ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ
July 22nd, 2019
細菌は、細菌間の競争に従事するための多様なメカニズムをコードします。ここでは、細菌単離物間の競合相互作用を特徴付け、それらが混合集団の空間構造にどのように影響するかを特徴付ける培養ベースのプロトコルを提示する。
当社のプロトコルは、ビブリオフィシェリ菌の異なる株間の競合メカニズムを同定し、特徴付けるためのシンプルで堅牢なアプローチを提供します。この方法では、異なる抗生物質耐性遺伝子をコードする安定したプラスミドと、混合培養中の各細菌株の差動選択と視覚的識別を可能にする蛍光タンパク質を使用します。まず、無菌の爪楊枝を使用して、米粒の大きさで寒天プレートから細胞を削ります。
1ミリリットルのLBSブロスを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管で細胞を再懸濁する。細胞の塊を分解するには、チューブの側面にそれらを押し込み、ピペットを激しく上下に押し込む。チューブと渦を 1 ~ 2 秒間閉じ、サンプルが視覚的に均一になるまでセルの束が見える場合は繰り返します。
すべてのサンプルについて、細胞の掻き取りから渦までのこれらの準備手順を繰り返します。すべてのサンプルの600ナノメートルで光学密度を測定し、記録します。正確なOD測定を得るために、LBSブロスを使用してサンプルを最大10倍に希釈します。
次に、各サンプルを目的のOD 600に正規化する。1対1の比率で基準株と競合株を混合するには、1〜2秒間標識された1.5ミリリットル遠心管と渦にOD 1.0に正規化された各株の100マイクロリットルを加えます。コントロールとして、参照歪みを、それ自体と渦のタグ付けされたバージョンと同様に混ぜます。
実験の結果を大幅に変えることができるので、正しい開始比率を達成することが重要です。成功を確実にするために、このステップは、特定の細菌種の最適化を必要とするかもしれません。各生物学的複製についてこのステップを繰り返した後、コントロールとして差異タグ付けされた参照株を有する4つの生物学的複製と、差異タグ付けされた参照株および競合株を有する4つの生物学的複製が必要である。
インキュベーション後に蛍光顕微鏡に使用される培養スポットを作るために、各コントロールと実験混合物の10マイクロリットルをLBS寒天を含むペトリプレートに加えます。ベンチでスポットが完全に乾燥した後、24時間摂氏24度でプレートをインキュベートします。実験終了時に各株のコロニー形成単位を定量化するために使用される培養スポットを作るために、各対照および実験混合物の10マイクロリットルを井戸あたり1ミリリットルのLBS寒天を含む24のウェルプレートに加える。
スポットが完全に乾燥した後、5時間摂氏24度でプレートをインキュベートします。開始コインキュベーション混合物の連続希釈を実行するには、96ウェルプレートを90度回転させて8列と12列になるようにします。各行に、ひずみ ID、反復番号、および t 0 から始まる時間をラベル付けします。
各抗生物質プレートが選択している株を特定するために確認しながら、希釈シリーズを見つけるために適切な抗生物質を補充LBS寒天プレートにラベルを付けます。マルチチャンネルピペットを使用して、希釈されていないコインキュベーション混合物の最初のカラムを空のままにして、各ウェルにLBSスープ180マイクロリットルを加えます。200マイクロリットル単一チャネルピペットを使用して、100マイクロリットルのコインキュベーション混合物をチューブから最初のカラムの最初のウェルに移し、その後、チップを捨ててすべてのコインキュベーション混合物について繰り返します。
マルチチャンネルピペットを使用して、20マイクロリットルを列1から列2に移し、ピペットを上下に混ぜます。各希釈のピペット数と一致しながら、各列のヒントを破棄し、繰り返します。最後に、各行には初期混合物の10倍の連続希釈が含まれます。
希釈シリーズの各ウェルから5マイクロリットルを吸引し、基準株を選択するカナマイシン補充LBS寒天プレートにスポットする8つの先端を取り付けたマルチチャンネルピペットを使用してください。このステップを繰り返して、クロラムフェニコール補充プレート上の競合株スポッティングを選択します。スポットが完全に乾燥した後、24°Cのインキュベーターにプレートを置きます。
コインキュベーションスポットと24ウェルプレートを摂氏24度で5時間インキュベートした後、各井戸に1ミリリットルのLBSスープを加えます。すべての細胞が再懸濁されるまで上下にピペット化して再中断し、細胞がすべての反復で再懸濁される活力と一致する。各コインキュベーションスポットが再懸濁されたら、シリアル希釈のための96ウェルプレートとLBS寒天プレートに適切な抗生物質を用意し、以前と同じ方法で希釈を見つけます。
24ウェルプレートのt最終測定のためのシリアル希釈を完了するには、開始イノキュラムの連続希釈に使用されるステップを実行し、以前に行われたLBS寒天プレート上の各希釈をスポットします。原稿に記載されているように、ペトリプレート上のコインキュベーションスポットのイメージングとデータ分析を進めます。実験処理では、基準株および競合株1は、対照処理と一致する実験の開始時および終了時に0.5の割合で存在する。
Log RCI値は、対照処理のために、または基準株が競合株1とインキュベートされたときのゼロと統計的に異ならなかった。これらのデータは、参照株と競合株の間に競合が存在しなかったことを示唆している。対照的に、基準株を競合株2でインキュベートした場合、基準株は最初の0.5の割合から実験終了時の0.01未満の割合に減少した。
さらに、対数RCI値は、基準株を競合株2でインキュベートした場合に0より有意に大きかった。これらのデータは、一緒に、株間の競合を示唆する競合株2の存在下で参照株の割合が減少したことを示す。基準株を競合株1と共にインキュベートした場合、両株のCFUsは5時間にわたって増加し、競合が起こらなかったことを示唆する有意な違いはなかった。
また、対照と統計的に異なっていない約3200%の回収率が観察された。しかし、基準株を競合株2とインキュベートした場合、参照株CFUsは5時間でコントロール中の2つのCFUs株よりも有意に低かった。また、約4%の回収率が制御よりも有意に低く観察された。
全体として、これらのデータは、2つの株がその細胞を殺すことによって参照株を競合したことを示している。この手順で最も重要なステップは、結果に大きな影響を与える可能性がある、正しい開始率を達成することです。
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概要
この記事では、細菌分離株、特にVibrio fischeri間の競争的相互作用を特徴づける培養ベースのプロトコルを紹介します。この方法により、研究者はこれらの相互作用が混合細菌集団の空間構造にどのように影響するかを探ることができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 細菌間の競争
- 細胞培養技術
背景
- 細菌は競争のために様々なメカニズムを使用します。
- これらのメカニズムを理解することで、微生物生態学への洞察が得られます。
- 相互作用の特徴づけは、個体群動態の研究に役立ちます。
- 発光タンパク質と抗生物質耐性遺伝子が分化に使用されます。
研究目的
- 細菌株間の競争メカニズムを特定すること。
- これらの相互作用が個体群構造に与える影響を評価すること。
- 微生物学の研究者向けに信頼性の高いプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 抗生物質耐性と発光タンパク質をコードする安定したプラスミドの使用。
- アガープレートからの細胞スクレーピングとブロスへの再懸濁。
- 均一な細胞懸濁液を達成するためのボルテックスとピペッティング。
- 混合培養における株の視覚的識別。
主要な結果
- このプロトコルは細菌株を効果的に区別します。
- 競争的相互作用は混合培養設定で特徴づけることができます。
- 個体群の空間構造はこれらの相互作用によって影響を受けます。
- 結果は細菌生態学に関するさらなる研究に情報を提供できます。
結論
- 提示された方法は細菌の競争を研究するために簡単で堅牢です。
- これは細菌間のダイナミクスの理解を向上させます。
- 将来の研究はこれらの知見に基づいて生態学的意味を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This coincubation assay enables biopharma R&D teams to quantitatively assess competitive interactions between bacterial strains, supporting target validation in antimicrobial discovery. By distinguishing bactericidal versus bacteriostatic outcomes and contact-dependent versus diffusible mechanisms, the method provides mechanistic de-risking early in lead identification. The assay’s compatibility with fluorescent tagging and antibiotic selection allows integration into high-throughput screening workflows for prioritizing compounds that modulate interbacterial competition.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying strain-specific competitive outcomes in co-culture.
- Operational Value: Uses dual fluorescent and antibiotic markers for unambiguous discrimination of competing populations without genetic manipulation of native traits.
- Predictive Value: Distinguishes killing from growth inhibition, informing mechanism-of-action classification for antimicrobial candidates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative CFU recovery and spatial imaging data suitable for automation in multi-well formats.
- Reproducibility: Standardized starting ratios and serial dilution protocols ensure consistent quantification across biological replicates.
- Scalability: Compatible with 24-well and 96-well plate formats for dose-response or strain-panel screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports evaluation of antimicrobial candidates in pathogen-competitor co-culture models that mimic niche environments.
- Translational Continuity: Links in vitro competition outcomes to predictive confidence in in vivo efficacy by identifying strains with competitive dominance.
- Risk Mitigation: Identifies false positives where apparent activity stems from competitive exclusion rather than direct antimicrobial action.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, informing lead identification by validating whether observed antimicrobial effects result from direct compound action or altered competitive fitness.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring shifts in strain proportions under competitive pressure, de-risking mechanism-based hypotheses.
- Screening: Outputs CFU counts and fluorescence ratios as quantitative endpoints for hit confirmation and structure-activity relationship studies.
- Analytics: Log RCI calculations provide normalized, statistically comparable metrics for cross-condition benchmarking.
- Translational Research: Enables assessment of whether lead compounds shift competitive balance in favor of desired microbiota, supporting microbiome-modulating therapeutic strategies.
- Enterprise Reuse: Plasmid-based tagging system allows reuse across multiple bacterial species with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in antimicrobial screening by distinguishing direct inhibition from competitive exclusion.
- Operational Value: Employs widely accessible tools (fluorescence microscopy, plate readers, standard antibiotics) minimizing specialized equipment needs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by validating target-mediated effects in ecologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of leads that demonstrate specific competitive modulation over broad cytotoxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, fluorescence microscopy, and CFU quantification techniques.
- Dependent on availability of fluorescent protein and antibiotic resistance plasmids compatible with target strains.
- Necessitates optimization of starting OD ratios for each strain pair to ensure accurate competitive fitness measurements.
- Adaptation to new species may require validation of plasmid stability and antibiotic selection efficacy.
- Practical limitation: Assay duration (5–24 hours) may not capture slow-acting or biofilm-mediated competitive mechanisms.
