Name: 円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学ぶ 円形RNA生成プロトコル。Alu要素を含むレポーター遺伝子のクローニング、細胞へのトランスフェクション、RT-PCRによる解析手法を用い、選択的スプライシングと疾患関連性を研究する分子生物学の有力ツールです。

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この作業は、国防総省 DoD 助成金 AZ180075 によってサポートされました。ステファン・スタムはジャクリーン・ヌーナン基金に感謝します。アンナ・パウエルは、ドイツの学術交流プログラムであるDAADの支援を受け、ジャスティン・R・ウェルデンはケンタッキー大学マックス・ステックラー賞を受賞しました。

<ol><li>Jeck, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNAs+are+abundant%2C+conserved%2C+and+associated+with+ALU+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats.</a> RNA. 19 (2), 141-157 (2013).</li>
<li>Zhang, X. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+sequence-mediated+exon+circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Complementary sequence-mediated exon circularization.</a> Cell. 159 (1), 134-147 (2014).</li>
<li>Deininger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alu+elements%3A+know+the+SINEs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Alu elements: know the SINEs.</a> Genome Biology. 12 (12), 236(2011).</li>
<li>Bazak, L., Levanon, E. Y., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Alu+editability%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Alu editability.</a> Nucleic Acids Research. 42 (11), 6876-6884 (2014).</li>
<li>Levanon, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+abundant+A-to-I+editing+sites+in+the+human+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of abundant A-to-I editing sites in the human transcriptome.</a> Nature Biotechnology. 22 (8), 1001-1005 (2004).</li>
<li>Hansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+RNA+circles+function+as+efficient+microRNA+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges.</a> Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).</li>
<li>Kelly, S., Greenman, C., Cook, P. R., Papantonis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+Skipping+Is+Correlated+with+Exon+Circularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon Skipping Is Correlated with Exon Circularization.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (15), 2414-2417 (2015).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon-intron+circular+RNAs+regulate+transcription+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+translation+of+circular+RNAs+driven+by+N%286%29-methyladenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Extensive translation of circular RNAs driven by N(6)-methyladenosine.</a> Cell Research. 27 (6), 626-641 (2017).</li>
<li>Abe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+Circle+Translation+of+Circular+RNA+in+Living+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rolling Circle Translation of Circular RNA in Living Human Cells.</a> Scientific Reports. 5, 16435(2015).</li>
<li>Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type+specific+features+of+circular+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-type specific features of circular RNA expression.</a> PLOS Genetics. 9 (9), 1003777(2013).</li>
<li>Ottesen, E. W., Luo, D., Seo, J., Singh, N. N., Singh, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Survival+Motor+Neuron+genes+generate+a+vast+repertoire+of+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Human Survival Motor Neuron genes generate a vast repertoire of circular RNAs.</a> Nucleic Acids Research. 47 (6), 2884-2905 (2019).</li>
<li>Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+minigene+approach+to+analyze+tissue-specific+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing.</a> Brain Research Protocols. 4, 383-394 (1999).</li>
<li>Mardon, H. J., Sebastio, G., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+exon+sequences+in+alternative+splicing+of+the+human+fibronectin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A role for exon sequences in alternative splicing of the human fibronectin gene.</a> Nucleic Acids Research. 15, 7725-7733 (1987).</li>
<li>Gaildrat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+splicing+reporter+minigene+assay+to+evaluate+the+effect+on+splicing+of+unclassified+genetic+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of splicing reporter minigene assay to evaluate the effect on splicing of unclassified genetic variants.</a> Methods in Molecular Biology. 653, 249-257 (2010).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37 (4), 331-340 (2005).</li>
<li>Baralle, D., Baralle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+in+action%3A+assessing+disease+causing+sequence+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Splicing in action: assessing disease causing sequence changes.</a> Journal of Medical Genetics. 42 (10), 737-748 (2005).</li>
<li>Percifield, R., Murphy, D., Stoilov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+throughput+analysis+of+alternative+splicing+by+fluorescently+labeled+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Medium throughput analysis of alternative splicing by fluorescently labeled RT-PCR.</a> Methods in Molecular Biology. 1126, 299-313 (2014).</li>
<li>Stoilov, P., Lin, C. H., Damoiseaux, R., Nikolic, J., Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screening+strategy+identifies+cardiotonic+steroids+as+alternative+splicing+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screening strategy identifies cardiotonic steroids as alternative splicing modulators.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11218-11223 (2008).</li>
<li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrvinium+pamoate+changes+alternative+splicing+of+the+serotonin+receptor+2C+by+influencing+its+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Pyrvinium pamoate changes alternative splicing of the serotonin receptor 2C by influencing its RNA structure.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), 3819-3832 (2013).</li>
<li>Noto, J. J., Schmidt, C. A., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+expressing+circular+RNAs+via+tRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Engineering and expressing circular RNAs via tRNA splicing.</a> RNA Biology. , 1-7 (2017).</li>
<li>Schmidt, C. A., Noto, J. J., Filonov, G. S., Matera, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Expressing+and+Imaging+Abundant%2C+Stable%2C+Circular+RNAs+In+Vivo+Using+tRNA+Splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A Method for Expressing and Imaging Abundant, Stable, Circular RNAs In Vivo Using tRNA Splicing.</a> Methods in Enzymology. 572, 215-236 (2016).</li>
<li>Welden, J. R., van Doorn, J., Nelson, P. T., Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+MAPT+locus+generates+circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The human MAPT locus generates circular RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , 2753-2760 (2018).</li>
<li>Casper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+2018+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: 2018 update.</a> Nucleic Acids Research. 46, 762-769 (2018).</li>
<li>Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+plasmid+vectors+expressing+FLAG-tagged+proteins+under+the+regulation+of+human+elongation+factor-1alpha+promoter+using+Gibson+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of plasmid vectors expressing FLAG-tagged proteins under the regulation of human elongation factor-1alpha promoter using Gibson assembly.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
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<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
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<li>Suzuki, H., Tsukahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+pre-mRNA+splicing+from+RNase+R+resistant+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 9331-9342 (2014).</li>
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<li>Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+backsplicing+produces+translatable+circular+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs.</a> RNA. 21 (2), 172-179 (2015).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+GFP-Based+Reporter+to+Study+Back+Splicing+and+Translation+of+Circular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+profiling+reveals+an+abundant+circHIPK3+that+regulates+cell+growth+by+sponging+multiple+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11215(2016).</li>
<li>Jia, W., Xu, B., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+expression+profiles+of+mouse+ovaries+during+postnatal+development+and+the+function+of+circular+RNA+epidermal+growth+factor+receptor+in+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells.</a> Metabolism. 85, 192-204 (2018).</li>
<li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Output+of+Protein-Coding+Genes+Shifts+to+Circular+RNAs+When+the+Pre-mRNA+Processing+Machinery+Is+Limiting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting.</a> Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).</li>
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<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+circRNA+Biogenesis+and+Function+with+NF90%2FNF110+in+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection.</a> Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biogenesis+of+Nascent+Circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Biogenesis of Nascent Circular RNAs.</a> Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).</li>
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開示するものは何もありません。

一般に、円形RNAは、その機能と形成の研究を複雑にする1の豊富な低い存在です。リニアRNA13と同様に、レポーターミニ遺伝子を使用することで、円形RNAの形成を調節するシスおよびトランス作用因子の同定が可能となる。したがって、このアプローチは、内因性遺伝子を用いてさらに試験することができる仮説を生成する。
最も重要なステップは、レポーター遺伝子の設計です。DNA断片の酵素的集合体(「ギブソンクローニング」27)は、制限部位から独立した大規模なレポーター遺伝子の構築を可能にするため、この設計を容易にする。
バックスプライシング部位は、レポーター遺伝子構築で考慮されるべき横向きの反転繰り返しを通じてまとめられる。繰り返しはゲノムブラウザの「リピートトラック」にアコードされ、それらを選択するとその向きを示します。タンパク質はまた、円RNA発現28</sup...

円形のRNA 円形RNA(circRNA)は、ほとんどの生物で発現される共有閉鎖単一鎖RNAである。これらは、ダウンストリームの 5' スプライス サイトをアップストリーム 3' スプライス サイトに結合することによって生成されます。30-40 ntと短い相補的な塩基を示すプレmRNA中の配列は、circRNA形成2のための適切なアライメントにバックスプライス部位を持ち込む。ヒトにおいて、Alu要素1は、ゲノム3の約11%を表し、自己相補性4、5によるmRNA前に広範な二本鎖RNA構造を形成し、circRNA1の形成を促進する。
現在、circRNAの3つの主要な機能が説明されている。いくつかのcircRNAはマイクロRNA(miRNA)を結合し、隔離を通じてmiRNAスポンジ6のように作用する。CircRNAは、転写および転写後の調節に関与しており、線形スプライシング7または転写因子活性の変調との競合を通じて8.最後に、circRNAは短いオープンリーディングフレームを含み、原理研究の証明は、それらが9、10を翻訳できることを示しています。しかし、ほとんどのcircRNAの機能は謎のままです。循環RNAの大部分は、次世代シーケンシング方法11を使用して検出された。標的RT-PCR法を用いた個々の遺伝子の詳細な分析により、多数の円形RNAが未発見のまま12が発見される。
レポーター遺伝子を用い、mRNA前処理を解析 細胞にトランスフェクトされたDNAレポーター構築物由来のmRNAの分析は、円形RNAに適用できる代替プレmRNAスプライシングを研究するための確立された方法です。一般に、代替エキソン、その周囲のイントロン、および構成エキソンは、真核生物発現ベクターに増幅およびクローン化される。多くの場合、イントロンは短くされます。この構成体は真核細胞にトランスフェクトされ、通常RT-PCR13,14によって分析される。このアプローチは、共トランスフェクション実験13、15、16、17、18における規制スプライス部位とトランス作用因子をマッピングするために広く使用されています。また、タンパク質発現ミニ遺伝子の生成により、代替スプライシングを変化させる物質のスクリーニングが可能な19,20.
このメソッドは、円形のRNAに適用されています。現在、少なくとも12個のミニジーン・バックボーンが文献に記載されており、表1に要約されている。tRNAベースの発現系21,22を除き、それらはすべてポリメラーゼIIプロモーターに依存する。ここでは、円形RNAの生成に関与するシスおよびトランス作用因子を決定するヒトレポーターミニ遺伝子を生成する方法について述べる。公開されたレポーター遺伝子23の配列を用いた方法の概要を図1に示す。

<table><tbody><tr><td>(PEI) 塩酸塩</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>ビルダー ツール</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator.</td><td>クレア・ケミカル・リサーチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵素DNAアセンブリキット</td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td></td></tr><tr><td>ゲルおよびPCRクリーンアップキット</td><td>プロメガ</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>グリコブルー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 クローニング部位</td><td>ポリクローニング部位</td><td></td><td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf" target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td></tr><tr><td>ポリメラーゼ 1</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Q5 DNA ポリメラ</td></tr><tr><td>ーゼ ポリメラーゼ 2</td><td>Biorad</td><td>1725310</td><td>長距離ポリメラーゼ (NEB)、iproof (BioRad)</td></tr><tr><td>ポリメラーゼ 2</td><td>Qiagen</td><td>206402</td><td>Qiagen 長距離ポリメラーゼキット</td></tr><tr><td>逆転写酵素</td><td>サーモフィッシャー</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>RNA単離キット</td><td>Life Technologies</td><td>12183025</td><td>Ambion by Life Technologies</td></tr><tr><td>RNAse R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td>Epicenter/Lucigen</td></tr><tr><td>安定コンピテントセル</td><td>NEB</td><td>C3040H</td><td>NEB 安定細胞</td></tr><tr><td>スタンダードクローニング細菌</td><td>NEB</td><td>C2988J</td><td>NEB5-alpha プライ</td></tr><tr><td>マーを設計するための</td>コンピテントウェブツール <td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a</td></tr><tr><td>>Web ベースの温度計算</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main" target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td></tr></tbody></table>

円形rna解析に対する小遺伝子を含むalu要素の使用

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

線形mRNAに加えて、多くの真核生物遺伝子は円形RNAを生成する。ほとんどの円形RNAは、5'スプライスサイトをmRNA前mRNA内の上流3'スプライスサイトと結合することによって生成されます。この循環は、スプライス部位を近接するmRNA前の二次構造によって助けとなる可能性が高い。ヒト遺伝子では、Alu元素が豊富であり、mRNA前に反対方向に存在する場合に塩基相補性を示すため、Alu元素はこれらの二次RNA構造を促進すると考えられている。ここでは、円形RNAを形成するレポーター遺伝子を含む大きなAlu要素の生成と解析について述べる。クローニングプロトコルの最適化により、最大20kbの挿入長を持つレポーター遺伝子を生成できます。共同トランスフェクション実験での分析により、調節因子の同定が可能になります。これにより、この方法は、円形RNA形成に関与するRNA配列および細胞成分を同定することができる。

レポーター遺伝子は、円形RNA形成に影響を与える調節因子の決定を可能にする。しかし、これらのレポーター遺伝子は大きく、DNA構築を不安定にすることが多い反復的な要素を含んでいます。大きなサイズのため、エキソンを含むゲノム部分と小さな横向きのイントロニック部品を増幅することによって達成されるイントロンの一部を削除することがしばしば必要です。これらのDNA片は酵素的に組み立てられ、制限酵素なしで構築することができます。
微小管関連タンパク質タウ(MAPT)から生成された円形RNAの例は、円形RNAを分析するためのミニジーンアプローチの応用を示す。この例で使用したtau 9→12ミニジーンを異なるスプライシング因子で共にトランスフェクションし、これらのスプライシング因子の効果をRT-PCRで検出した(図6)。異なるトランス作用因子は、円形RNAと線形プレmRNA形成の両方に影響を与えます。実験はまた、円形RNA形成に必要なすべての配列要素がクローン化された断片に局在していることを示している。
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円形RNAを生成するレポーター遺伝子のクローン化と解析を行います。これらのレポーター遺伝子は、線形スプライシングを解析する構築物よりも大きく、Alu要素を含んでいます。円形RNAを調べるため、細胞にトランスフェクトされ、リニアRNAを除去した後にRT-PCRを用いてRNAを解析します。

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

このプロトコルは、ユーザーが代替スプライシングを受けることができるゲノム発現システムを生成することを可能にし、この場合、その機能および疾患関連についてテストすることができる円形のRNAを形成するので、重要である。この技術の主な利点は、円形RNA形成および機能における代替スプライシングを研究する際に、他の人がこのプロトコルを分子生物学およびクローニングに使用する道を開くということです。このテクニックを初めて試してみる人に対する私のアドバイスは、PCR条件を最適化することです。勾配を実行するか、異なるアニーリング温度と延長時間でタッチダウン PCR を実行します。通常、6 KB 以上の長いフラグメントは、サイクルごとに 1 KB を拡張し、最適な増幅のために異なるアニーリング温度をテストする必要があります。この方法のデモンストレーションは、ユーザーに、特にプライマーの生成の手順のより困難な側面のより良い視覚的表現を与えるので、重要です。この手順を開始するには、UCSCゲノムブラウザをロードし、円形RNA形成に必要な反復要素を同定し、それらを構築物に組み込みます。重要なことに、増幅用のプライマーは反復要素の外側にある必要があります。円形RNA配列をヒトBLAT探索に貼り付け、適切な生物を選択します。シーケンスを送信し、ブラウザビューに移動し、1.5タイマーまたは適切なズームアウトします。次に、繰り返し要素の上にマウスを移動し、フローティング ウィンドウでサブタイプを識別します。Alu 要素は、ラインの中にあります。誤った画像が得られた場合にブラウザをリセットするには、ウィンドウの下にあるデフォルトのトラックボタンを使用します。まず、USCSゲノムブラウザの一番上の行にあるDNAを見て、ウィンドウに示されているDNA配列をダウンロードします。シーケンスの書式設定オプションで、拡張ケース/カラーオプションを選択します。デフォルトケースを低い値として選択し、NCBI RefSeq のトグルケースを選択します。リピートMaskerで下線と太字と斜体を選択します。[送信] をクリックします。大文字としてエキソン、小文字としてイントロンがあります。エキソン/イントロンの境界線を確認してください。ブラウザが逆補数を表示する場合は、正しいエキソン/イントロンの境界線が表示されるまで戻って、逆の補数ボックスを選択します。次に、正しい向きのファイルをワープロドキュメントにコピーし、エキソンをハイライト表示します。増幅する断片を選択して、イントロンが繰り返しの領域で始まらないようにし、これらの領域のプライマーが特定の配列を増幅しないようにします。まず、Web ツールを使用して、クローニング用のプライマーを設計します。ベクター配列については、挿入部位を最後のヌクレオチドとして追加し、その

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

（LAM）-PCR媒介線形増幅は、ゲノムにウイルスベクターを統合の正確な位置を特定するために開発された方法である。技術などの遺伝子治療患者におけるクローン性のダイナミクスを研究するための優れた方法、新規ベクター技術のバイオセーフティ、T細胞の多様性、癌幹細胞モデルであるように進化している...

線形増幅媒介のPCR  - 不明隣接するDNAの遺伝的要素と特性の局在

エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

この論文は、染色体外環状DNA（eccDNA）を精製するためのCircle-Seqと呼ばれる高感度な方法を紹介しています。この方法には、カラム精製、残存する直鎖状染色体DNAの除去、ローリングサークル増幅、ハイスループットシーケンシングが含まれます。Circle-Seqは、真核生物のeccDNAのゲノムスケールのスクリーニングや、ゲノムの不安定性やコピー数多型の研究に応用できます。...

真核細胞から体外の環状DNAのゲノムワイドな精製

(3' レース) の cDNA の端の 2 つ異なる 3' 急速な拡大はプロトコル説明ここで作るのオープンリーディング フレーム (ORF)、停止コドンと全体 3' UTR の RNA を使ってセグメントを含むシーケンスにマップする 2 つの異なる DNA...

適応 3' CDNA の急速な拡大は、がんの成績証明書をマップする終了します。

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々...

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

遺伝子および調節配列の物理的な相互作用の同定が困難な染色体構造をキャプチャする方法によって促進されています。これは 4 C seq プロトコルを修正は PCR テンプレートが過大に増幅を最小限に抑えることによって PCR バイアスを軽減、追加制限の酵素のダイジェスト ステップを組み込むことによって読み取りの mappability...

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

円形RNA(circRNA)は、タンパク質間の転写調節および媒介相互作用に役割を有し得る非コードRNAである。circRNAシーケンシングライブラリの構築のための異なるパラメータの評価に続いて、RNase...

RNA シーケンシングを使用した円形 RNA の同定

このプロトコルは、化学療法治療後の代替スプライシング調節において特徴のない機能を有するタンパク質の役割を評価するための迅速かつ有用なツールを提示する。...

E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究

Absolute quantification RNA Sequencing (AQRNA-seq) は、生物学的混合物中のすべての低分子 RNA の状況を定量するために開発された技術です。ここでは、AQRNA-seqのライブラリー調製とデータ処理の両方のステップを実証し、飢餓誘発性休眠中の Mycobacterium bovis...

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

DNAzymeベースのナノマシンは、核酸の高選択性と高感度な検出に使用できます。この記事では、フリーソフトウェアを使用した10-23コアのDNAzymeベースのナノマシンの設計に関する詳細なプロトコルと、例としてEpstein-Barrウイルスフラグメントの検出におけるそれらのアプリケーションについて説明します。...

DNAzyme 10-23 - 核酸認識用ナノマシン

学ぶ 円形RNA生成プロトコル。Alu要素を含むレポーター遺伝子のクローニング、細胞へのトランスフェクション、RT-PCRによる解析手法を用い、選択的スプライシングと疾患関連性を研究する分子生物学の有力ツールです。

円形RNA解析に対する小遺伝子を含むAlu要素の使用

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