明確に定義されたせん断応力下の単一細胞イオン電流の電気生理学的記録

このプロトコルの目的は、せん断応力によるメカノ感受性イオンチャネルのリアルタイム活性化を調査する上で使用する改変並列プレートフローチャンバを記述することです。

変更された平行プレートフローチャンバーの使用は、研究者がせん断応力にメカノイ感受性イオンチャネルの機能的応答に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、リアルタイムの調査が容易に組み立てられた、再利用可能な平行プレート流れチャンバ内の活性化イオンチャネルを流すことができるということです。手順を開始するには、ピースCの長方形のスペースの端の周りにシリコーンエラストマー溶液の薄い層を適用し、長方形のカバーガラス、ピースDをエラストマー溶液に直接直接置き、余分なシリコーンエラストマー溶液を完全に覆います。

次に、長方形カバーガラス、ピースFを、ピースEの底部に付着させる手順を繰り返し、シリコーンエラストマー溶液を室温で一晩硬化させる。次に、MPPフローチャンバーを、下のチャンバー、ピースE、ピースC、ピースB、上部にピースAで始まり、各ピースを前の上に順番に配置して組み立てます。次に、各ピースのネジ穴をコーナーに合わせ、MPPフローチャンバーへの流れを管理しながら漏れが発生するのを防ぐために、ピースをしっかりとねじ込みます。

6ウェルプレートに、各ウェルに4〜5、12ミリメートルのカバーガラス円を配置します。単一の細胞が電気生理学的記録のためにアクセスできるように、10%と30%の間の細胞を保存します。続いて、標準的な培養条件下で細胞を2時間以上培養して細胞が接着できるようにし、24時間以内に内皮細胞が平らになり、24時間以上亜調合で播種するとパッチが困難になる。

次に、接着した細胞を含むカバーガラスを6ウェルプレートのウェルから取り出し、PBSで素早くすすぐすすめます。次に、2ミリリットルの電気生理学的BAF溶液を含む35ミリメートルのペトリ皿に細胞を含むカバーガラスを移す。すぐにMPPフローチャンバーに細胞とカバーガラスを転送します。

カバーガラスの円を長方形のカバーガラス、ピースDに移し、MPPフローチャンバーのピースCに付着します。カバーガラスの円とセルを完全に水没させるためにBAF溶液を追加します。続いて、カバーガラスの円をピースDに配置して、セルがピースBのスリット開口部に合わせるようにします。

次に、適当な順序でピースをねじ込むことによりMPP流室を組み立てます。チャンバーを顕微鏡の段階に移し、すぐにBAFの解決器を浸透する。次に、実験のための暗い境界線と明白な核を持つ健康な細胞を特定します。

赤面しているように見えるセルや、他のセルと接触しているセルは避けてください。せん断応力を制御するには、30ミリリットルの段階的なシリンジシリンダーをマイクロボアチューブを取り付けた3方向ルアーロックに接続して重力灌流システムを設定します。次に、両面テープを使用して電気生理学リグを囲むファラデーケージに卒業したシリンダーを取り付けます。

MPPチャンバーにチューブを挿入する前に、シリンジとチューブをBAF溶液で事前に充填してください。次に、MPPフローチャンバーの入口穴にチューブを挿入し、MPPフローチャンバーを真空貯留槽内で除去するような溶液で充填する。チャンバーへの流れを止め、上のマークに卒業したシリンダーを補充します。

所定のシリンジシリンダー高さでチャンバを流れ込んで、ストップウォッチを使用して流量を手動で計算します。シリンジを上げるか下げて流れを変え、この方程式を使用して平行なチャンバのせん断応力を計算します。必要なレベルのせん断応力が見つかるまで、このプロセスを繰り返します。

続いて、接着された細胞を含む組み立てチャンバーを電気生理学リグの顕微鏡段階に移す。そして、BAF溶液で事前充填されたチューブをピースA.の穴に挿入し、チャンバーを満たし、同時に10ミリリットルのBAF溶液で細胞を洗います。目的のパッチ構成が正常に取得されたら、チャネル電流を室温で静浴槽で安定させます。

電流が安定したらすぐに、段階的にせん断を適用し、せん断応力が増加する次のステップの前に増加電流が安定することを可能にする。チャンバーへの流れを止めることによって細胞へのせん断暴露を取り除き、メカノイセンシティブチャネル電流が静的浴中に観察されたベースライン電流に戻ることを可能にする。ここに示されているのは、顕著な線形外向きリーク電流を有する主マウス腸間膜内皮細胞からのKir電流の代表的な生の記録である。

マイナス140~プラス40ミリボルトのランプが400ミリ秒以上のパッチに適用されました。リーク電流は、実際のKirチャネル活動の分析を防止します。リーク電流を差し引くには、まずリーク電流の線形勾配伝導率を計算します。

生データにリーク電流をプロットする生トレース全体の対応する電圧による複数のG傾斜。ラインは、外側の線形リークを正確にオーバーレイする必要があります。次に、プロットされたリーク電流をトレース全体から差し引いて、ピコパラッド当たり直線的な外向き電流がピコアンパー約になるようにし、実際のKir電流を解析することができます。

この手順を試みる際に覚えておくべきことは、細胞が実験のためにアクセスできるように、カバーガラスをチャンバーに適切に配置することです。また、カバースリップがピースDに十分に付着していることを確認し、液体の流れが細胞を含むカバーガラスを破壊しないようにしてください。