象限を右クリックし、[統計の追加] を選択して、平均蛍光強度 (MIS) を決定します。[平均]を選択し、[OK] をクリックします。 平均 MFI は、「統計」セクションの母集団の下に表示されるようになりました。象限 2 と 4 は初期式に対応し、象限 3 と 4 は後期式を表します。</li>
	<li>統計力のために同じ方法で追加の反復を追加します。</li>
	<li>データ解釈の場合は、バープロットの早期および後期のMFI値をプロットします。</li>
	<li>異なるドナーまたはウイルス株から得られたNCCR活性を比較するには、原型制御またはダンロップ株16を追加し、その相対MFIを100%に設定し、相対MFI値を計算する。各反復を繰り返し、平均と標準偏差を決定します。</li>
	<li>転写活性に対する潜在的な化合物の効果を評価するには、溶媒対照を100%に設定し、処理された細胞のMFIをプロットする。</li>
</ol>

<ol><li>Drachenberg, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+patterns+of+polyomavirus+nephropathy%3A+correlation+with+graft+outcome+and+viral+load%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplant%22%5BJournal%5D)">Histological patterns of polyomavirus nephropathy: correlation with graft outcome and viral load.</a> American Journal of Transplant. 4 (12), 2082-2092 (2004).</li>
<li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+low-level+BK+polyomavirus+viremia+on+intermediate-term+renal+allograft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Impact of low-level BK polyomavirus viremia on intermediate-term renal allograft function.</a> Transplant Infectious Disease. 20 (1), (2018).</li>
<li>Hirsch, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+perspective+on+human+polyomavirus+infection%2C+replication+and+disease+in+solid+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">European perspective on human polyomavirus infection, replication and disease in solid organ transplantation.</a> Clinical Microbiology and Infection. 20 Suppl 7, 74-88 (2014).</li>
<li>Masutani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Banff+2009+Working+Proposal+for+polyomavirus+nephropathy%3A+a+critical+evaluation+of+its+utility+as+a+determinant+of+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The Banff 2009 Working Proposal for polyomavirus nephropathy: a critical evaluation of its utility as a determinant of clinical outcome.</a> American Journal of Transplantation. 12 (4), 907-918 (2012).</li>
<li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+immune+suppressive+agents+on+the+BK-Polyomavirus+non+coding+control+region%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of immune suppressive agents on the BK-Polyomavirus non coding control region.</a> Antiviral Research. 159, 68-76 (2018).</li>
<li>Hirsch, H. H., Yakhontova, K., Lu, M., Manzetti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+Polyomavirus+Replication+in+Renal+Tubular+Epithelial+Cells+Is+Inhibited+by+Sirolimus%2C+but+Activated+by+Tacrolimus+Through+a+Pathway+Involving+FKBP-12%5BTitle%5D)+AND+%22Amerian+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">BK Polyomavirus Replication in Renal Tubular Epithelial Cells Is Inhibited by Sirolimus, but Activated by Tacrolimus Through a Pathway Involving FKBP-12.</a> Amerian Journal of Transplantation. 16 (3), 821-832 (2016).</li>
<li>Sanchez Fructuoso, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+target+of+rapamycin+signal+inhibitors+could+play+a+role+in+the+treatment+of+BK+polyomavirus+nephritis+in+renal+allograft+recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">Mammalian target of rapamycin signal inhibitors could play a role in the treatment of BK polyomavirus nephritis in renal allograft recipients.</a> Transplant Infectious Disease. 13 (6), 584-591 (2011).</li>
<li>Moens, U., Johansen, T., Johnsen, J. I., Seternes, O. M., Traavik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+control+region+of+naturally+occurring+BK+virus+variants%3A+sequence+comparison+and+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Noncoding control region of naturally occurring BK virus variants: sequence comparison and functional analysis.</a> Virus Genes. 10 (3), 261-275 (1995).</li>
<li>Gosert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyomavirus+BK+with+rearranged+noncoding+control+region+emerge+in+vivo+in+renal+transplant+patients+and+increase+viral+replication+and+cytopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Polyomavirus BK with rearranged noncoding control region emerge in vivo in renal transplant patients and increase viral replication and cytopathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 841-852 (2008).</li>
<li>Bethge, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sp1+sites+in+the+noncoding+control+region+of+BK+polyomavirus+are+key+regulators+of+bidirectional+viral+early+and+late+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sp1 sites in the noncoding control region of BK polyomavirus are key regulators of bidirectional viral early and late gene expression.</a> Journal of Virology. 89 (6), 3396-3411 (2015).</li>
<li>Gosert, R., Kardas, P., Major, E. O., Hirsch, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearranged+JC+virus+noncoding+control+regions+found+in+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient+samples+increase+virus+early+gene+expression+and+replication+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rearranged JC virus noncoding control regions found in progressive multifocal leukoencephalopathy patient samples increase virus early gene expression and replication rate.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10448-10456 (2010).</li>
<li>Bernhoff, E., Gutteberg, T. J., Sandvik, K., Hirsch, H. H., Rinaldo, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cidofovir+inhibits+polyomavirus+BK+replication+in+human+renal+tubular+cells+downstream+of+viral+early+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression.</a> American Journal of Transplantation. 8 (7), 1413-1422 (2008).</li>
<li>Widera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+persistent+viremia+is+frequently+followed+by+episodes+of+low-level+viremia%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+Immunology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 persistent viremia is frequently followed by episodes of low-level viremia.</a> Medical Microbiology Immunology. , (2017).</li>
<li>Zhang, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purifying+plasmid+DNA+from+bacterial+colonies+using+the+QIAGEN+Miniprep+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit.</a> Journal of Visualized Experiment. (6), 247(2007).</li>
<li>Drew, R. J., Walsh, A., Laoi, B. N., Crowley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+the+complete+genome+of+11+BKV+isolates+obtained+from+allogenic+stem+cell+transplant+recipients+in+Ireland%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of the complete genome of 11 BKV isolates obtained from allogenic stem cell transplant recipients in Ireland.</a> Journal of Medical Virology. 84 (7), 1037-1048 (2012).</li>
<li>Dorries, K., Vogel, E., Gunther, S., Czub, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+human+polyomaviruses+JC+and+BK+in+peripheral+blood+leukocytes+from+immunocompetent+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Infection of human polyomaviruses JC and BK in peripheral blood leukocytes from immunocompetent individuals.</a> Virology. 198 (1), 59-70 (1994).</li>
<li>Teutsch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+identification+of+renal+transplant+recipients+with+high+risk+of+polyomavirus-associated+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+Immunology%22%5BJournal%5D)">Early identification of renal transplant recipients with high risk of polyomavirus-associated nephropathy.</a> Medical Microbiology Immunology. 204 (6), 657-664 (2015).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> Journal of Visualized Experiment. (41), (2010).</li>
<li>Korth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+of+BKPyV+genotypes+II+and+IV+after+renal+transplantation+as+a+simple+tool+for+risk+assessment+for+PyVAN+and+transplant+outcome+already+at+early+stages+of+BKPyV+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">The detection of BKPyV genotypes II and IV after renal transplantation as a simple tool for risk assessment for PyVAN and transplant outcome already at early stages of BKPyV reactivation.</a> Journal of Clinical Virology. 113, 14-19 (2019).</li>
<li>Caputo, A., Barbanti-Brodano, G., Wang, E., Ricciardi, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+of+BKV+and+SV40+early+promoters+by+BKV+and+SV40+T-antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transactivation of BKV and SV40 early promoters by BKV and SV40 T-antigens.</a> Virology. 152 (2), 459-465 (1986).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
</ol>

ヨハネス・コルスは、アステラスとノバルティスから講演料と旅費の助成金を受けています。マレク・ワイデラはノバルティスからコンサルタント料を受け取っています。オリバー・ヴィッツケは、アムジェン、アレクシオン、アステラス、バシリア、バイオテスト、ブリストル・マイヤーズ・スクイブ、コレビオ、キエシ、ギリアド、ヘクサル、ヤンセン、F.ケーラー・シェミー博士、MSD、ノヴェルティスから臨床研究、講演者料、名誉、旅費の助成金を受けています。ファイザー、サノフィ、テバ

本稿では、BKPyV非コード制御領域(NCCR)の早期および後期プロモーター活性の分析を可能にする一般的に使用される方法が提示される。NCCR活性は同時に測定することができ、トランスフェクトされた細胞のリシスを必要としない。さらに、比較的多くの細胞を分析することができ、蛍光値の正規化のための追加マーカーの共トランスフェクションは必要ありません。
この方法の重要な部分は、クローン化されたNCCRがアンプリコンシーケンシングによって識別されるのとまったく同じ配列を含むべきであり、これは患者血漿中に存在する大多数の変異体に対応する。正確な結果を達成し、PCRが発生しやすいエラーを最小限に抑えるために、証拠読み取り活性を持つポリメラーゼを使用することを強くお勧めします。あるいは、配列は、市販の遺伝子合成サービスによって注文することができる。指定されたNCCRシーケンスは、直接クローンを作成するためのサイドエイジIおよびSpeI制限サイトを含む注文することができます。この場合、プラスミドをバックボーンプラスミドに平行に消化し、スペーサーインサートを合成コンストラクトから対応するNCCRフラグ...

ポリオマウイルスは、シミアンウイルス40(SV40)をプロトタイプ種として有する小さな二本鎖DNA(dsDNA)ウイルスの独立したファミリーを表す。一次感染は主に小児期に起こり、通常は疾患症状なしで進行し、通常は免疫有能な宿主で潜伏感染を引き起こす。BK-ポリオマウイルス(BKPyV)は、主に腎管細胞に腎症を引き起こすことなく持続するが、腎移植後の免疫能力の障害の場合、ウイルスは再活性化し、重度の損傷および移植片の障害を引き起こす可能性がある。高ウイルス血症(1 x 104 BKPyV DNAコピー/mL)1、2に達すると機能します。腎臓移植レシピエントのおよそ10%において、BK-ポリオマウイルス(BKPyV)の再活性化は、腎同種移植片障害のリスクが高い80%に関連したポリオマウイルス関連腎症(PyVAN)をもたらす3,4.承認された抗ウイルス剤が利用できないため、現在の治療は免疫抑制の減少に基づいている。興味深いことに、 mTOR 阻害剤は、抗ウイルス効果を持っているようです。;したがって、免疫抑制療法をmTORベースの免疫抑制に切り替えると、BKPyVウイルス血症5、6、7の進行を防ぐための代替アプローチを表しうる。しかし、mTORベースの抗ウイルス機構は現在まだ完全に理解されていない。したがって、臨床的に関連する濃度における潜在的な抗ウイルス剤の影響を測定する方法が必要とされる。
BKPyVの円形ゲノムは、複製の起源として機能する非コード制御領域(NCCR)を約5kbに収容し、それに付き合って早期および後期mRNA転写物の発現を駆動する双方向プロモーターで構成される。自発的に発生するNCCR再配列、欠損、および複製は病原性BKPyV8に見出され、PVAN 5、9に苦しむ患者において有意に蓄積されるので、原型(wt)および再配置された(rr)NCCR活動は、ウイルス複製性の適合性を特徴付けるために有用である。
図1に要約すると、このプロトコルは、レポータープラスミド5から発現した2つの蛍光体tdTomatoおよびeGFPの蛍光を定量することにより、BKPyV NCCR転写活性を測定するために一般的に使用される方法を説明する。9,10,11.この手順は、SV40大型T抗原(lTAg)の存在下で行われ、これは、NCCR活性の早期および後期に対する潜在的な抗ウイルス剤の影響を別々に5に分析することを可能にする。このアッセイは、NCCR活性に対する再配置の影響とwt-NCCR5,9との比較をさらに分析する。レポータープラスミドは、各蛍敵オープンリーディングフレームの下流にあるSV40後期ポリアデニル化信号を、tdTomatoおよびeGFPの両方のトランスクリプトの同等かつ効率的な処理を保証します。qRT-PCRベースの方法5、12と比較して、このFACSベースのアプローチは、感染した細胞培養のための複雑な抽出プロトコルがなく、高価ではないため、低コストで高スループット対応の代替手段を表します。免疫蛍光染色のための抗体が必要です。さらに、フローサイトメトリーを介して定義された量の蛍光細胞を分析するので、細胞周期阻害剤の分析も定量的に可能である。

<table><tbody><tr><td>100 bpのはしご</td><td>NEB</td><td>N3231</td><td>1 kbまでの範囲の任意のはしごを代用可能</td></tr><tr><td>2丸太のはしご</td><td>NEB</td><td>N0550</td><td>10 kbまでの範囲の任意のはしごを代用可能</td></tr><tr><td>寒天、神戸</td><td>I カールロス</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>AgeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3552</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン ナトリウムザルツ セルピュア</td><td>カールロス</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad iniectabilia</td><td>Bbraun</td><td>2351744</td>は<td>、任意のメーカーBD</td></tr><tr><td>FACSCanto&tradeで代用することができます。II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>、Sigma</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>DFC450Cカメラモジュール</td><td>ライカ</td><td></td><td>任意のカメラが使用可能</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td>どのメーカーでも代用可能</td></tr><tr><td>DMIL LED顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>任意の蛍光顕微鏡DNA</td></tr><tr><td>血液ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>は、任意のメーカーで代用することができます</td></tr><tr><td>大腸菌DH5alpha コンピテントセル</td><td>Thermo Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior</td><td>MerckMillipore</td><td>50615</td><td>任意のFBSを使用することができます</td></tr><tr><td>FlowJo v10.5.3</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td>任意のフローサイトメトリーソフトウェア FBSは使用することができます</td></tr><tr><td>ゲルローディング染料、パープル(6X)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024</td><td>任意の6倍ローディング色素を細胞HEK293T置換可能</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>11268</td><td>これらの細胞は、サルウイルス40(SV40)の大きなT抗原を構成的に発現し、クローン17は、その高いトランスフェクタビリティのために特別に選択された。</td></tr><tr><td>HERAcell&reg; 240i CO2インキュベーター</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td>は、どのメーカーでも代用可能</td></tr><tr><td>HotStar PCRキット</td><td>Qiagen</td><td>203203</td><td></td></tr><tr><td>Intas ゲルドキュメンテーションシステム</td><td>Intas</td><td></td><td>アガロースゲルを含む染色DNAの任意の視覚化システムを使用可能</td></tr><tr><td>低メルトアガロー</td>ス<td>バイオザイム</td><td>850081</td><td>、どのメーカー</td></tr><tr>でも代用可能<td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985070</td><td>は、</td></tr><tr>BKPyV株Dunlopの完全長ゲノムを有する<td>任意の製造業者pBKV(34-2)</td><td>ATCC</td><td>45025</td>プラスミドで置換可能<td>であり、ポジティブコントロールとして使用した。DNA Seq.Acc.: KP412983</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>PCR Cycler MJ Mini 48-Well Personal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>生産終了品</td><td>任意のサーモサイクラーを使用可能</td></tr><tr><td>PCRヌクレオチドミックス、10 mM</td><td>Promega</td> <td>#C1145</td><td></td></tr><tr><td>PCR1およびPCR2プライマー</td><td>メタビオン</td><td>は適用されません</td><td>脱塩。(10 &micro;M) PCR グレードの水</td></tr><tr><td>PenStrep (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>は、任意のメーカーで代用できます</td></tr><tr><td>Roti&reg;-GelStain</td><td>Carl Roth</td><td>3865</td><td>dsDNA 濃度を測定するための蛍光ベースの染色</td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133</td><td></td></tr><tr><td>T4-DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TransIT LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR2300</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン 0.05% - EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>は、任意のメーカーで代用可能</td></tr><tr><td>ZymoPURE II プラスミドキット</td><td>Zymo</td><td>D4201</td><td>は、任意のメーカーで代用することができます</td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーによるbkポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性の測定

Measurement of BK-polyomavirus Non-Coding Control Region Driven Transcriptional Activity Via Flow Cytometry

BK-ポリオマウイルス(BKPyV)のようなポリオマウイルスは、免疫不全患者に重篤な病理を引き起こす可能性がある。しかし、現在、非常に効果的な抗ウイルス剤は入手できないため、潜在的な抗ウイルス剤の影響を測定する方法が求められている。ここでは、BKPyV非コード制御領域(NCCR)の早期および後期プロモーター活性の分析を可能にする二重蛍光レポーターを構築し、tdTomatoおよびeGFPを介してウイルス遺伝子発現に対する潜在的な抗ウイルス薬の影響を定量化した。式。また、このプロトコルで例示的に得られたBKPyV-NCCRアンプリコンをクローニングすることにより、免疫不全の腎移植患者の血液由来DNAから得られ、NCCR再配列がウイルス遺伝子発現に及ぼす影響を判定することができる。患者由来アンプリコンのクローニング後、HEK293T細胞をレポータープラスミドでトランスフェクトし、潜在的な抗ウイルス剤で治療した。続いて、細胞を平均蛍光強度72hポストトランスフェクションを測定するためのFACS分析を行った。また、潜在的な細胞周期阻害効果を有する薬物の分析をテストするために、トランスフェクトのみ、したがって蛍光細胞が使用される。このアッセイは大きなT抗原発現細胞で行われるので、早期発現と後期発現の影響を相互に独立した方法で分析することができる。

この代表的な実験では、BK-ポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性をフローサイトメトリーを介して測定した。さらに、BKPyV再活性化後の患者の治療に使用される可能性のあるmTOR阻害剤を、ウイルス早期遺伝子発現の阻害について試験した。この目的のために、二重蛍光レポーターアッセイは、以前に公表された5として使用された。実験セットアップの全体的なワークフロースキームは、F igure 1に示されています。まず、免疫不全の腎移植患者からの血液サンプルを、制度倫理委員会の承認を受けたヒト研究のガイドラインに従って採取した。血液はEDTA含有チューブで採取され、相は遠心分離によって分離された。続いて、400μLの血漿をポリオマウイルスDNAの単離に用いた。非符号化制御領域(NCCR)は、外側のプライマーペアBKV-CR-1fwおよびBKV-CR-1rvを用いて図2Aに示すように入れ子になったPCRプロト...

この原稿では、tdTomatoおよびeGFPを発現する双方向レポータープラスミドをトランスフェクトしたHEK293T細胞を用いてBK-ポリオマウイルス転写活性のFACSベースの測定を行うプロトコルが提示される。この方法はさらに、ウイルス転写に対する新規化合物の影響を定量的に決定することを可能にする。

フローサイトメトリーによるBKポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性の測定

Polyomaviruses, like the BK-polyomavirus (BKPyV), can cause severe pathologies in immunocompromised patients. However, since highly effective antivirals ...

このプロトコルの全体的な目的は、フローサイトメトリーを介して二重蛍光細胞を測定することによってBK-ポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性を測定することである。BK-ポリオマウイルスは、免疫不全患者、特に腎移植レシピエントにおいて重篤な病態を引き起こす可能性がある。しかし、現在、高効率のウイルス対策が利用できないので、他の化合物の潜在的な抗ウイルス影響を測定する方法が必要です。この方法により、ウイルス学者は、非コード制御領域によって駆動されるBK-ポリオマウイルス転写活性に影響を及ぼす潜在的な抗ウイルス剤の影響を分析することができる。このアッセイは、非コード制御領域の典型的な非コード化領域と比較してプロモーター活性に対する再調整の影響をさらに研究することを可能にする。二重蛍光報告を用いてウイルスプロモーター活性を研究する利点は、早期および後期の遺伝子発現を相互に独立した方法で分析できることである。さらに、ウイルスストックや長期感染性細胞培養実験の難しい穿光は、トランスフェクトや蛍光細胞のみが解析されるため、また細胞の生存率や穿光を低下させる薬剤も検討できる。このプロトコルはデュースブルク・エッセン大学の医学部の倫理委員会によって承認された人間の研究のガイドラインに従います.最初のステップは、ポリオマウイルスDNAの単離のための血液サンプルを収集することです。EDTA取得管に血液の少なくとも3ミリリットルを収集します。サンプルを2,500Gで15分間遠心し、プラズマを新しいチューブにピペットします。40マイクロリットルのプロテインSKを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに調製し、ピペット処理で400マイクロリットルのプラズマを加えます。メーカーの説明に記載されているように、DNAブロット抽出キットを使用してDNAを分離します。プライマーペアAを使用して50マイクロリットルの総体積でプリPCR用のマスターミックスを準備し、以前に単離されたDNAを使用します。45マイクロリットルのマスターミックスをPCRチューブに分配します。PCRチューブに5マイクロリットルの単離DNAを加え、表3に示すように反応条件でPCRを実行します。変性アニールと延長を35サイクルで繰り返します。ネストされたアプリケーションの場合は、プライマー ペア B を使用し、クローニング用の制限サイトを収容します。PCR製品の10マイクロリットルを、6倍のゲルローディング染料の2マイクロリットルと混合します。1.5%のアガロースゲルに10マイクロリットルのミックスをロードし、60ミランペアで30分間ゲルを実行します。適切な UV ドキュメント システムを使用してゲルを視覚化します。メーカーの指示に従って PCR 精製キットを使用して PCR アンプアイコンを精製します。37°Cで2時間の指標制限酵素で精製されたアンプリコンを消化します。消化されたアンプリコンを精製するために精製手順を繰り返します。並行して、プラスミド骨格も消化する。0.8%低マウントアガロースゲルで消化プラスミド骨格を分析します。ゲルを40ミリアンペアより高い電流で動かないでください。長波UV光を使用してDNA断片を可視化し、きれいなメスを使用して曲がった背骨を切り取ります。DNA損傷を防ぐため、紫外線の長時間の暴露を避けてください。新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管にフロメルゲル断片の部分のためのフェンス。ゲル片を溶かし、穏やかな渦で2分ごとに混ぜるために、低モードアガロース片を含む背骨を摂氏65度で10分間加熱します。溶融ゲルは、直接ライゲーションに使用することができる。リゲート骨格と16°Cで一晩T4 DNAリガーゼを使用して消化アンプリコン。標準的なクローニング手順の後、血漿DNAを分離する。制限酵素消化を行い、陽性クローンをチェックし、1%アガロースゲル上で消化断片を可視化します。種子100,000 HEK293T細胞は、トランスフェクションの24時間前に12ウェルプレートのウェルあたり、摂氏37度で一晩インキュベートし、トランスフェクション中に活性な増殖を維持する。細胞はトランスフェクション時に約80%のコンフルエンシーである必要があります。250マイクロリットルの減らされた血清培地を無菌チューブに入れ、報告された各血漿DNAのマイクログラムを1マイクログラム加え、ピペットで穏やかに混ぜます。トランスフェクション試薬の3マイクロリットルをDNA混合物に加え、ピペット処理で穏やかに混ぜ、摂氏22度で15分間インキュベートします。混合物を加え、井戸に落とし、井戸にそっと分配します。4時間後、上清を試験剤および溶媒制御を含む新鮮な培地に交換してください。本例では、mTOR阻害剤INK-128およびラパマイシンを用いた。分析まで摂氏37度でインキュベートします。蛍光顕微鏡で細胞の蛍光と緑色を確認します。赤色および緑色蛍光は、BK-ポリオマウイルス遺伝子発現の初期および後期にそれぞれ対応する。トランスフェクション後72時間、上清を慎重に熱望する。冷たいPBSの1ミリリットルで細胞を2回洗います。500マイクロリットルのトリプシンを軽く加え、細胞の早期剥離を避けるためにプレートを少し回します。この手順は、セルのダブレットを避けるために重要です。添加後、トリプシンは同じピペットチップで直接除去される。37°Cで少なくとも5分間細胞をインキュベートする。3%FCSを含む1ミリリットルPBSでトリプシンS細胞を再中断し、事前に標識されたFACSチューブに懸濁液を移す。FACS分析の前に1ミリリットルあたり1マイクログラムの濃度でDAPIを追加します。フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。各サンプルについて、少なくとも10,000個の生細胞を測定する。正確な結果を得るためには、赤と緑の信号を区別するためには、初期補償が不可欠です。非コーディング制御リージェントは、クローニングのための制限部位を収容する内側プライマーペアを使用して、ネストされたPCRプロトコルを使用して増幅した。アンプリコン検証はアガロースゲル電気泳動を介して行ったが、ゲル内の均質なサイズ分布における典型的なNCCR配列に由来するアンプリコンは、挿入および欠失を伴う再配置されたNCCCrに由来するもので、その大きさが異なる。NCCRを含む陽性クローンの選択は、制限分析によって検証された。小さなスペーサー領域を、陽性クローンを示すより大きなNCCR断片に置き換えた。検証されたクローンから単離されたプラスミドDNAをピロシケンシングのために送った。この例では、Pブロック内の削除とOブロック内の置換が検出されました。HEK293T細胞は、一過性の報告可能な構築物に関する点でトランスフェクトされ、NCCR活性は蛍光顕微鏡でモニタリングした。赤色蛍光と緑色蛍光は、BK-ポリオマウイルス遺伝子発現の初期および後期にそれぞれ対応した。最初のNCCRは強い後期遺伝子発現を示し、2番目の例は比較的強い初期のが、中程度の後期遺伝子発現を有していた。DAPI陰性細胞をゲートし、eGFP対tdTomatoを示すドットプロットを作成した。tdTomatoまたはeGFPの場合にのみ陽性のサンプルと同様に陰性であったサンプルが分析に含まれていた。平均蛍光強度は、各試験クローンから導出された。この例では、二重mTOR阻害剤INK128による治療は、早期発現が阻害されたことを意味するtdTomato MFIを有意に低下させた。この方法は、転写活性を通じてBK-ポリマウイルスを検出するために現在使用されている他の化合物を同定することを可能にする。初期の遺伝子発現では、これはウイルスの意味を決定する。阻害低下は、BK-ポリマウイルス再活性化の場合に免疫不全患者の薬剤として使用されると考えられる。

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Research

JoVE Journal

Genetics

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学ぶ BKポリオマウイルスの非コード制御領域駆動転写活性測定法。HEK293T細胞を用いたフローサイトメトリーによる二重蛍光解析で、抗ウイルス化合物の効果を定量的に評価する手法です。

フローサイトメトリーによるBKポリオマウイルス非コード制御領域駆動転写活性の測定

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