ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ

当社のプロトコルは、ビブリオフィシェリ菌の異なる株間の競合メカニズムを同定し、特徴付けるためのシンプルで堅牢なアプローチを提供します。この方法では、異なる抗生物質耐性遺伝子をコードする安定したプラスミドと、混合培養中の各細菌株の差動選択と視覚的識別を可能にする蛍光タンパク質を使用します。まず、無菌の爪楊枝を使用して、米粒の大きさで寒天プレートから細胞を削ります。

1ミリリットルのLBSブロスを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管で細胞を再懸濁する。細胞の塊を分解するには、チューブの側面にそれらを押し込み、ピペットを激しく上下に押し込む。チューブと渦を 1 ~ 2 秒間閉じ、サンプルが視覚的に均一になるまでセルの束が見える場合は繰り返します。

すべてのサンプルについて、細胞の掻き取りから渦までのこれらの準備手順を繰り返します。すべてのサンプルの600ナノメートルで光学密度を測定し、記録します。正確なOD測定を得るために、LBSブロスを使用してサンプルを最大10倍に希釈します。

次に、各サンプルを目的のOD 600に正規化する。1対1の比率で基準株と競合株を混合するには、1〜2秒間標識された1.5ミリリットル遠心管と渦にOD 1.0に正規化された各株の100マイクロリットルを加えます。コントロールとして、参照歪みを、それ自体と渦のタグ付けされたバージョンと同様に混ぜます。

実験の結果を大幅に変えることができるので、正しい開始比率を達成することが重要です。成功を確実にするために、このステップは、特定の細菌種の最適化を必要とするかもしれません。各生物学的複製についてこのステップを繰り返した後、コントロールとして差異タグ付けされた参照株を有する4つの生物学的複製と、差異タグ付けされた参照株および競合株を有する4つの生物学的複製が必要である。

インキュベーション後に蛍光顕微鏡に使用される培養スポットを作るために、各コントロールと実験混合物の10マイクロリットルをLBS寒天を含むペトリプレートに加えます。ベンチでスポットが完全に乾燥した後、24時間摂氏24度でプレートをインキュベートします。実験終了時に各株のコロニー形成単位を定量化するために使用される培養スポットを作るために、各対照および実験混合物の10マイクロリットルを井戸あたり1ミリリットルのLBS寒天を含む24のウェルプレートに加える。

スポットが完全に乾燥した後、5時間摂氏24度でプレートをインキュベートします。開始コインキュベーション混合物の連続希釈を実行するには、96ウェルプレートを90度回転させて8列と12列になるようにします。各行に、ひずみ ID、反復番号、および t 0 から始まる時間をラベル付けします。

各抗生物質プレートが選択している株を特定するために確認しながら、希釈シリーズを見つけるために適切な抗生物質を補充LBS寒天プレートにラベルを付けます。マルチチャンネルピペットを使用して、希釈されていないコインキュベーション混合物の最初のカラムを空のままにして、各ウェルにLBSスープ180マイクロリットルを加えます。200マイクロリットル単一チャネルピペットを使用して、100マイクロリットルのコインキュベーション混合物をチューブから最初のカラムの最初のウェルに移し、その後、チップを捨ててすべてのコインキュベーション混合物について繰り返します。

マルチチャンネルピペットを使用して、20マイクロリットルを列1から列2に移し、ピペットを上下に混ぜます。各希釈のピペット数と一致しながら、各列のヒントを破棄し、繰り返します。最後に、各行には初期混合物の10倍の連続希釈が含まれます。

希釈シリーズの各ウェルから5マイクロリットルを吸引し、基準株を選択するカナマイシン補充LBS寒天プレートにスポットする8つの先端を取り付けたマルチチャンネルピペットを使用してください。このステップを繰り返して、クロラムフェニコール補充プレート上の競合株スポッティングを選択します。スポットが完全に乾燥した後、24°Cのインキュベーターにプレートを置きます。

コインキュベーションスポットと24ウェルプレートを摂氏24度で5時間インキュベートした後、各井戸に1ミリリットルのLBSスープを加えます。すべての細胞が再懸濁されるまで上下にピペット化して再中断し、細胞がすべての反復で再懸濁される活力と一致する。各コインキュベーションスポットが再懸濁されたら、シリアル希釈のための96ウェルプレートとLBS寒天プレートに適切な抗生物質を用意し、以前と同じ方法で希釈を見つけます。

24ウェルプレートのt最終測定のためのシリアル希釈を完了するには、開始イノキュラムの連続希釈に使用されるステップを実行し、以前に行われたLBS寒天プレート上の各希釈をスポットします。原稿に記載されているように、ペトリプレート上のコインキュベーションスポットのイメージングとデータ分析を進めます。実験処理では、基準株および競合株1は、対照処理と一致する実験の開始時および終了時に0.5の割合で存在する。

Log RCI値は、対照処理のために、または基準株が競合株1とインキュベートされたときのゼロと統計的に異ならなかった。これらのデータは、参照株と競合株の間に競合が存在しなかったことを示唆している。対照的に、基準株を競合株2でインキュベートした場合、基準株は最初の0.5の割合から実験終了時の0.01未満の割合に減少した。

さらに、対数RCI値は、基準株を競合株2でインキュベートした場合に0より有意に大きかった。これらのデータは、一緒に、株間の競合を示唆する競合株2の存在下で参照株の割合が減少したことを示す。基準株を競合株1と共にインキュベートした場合、両株のCFUsは5時間にわたって増加し、競合が起こらなかったことを示唆する有意な違いはなかった。

また、対照と統計的に異なっていない約3200%の回収率が観察された。しかし、基準株を競合株2とインキュベートした場合、参照株CFUsは5時間でコントロール中の2つのCFUs株よりも有意に低かった。また、約4%の回収率が制御よりも有意に低く観察された。

全体として、これらのデータは、2つの株がその細胞を殺すことによって参照株を競合したことを示している。この手順で最も重要なステップは、結果に大きな影響を与える可能性がある、正しい開始率を達成することです。