Name: マイクロインジェクションを用いたヒトヘラ細胞におけるスプリセオソームsnRNA局在化の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶマイクロインジェクション法を用いたスプリセオソームsnRNAのカハール小体への局在化メカニズム。ヒトHeLa細胞で蛍光標記RNAを追跡し、RNA輸送と細胞内動態の理解に役立つ実験手法を解説します。

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この研究は、チェコ科学財団(18-10035S)、国家サステナビリティプログラムI(LO1419)、制度支援(RVO68378050)、欧州地域開発基金(CZ.02.1.01/0.0.0.0.0/0.0/16_013/0001775)、および助成金によって支援されました。チャールズ大学 (GAUK 134516).我々はさらに、光顕微鏡コア施設、IMG CAS、プラハ、チェコ共和国(助成金によってサポートされている-チェコバイオイメージング - LM2015062)を認めます。

1. マイクロインジェクション用snRNAの調製
<ol><li>次の PCR セットアップを使用して PCR による snRNA の全長または切り捨て/変異バージョンを含む DNA テンプレートを準備する: 60 s の場合は 98 °C、15 s の場合は 98 °C、30 s は 68 °C、1 分間は 72 °C、98 °C は 1 分間、98 °C は 35 倍の場合、および5分間72 °C。</li>
	<li>前方プライマーは、最初に転写されたヌクレオチドのちょうど上流のインビトロ転写のためのプロモーター配列を含んでいなければならない。T7プロモーターとリバースプライマーを含むフォワードプライマーを用いてU2 snRNA配列を増幅し、最後に転写されたヌクレオチドで終わる(詳細は材料表を参照)。</li>
	<li>T7 RNA ポリメラーゼを含む短い RNA 合成キットを使用して snRNA を合成します(詳細については材料表を参照)。1 mM ATP を追加します。 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP-Alexa488, 1.8 mM トリメチルグアノシンキャップ類似体 (m32,2,7G(5')ppp(5'G), 1 mLのRNA阻害剤と500-700 ngのDNAテンプレートの一晩の反応で°7.</li>
	<li>反応にDNaseの1 μL(2U)を加え、37°Cでさらに15分間インキュベートします。</li>
	<li>酸性フェノール/クロロホルム抽出によりsnRNAを単離する。トップ水位相を取り除き、3M酢酸ナトリウム(pH= 5.2)の元の体積の1/10、より良いペレット可視化のためのグリコーゲンの3 μL、および100%エタノールの2.5ボリュームを追加します。-80 °Cで1時間、遠心分離機を14,000 x gおよび4°Cで10分間インキュベートする。</li>
	<li>70%エタノールでペレットを洗浄し、ヌクレルスフリー水の12 μLに溶解します。通常のRNA収率は約600ng/mLであった。-80 °C.で保存します。</li>
	<li>アガロースゲル電気泳動によるインビトロ転写snRNAの完全性を監視します。</li>
	<li>マイクロインジェクションの前に、10 μg/μLデキストラン-TRITC 70 kDaを含む水中の最終濃度200 ng/mLにRNAを希釈する。</li>
</ol>2. セル
<ol><li>使用前に、1M HClで1M HClでカバースリップを処理し、蒸留水で十分に洗浄し、100%エタノールで保存します。酸性治療は、注射中または注射後の細胞剥離を防ぐために細胞の接着を促進します。注入された細胞の識別を容易にするために、グリッド付きのカバースリップを使用します。</li>
	<li>種子HeLaまたは他の付着細胞は、マイクロインジェクション時に50%の合流性に達する12mmカバースリップ(No.1またはNo.1.5)上のマイクロインジェクションの1日前に。</li>
</ol>3. インジェクション
注:HeLa細胞は、ダルベッコの修飾イーグル培地(D-MEM、フェノール赤および抗生物質を含む4.5g/L D-グルコース)にマイクロ注入された。注射は、無菌針を装備したインジェクターとマイクロマニピュレータを用いて行った(詳細は材料表参照)。顕微鏡/マイクロマニピュレータシステム全体を、顕微鏡とマイクロインジェクターの個々の部分の変動を防ぐために、少なくとも4時間37°Cに予熱しました。
<ol><li>2mLの培養培地を含むペトリ皿(30mm)を中央にカバースリップして顕微鏡のホルダーに入れます。マイクロローダーを使用して、3 μLのsnRNA混合物を針にロードします。ペトリ皿の表面に対して45°のマイクロインジェクターのホルダーに針を取り付けます。</li>
	<li>針を見つけるには、10倍の長距離目的を使用します。まず、インジェクタの速度をCOARSEに設定し、培養剤に触れるまで針を下げます。顕微鏡双眼鏡を使用して、針が培養培地に触れる場所である明るいスポットを見つけます。</li>
	<li>針の先端が観察されるまで顕微鏡を見ながら、針の速度をFINEに変更し、さらに針を下げます。視野の中央に針を移動し、40倍の長距離目標に切り替えます。</li>
	<li>目的を変更した後、セルを選択し、このセルの上に針を移動します。セル接触の圧力と時間を設定します (説明のヒントとトラブルシューティングを参照)。</li>
	<li>針をセルに下ろし、マイクロマニピュレータの下限を設定します。細胞の下に針を動かさないで下さい。</li>
	<li>下限を設定した後、針をセルの上に戻し、インジェクタのジョイスティックのインジェクションボタンを押します。針は、限界が設定された場所に細胞内で自動的に移動し、RNA混合物を注入します。</li>
	<li>仕上げるには、インジェクタのボタンMENUを押し、ホルダーから針を取り外します。次に、インジェクタとマイクロマニピュレータをオフにする前に、インジェクタからチューブを取り外します。</li>
</ol>4. 細胞の固定と染色
<ol><li>マイクロインジェクション後、細胞をCO2インキュベーターに戻し、37°Cで1時間インキュベートする。</li>
	<li>インキュベーション後、リン酸緩衝生理食液(PBS)で細胞を室温で3回すすいで、0.1 M PIPES pH 6.9で4%のパラホルムアルデヒドで20分間固定し、室温PBSで3回洗浄する。snRNA局在度のみを解析する場合は、細胞を水中で簡単にすすいで、DAPIを使用して取り付け媒体に取り付けます。</li>
	<li>追加のタンパク質局在化の場合は、室温で5分間PBSで0.5%トリトン-X100で細胞を透過化します。PBSで3回のリンスの後、一次および二次抗体で細胞をインキュベートし、PBSで最終洗い、水中で短いリンスをした後、DAPIを用いた取り付け媒体に取り付けます。</li>
</ol>5. 顕微鏡検査
<ol><li>取り付け直後に画像を撮影しない場合は、画像化するまでスライドを4°Cに保管してください。</li>
	<li>没入目的(60Xまたは100x/1.4NA)を備えたハイエンド蛍光顕微鏡システムを使用して画像を取得します。</li>
	<li>マイクロ注入された細胞が同定されたら、サンプルあたり200 nm zステップで20zセクションのスタックを収集し、数学的な破壊の対象となる。その後、最大投影または個々のzスタックが提示された。</li>
	<li>蛍光シグナルを定量化するには、コイル免疫染色によって同定されたカジャル体の周りに関心領域(ROI)を描画します。コイル定義ROIにおけるsnRNA信号の強度を測定します。次に、核内にランダムに配置されたROIにおけるsnRNA蛍光の強度を決定し、Cajal体内および核内のRNAシグナルの比率を計算する。</li>
</ol>

<ol><li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li>
<li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li>
<li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+bodies%3A+news+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curentr+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li>
<li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li>
<li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li>
<li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs%3A+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li>
<li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5%27-to-3%27+exonucleolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+U4%2FU6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを用い、核カジャール体へのsnRNA局在化に重要な配列を決定した。標識されたRNAの迅速かつかなり単純な調製(PCRによるDNAテンプレートの調製、インビトロ転写)により、この方法は、様々な配列がRNA局在化にどのように寄与するかの効果的な分析を提供します。比較的短時間で、U2 snRNAの10種類の欠損または置換を分析することができました(参照5とデータは示されていません)。複雑な生体発生経路を持つRNAの場合、このアプローチは成熟に不可欠な配列の試験も可能にします。snRNAの場合、Smリングアセンブリに必要なSm結合配列の欠失は、細胞質7における変異SnRNAの隔離および劣化をもたらす。その他の利点としては、異なるラベル付きの2つのRNAを同時に注入し、その局在化を1つのセル内で直接比較できることが挙まれる。しかし、様々なフルオロクロムがRNAの挙動を変える可能性があるため、各フルオロクロムは二重標識実験の前に個々にテストする必要があります。長さ数百のヌクレオチドのRNAが正常に注入され...

RNAスプライシングは、遺伝子発現における重要なステップの1つであり、スプライセオソームと呼ばれる大きなリボヌクレオタンパク質複合体によって触媒される。合計で、150以上のタンパク質と5つの小さな核RNA(snRNA)がスプライシング経路の異なる段階でスプライセオソームに統合されています。U1、U2、U4、U5、U6 snRNAは、主要なGU-AGイントロンのスプライシングに参加しています。これらのsnRNAは、snRNAを含む予め形成された小さな核リボヌクレオタンパク質粒子(snRNA)としてスプリセオソームに結合し、snRNAに関連する7つのSmタンパク質(またはU6 snRNAに関連するライクSmタンパク質)および各snRNPに特異的な1-12タンパク質を含む。
snNRPsの組み立てには、細胞質および核段階が含まれる。新たに転写されたsnRNAは細胞質にエクスポートされ、7つのSmタンパク質から組み立てられたリングを獲得する。Smリングは、その後、snRNAを核に再インポートするためのシグナルとして機能します。Smタンパク質と関連付けることができない欠陥のあるsnRNAは、細胞質1に保持される。新しくインポートされたsnRAPは、まずSnRNP特異的タンパク質を満たし、その成熟を終えるCajal体内に現れ(参照2、3で確認)。我々は最近、最終的な成熟ステップの阻害がCajal体内の未熟なsnNRRpの隔離をもたらすことを示した4,5.我々は、snRNP特異的タンパク質の添加と活性snRNPの形成を監視する品質管理下にある最終snRNP成熟モデルを提案した。しかし、細胞が正しく組み立てられた成熟粒子と異常な未熟粒子を区別する方法の分子詳細は、依然として不明瞭なままである。
核カジャール体内のsnRNAの標的化と蓄積に不可欠なsnRNA配列を決定するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用することにしました。マイクロインジェクションは、1)合成snRNAを区別するために追加のシーケンスタグを必要としないため、余分なタグ配列を挿入するためのスペースが少ない短いRNAにとって特に重要です。2)それは生体発生のために重要な配列の分析を可能にする。たとえば、Sm シーケンスは Sm リング アセンブリに不可欠であり、核6に再インポートします。snRNAが細胞内で発現されると、Sm配列を欠くsnRNAは細胞質中で分解され、核およびCajal体7に到達しない。しかしながら、Sm配列を持たないSnRNAは、核に直接マイクロ注入することができ、したがって、Cajal体局在化におけるSm配列の潜在的な役割をアッセイする。
ここでは、Cajal本体5にsnRNAを標的にするために必要なsnRNA配列を決定するために適用したマイクロインジェクション法について詳しく説明する。我々は、SmおよびSMN結合部位が一緒に必要であり、SnRNAだけでなく、Cajal本体に様々な短い非コーディングRNAをローカライズするのに十分であることを示した。マイクロインジェクションおよび他の証拠に基づいて、Sm結合部位に組み立てられたSMリングがCajal本体ローカリゼーション信号であることを提案した。

<table><tbody><tr><td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td><td>ThermoFisher</td><td>C11403</td><td>ストック濃度 1 mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>4.5 g&frasl;L D-グルコース、フェノールレッド、抗生物質</td></tr><tr><td>FemtoJet express インジェクター</td><td>エッペンドルフ</td><td>5247000013</td><td></td></tr><tr><td>フェムトチップス II</td><td>エッペンドルフ</td><td>930000043</td><td>マイクロインジェクション 0.5 &micro の針;mインナーと0.7&micro;m 外径</td></tr><tr><td>フルオロモント G with DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9510</td><td>ストック濃度 5 mg/mL</td></tr><tr><td>グリッドガラス カバースリップ</td><td>同上</td><td>10817</td><td>グリッド付きカバースリップ、直接の経験はありません</td></tr><tr><td>InjectMan NI 2 マイクロマニピュレーター</td><td>エッペンドルフ</td><td>5181000017</td><td></td></tr><tr><td>m3-2,2,7G(5')ppp(5')G トリメチルキャップ アナログ</td><td>イエナ・バイオサイエンス</td><td>NU-853-1</td><td>ストック濃度 40 mM</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 転写キット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバー メガネ 12 mm, No. 1</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>111520</td><td>ルーチンワーク用</td></tr><tr><td>顕微鏡カバー メガネ 12 mm, No. 1.5</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>117520</td><td>高解像度</td></tr><tr><td>画像 顕微鏡 DeltaVision</td><td>GE ヘルスケア</td><td></td><td>画像取得用</td></tr><tr><td>顕微鏡 DMI6000</td><td>ライカ</td><td></td><td>マイクロインジェクション用</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 32% 溶液 EMグレード</td><td>EMS</td><td>15714</td><td>PIPESに最終濃度4%まで溶解</td></tr> <tr><td>フェノール:クロロホルム 5:1</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>U2増幅用プライマー:フォワード:5'-TAATACGACT CACTATAGGGATCGCTTCT CGGCCTTTTGG, リバース:5&acute;TGGTG CACCGTTCCTGGAGGT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>T7 rpromoter sequence in italics</td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA polymerase</td><td>BioLab</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>ストック濃度 40 mM</td></tr><tr><td>テトラメチルローダミン イソチオシアネート デキストラン 65-85 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1162</td><td>水に溶解、ストック濃度 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Serva</td><td>37240</td><td>水溶存、原液濃度10%</td></tr></tbody></table>

マイクロインジェクションを用いたヒトヘラ細胞におけるスプリセオソームsnrna局在化の解析

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

スプライセオソームsnRNAの生体発生は、核相と細胞質相の両方を含む複雑なプロセスであり、最後のステップはCajal体と呼ばれる核コンパートメントで起こる。しかし、この亜核構造にsnRNA局在化を指示する配列は、最近まで知られていなかった。カジャール体内のsnRNAの蓄積に重要な配列を決定するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用し、その後細胞内での局在化を行った。まず、SnRNA欠失変異体、インビトロ転写用の合成DNAテンプレート、およびAlexa488と組み合わせたUTPの存在下で転写されたsnRNAを調製した。標識されたsnRNAをTRITCと共役した70kDa-Dextranと混合し、ヒトHeLa細胞の核または細胞質にマイクロ注入した。細胞を1時間固定して固定し、カジャルボディマーカーコイルリンを間接免疫蛍光で可視化し、核または細胞質注射のマーカーとなるsnRNAとデキストランを蛍光顕微鏡で直接観察した。この方法は、様々な配列が細胞内のRNA局在化にどのように影響するかを効率的かつ迅速にテストすることを可能にします。ここでは、Cajal体内へのSnRNAの効率的なローカリゼーションのためのSm結合配列の重要性を示す。

SnRNA局在化とカジャール体内標的におけるSm結合部位の役割を監視するために、T7プロモーターと全長U2 snRNAまたはU2 snRNAを含むDNAテンプレートを調製し、Sm結合部位を形成する7つのヌクレオチド(AUUUUUG)を欠いている。snRNAは、TRITC結合デキストラン-70kDaとインビトロ転写し、単離され、混合された。インビトロ転写snRNAを含む混合物をHeLa細胞の核または細胞質にマイクロ注入した。
核輸入6にはSm結合部位が必要であることが以前に示されている。Sm部位がCajal体蓄積にとっても重要であるかどうかをテストするために、Sm部位を欠くsnRNAを直接核に注入した(図1A)。細胞質への注入は、コントロールとして役立った(図1B)。陽性対照として、全長snRNA(図1C、D)をマイクロ注入した。CO2インキュベーター...

スプライセオソームsnRNAの生体発生は、様々な細胞コンパートメントを含む複雑なプロセスである。ここでは、細胞内での輸送を監視するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用しました。

マイクロインジェクションを用いたヒトヘラ細胞におけるスプリセオソームsnRNA局在化の解析

Biogenesis of spliceosomal snRNAs is a complex process involving both nuclear and cytoplasmic phases and the last step occurs in a nuclear compartment ...

ここでは、蛍光標識RNAのマイクロインジェクションを適用して、カハル体と呼ばれる核構造への短核RNAの局在化に不可欠なRNA配列を検出しました。この手法には、2 つの大きな利点があります。まず、ラベルや追跡が難しい短いRNAに適用できます。第二に、異なる配列の迅速なスクリーニングを可能にし、RNAの局在におけるそれらの役割をテストする。マイクロインジェクションの1日前に、12ミリメートルのカバーリップ上のHeLaまたは他の付着細胞を播種し、マイクロインジェクション時に50%の合流度に達する。まず、準備したカバースリップをペトリ皿の中央に入れ、細胞と2ミリメートルの培養培地を加えます。翌日、細胞充填されたペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。マイクロローダーを使用して、snRNA混合物の3マイクロリットルを針にロードし、ペトリ皿の表面に対して45度の角度でマイクロインジェクターのホルダーに針を取り付けます。針を見つけるために10倍の長距離目的を使用してください。まず、注射器に粗い速度を設定し、それが培養培地に触れるまで針を下げる。顕微鏡双眼鏡を使用して、針が培養培地に触れる場所である明るいスポットを見つける。針の先端が観察されるまで、顕微鏡を見ながら速度を細かくし、さらに針を下げます。視野の中央に針を移動し、40倍の長距離目標に切り替えます。その後、セルを選択し、針をセルの上に移動します。セル接触の圧力と時間を設定します。針を細胞の中に下に移動し、マイクロマニピュレーターの下限を設定します。プロトコルの最も重要な部分は、下限を設定します。カバースリップサーフェスは完璧ではなく、各セルが異なるため、注入セッション中に何度か下限を設定する必要があります。次に、針をセルの上に戻し、インジェクタのジョイスティックの注射ボタンを押します。針は、RNA混合物を注入するために限界が設定されている場所に細胞の中で自動的に移動します。完了するには、インジェクタのメニューボタンを押し、ホルダーから針を取り外します。次に、インジェクタとマイクロマニピュレーターの電源を切る前に、チューブをインジェクタから取り外します。マイクロインジェクション後、細胞を二酸化炭素インキュベーターに戻し、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、室温でPBSで細胞を3回リンスする。pH 6.9で0.1モルパイプに4%パラホルムアルデヒドで20分間細胞を固定します。その後、室温PBSで細胞を3回洗浄します。snRNAの局在のみを分析する場合は、水中の細胞を短時間リンスし、DAPIを使用して取り付け媒体に取り付けます。タンパク質の局在化を追加する場合は、PBSで0.5%トリトンX-100で細胞を室温で5分間透過させます。細胞をPBSで3回リンスし、テキストプロトコルで概説されているように適切な一次および二次抗体でそれらを染色します。その後、PBSで3回すすいで、水に1回リンスします。その後、DAPIを使用して、セルを取り付け媒体に取り付けます。画像を撮影する準備ができたら、浸漬目的を備えたハイエンド蛍光顕微鏡システムを使用して画像を取得します。マイクロインジェクションされた細胞が同定されたら、サンプル当たり200ナノメートルZステップで20Zセクションのスタックを収集し、数学的なデコンボリューションを受けます。蛍光信号を定量化するには、まず ImageJ で顕微鏡画像を開き、チャンネルをウィンドウに分割します。同期ウィンドウ ツールでウィンドウを同期します。次に、コイリン免疫染色によって同定されたカハル体の周囲に関心領域を描く。コイリン定義ROIにおけるsnRNAシグナルの強度を測定します。核内に無作為に配置されたROI中のsnRNA蛍光の強度を決定する。測定値を保存し、カハル体と核内のRNAシグナルの比率を計算します。本研究では、蛍光標識されたsnRNAをマイクロインジェクションして細胞内の輸送を監視する。SM部位がカハル体蓄積にとって重要であるかどうかを検査するために、SM部位を欠いているsnRNAは核に直接マイクロインジェクションされる。細胞質への注入はコントロールとして機能し、一方で全長snRNAは、陽性対照として機能するようにマイクロインジェクションされる。インキュベーション後、マイクロインジェクションされた細胞は固定され、カハル体マーカーコイリンは間接的な免疫蛍光によって可視化される。全長snRNAは、核および細胞質注射の両方後にカハル体に蓄積された。対照的に、SM部位を欠いたsnRNAは、このコンパートメントへのマイクロインジェクション後に細胞質に残り、SM部位を除くsnRNAは、このsnRNAが核内に残っているがカジャール体に蓄積しないため、SM結合配列がカジャール体の局在化にとって重要であることを明らかにした。時には、1つの細胞コンパートメントへのマイクロインジェクションだけが失敗し、Dextran 70キロダルトンは核と細胞質の両方で見つけることができます。これらのセルは、さらなる分析から廃棄されます。蛍光標識されたsnRNAは、注射前に80°Cの負の80度で保存されているにもかかわらず、RNAの分解が起こり得る。細胞質に注入された分解されたsnRNAは核に輸送されず、細胞質に局在し続ける。そのようなsnRNAは廃棄されるべきであり、新しいsnRNAは合成されるべきである。細胞タイプの注入と補償圧力を正しく調整することが重要です。そして、前に述べたように、細胞注入のための正しい下限を設定することは、良好なマイクロインジェクションに不可欠です。RNAの単離中に使用されるフェノールクロロホルムは危険であり、マイクロインジェクションニードルは鋭利な物体であることを覚えておいてください。これらの材料を取り扱う際は注意してください。

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再現性をもって RNA の単一分子蛍光 in-situ 個々 卵母細胞における Mrna の数字をカウントするには、交配 (RNA 魚) 非付着性のセルの最適化を行った。卵子採取、トラン...

マウス卵母細胞における定量化するため、Localize Mrna に単一分子蛍光そのままの交配 (SM 魚) の使用

このプロトコルは、化学療法治療後の代替スプライシング調節において特徴のない機能を有するタンパク質の役割を評価するための迅速かつ有用なツールを提示する。...

E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究

このプロトコルは、スプライシングに対する5'-スプライス部位変異の影響をモニターするためのミニジーンレポーターアッセイを記述し、変異誘発スプライシング阻害のレスキューのためのサプレッサーU1 snRNAを開発する。レポーターおよびサプレッサーU1...

スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ

このプロトコルは、マウス上頸部および星状神経節の解剖、細胞解離、凍結保存、核単離、ハッシュタグバーコーディングなど、単一核シーケンシングのための詳細で低入力のサンプル調製について説明しています。...

単一核RNAシーケンシングのためのマウス交感神経節のバーコード化抗体による低入力核単離および多重化

学ぶマイクロインジェクション法を用いたスプリセオソームsnRNAのカハール小体への局在化メカニズム。ヒトHeLa細胞で蛍光標記RNAを追跡し、RNA輸送と細胞内動態の理解に役立つ実験手法を解説します。

マイクロインジェクションを用いたヒトヘラ細胞におけるスプリセオソームsnRNA局在化の解析

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