マイクロインジェクションを用いたヒトヘラ細胞におけるスプリセオソームsnRNA局在化の解析
August 6th, 2019
スプライセオソームsnRNAの生体発生は、様々な細胞コンパートメントを含む複雑なプロセスである。ここでは、細胞内での輸送を監視するために、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを採用しました。
ここでは、蛍光標識RNAのマイクロインジェクションを適用して、カハル体と呼ばれる核構造への短核RNAの局在化に不可欠なRNA配列を検出しました。この手法には、2 つの大きな利点があります。まず、ラベルや追跡が難しい短いRNAに適用できます。
第二に、異なる配列の迅速なスクリーニングを可能にし、RNAの局在におけるそれらの役割をテストする。マイクロインジェクションの1日前に、12ミリメートルのカバーリップ上のHeLaまたは他の付着細胞を播種し、マイクロインジェクション時に50%の合流度に達する。まず、準備したカバースリップをペトリ皿の中央に入れ、細胞と2ミリメートルの培養培地を加えます。
翌日、細胞充填されたペトリ皿を顕微鏡のステージに置きます。マイクロローダーを使用して、snRNA混合物の3マイクロリットルを針にロードし、ペトリ皿の表面に対して45度の角度でマイクロインジェクターのホルダーに針を取り付けます。針を見つけるために10倍の長距離目的を使用してください。
まず、注射器に粗い速度を設定し、それが培養培地に触れるまで針を下げる。顕微鏡双眼鏡を使用して、針が培養培地に触れる場所である明るいスポットを見つける。針の先端が観察されるまで、顕微鏡を見ながら速度を細かくし、さらに針を下げます。
視野の中央に針を移動し、40倍の長距離目標に切り替えます。その後、セルを選択し、針をセルの上に移動します。セル接触の圧力と時間を設定します。
針を細胞の中に下に移動し、マイクロマニピュレーターの下限を設定します。プロトコルの最も重要な部分は、下限を設定します。カバースリップサーフェスは完璧ではなく、各セルが異なるため、注入セッション中に何度か下限を設定する必要があります。
次に、針をセルの上に戻し、インジェクタのジョイスティックの注射ボタンを押します。針は、RNA混合物を注入するために限界が設定されている場所に細胞の中で自動的に移動します。完了するには、インジェクタのメニューボタンを押し、ホルダーから針を取り外します。
次に、インジェクタとマイクロマニピュレーターの電源を切る前に、チューブをインジェクタから取り外します。マイクロインジェクション後、細胞を二酸化炭素インキュベーターに戻し、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、室温でPBSで細胞を3回リンスする。
pH 6.9で0.1モルパイプに4%パラホルムアルデヒドで20分間細胞を固定します。その後、室温PBSで細胞を3回洗浄します。snRNAの局在のみを分析する場合は、水中の細胞を短時間リンスし、DAPIを使用して取り付け媒体に取り付けます。
タンパク質の局在化を追加する場合は、PBSで0.5%トリトンX-100で細胞を室温で5分間透過させます。細胞をPBSで3回リンスし、テキストプロトコルで概説されているように適切な一次および二次抗体でそれらを染色します。その後、PBSで3回すすいで、水に1回リンスします。
その後、DAPIを使用して、セルを取り付け媒体に取り付けます。画像を撮影する準備ができたら、浸漬目的を備えたハイエンド蛍光顕微鏡システムを使用して画像を取得します。マイクロインジェクションされた細胞が同定されたら、サンプル当たり200ナノメートルZステップで20Zセクションのスタックを収集し、数学的なデコンボリューションを受けます。
蛍光信号を定量化するには、まず ImageJ で顕微鏡画像を開き、チャンネルをウィンドウに分割します。同期ウィンドウ ツールでウィンドウを同期します。次に、コイリン免疫染色によって同定されたカハル体の周囲に関心領域を描く。
コイリン定義ROIにおけるsnRNAシグナルの強度を測定します。核内に無作為に配置されたROI中のsnRNA蛍光の強度を決定する。測定値を保存し、カハル体と核内のRNAシグナルの比率を計算します。
本研究では、蛍光標識されたsnRNAをマイクロインジェクションして細胞内の輸送を監視する。SM部位がカハル体蓄積にとって重要であるかどうかを検査するために、SM部位を欠いているsnRNAは核に直接マイクロインジェクションされる。細胞質への注入はコントロールとして機能し、一方で全長snRNAは、陽性対照として機能するようにマイクロインジェクションされる。
インキュベーション後、マイクロインジェクションされた細胞は固定され、カハル体マーカーコイリンは間接的な免疫蛍光によって可視化される。全長snRNAは、核および細胞質注射の両方後にカハル体に蓄積された。対照的に、SM部位を欠いたsnRNAは、このコンパートメントへのマイクロインジェクション後に細胞質に残り、SM部位を除くsnRNAは、このsnRNAが核内に残っているがカジャール体に蓄積しないため、SM結合配列がカジャール体の局在化にとって重要であることを明らかにした。
時には、1つの細胞コンパートメントへのマイクロインジェクションだけが失敗し、Dextran 70キロダルトンは核と細胞質の両方で見つけることができます。これらのセルは、さらなる分析から廃棄されます。蛍光標識されたsnRNAは、注射前に80°Cの負の80度で保存されているにもかかわらず、RNAの分解が起こり得る。
細胞質に注入された分解されたsnRNAは核に輸送されず、細胞質に局在し続ける。そのようなsnRNAは廃棄されるべきであり、新しいsnRNAは合成されるべきである。細胞タイプの注入と補償圧力を正しく調整することが重要です。
そして、前に述べたように、細胞注入のための正しい下限を設定することは、良好なマイクロインジェクションに不可欠です。RNAの単離中に使用されるフェノールクロロホルムは危険であり、マイクロインジェクションニードルは鋭利な物体であることを覚えておいてください。これらの材料を取り扱う際は注意してください。
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概要
この研究は、蛍光標識されたsnRNAのマイクロインジェクションを利用し、スプライセオソームsnRNAの生合成と細胞内での輸送を調査します。主な生物学的問いは、これらのsnRNAがカハール小体として知られる核構造への局在に焦点を当て、適切な局在化に必要な配列に関する洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 分子生物学
- RNAの局在
背景
- snRNAはスプライシングとRNA処理に重要な役割を果たします。
- それらの局在を理解することで、RNAの機能に関わる細胞メカニズムを解明できます。
- カハール小体はsnRNA処理に関連する亜核構造です。
- マイクロインジェクションにより、生きた細胞内でRNA分子を直接操作し観察できます。
研究目的
- スプライセオソームsnRNAの輸送と局在メカニズムを調査すること。
- snRNA局在を決定する特定のRNA配列の重要性を評価すること。
- 細胞内でのsnRNA分子の追跡のための信頼性の高い方法を開発すること。
使用した方法
- 蛍光標識されたsnRNAを使用したマイクロインジェクション技術が用いられました。
- HeLa細胞がsnRNA局在の研究のための生物学的モデルとして使用されました。
- 正確性と信頼性のために、注入プロセス中にさまざまなコントロールと調整が行われました。
- 細胞は固定され、カハール小体のマーカーを視覚化するために免疫蛍光にかけられました。
- 詳細な分析のために、ImageJを使用して蛍光シグナルの定量化が行われました。
主な結果
- 全長のsnRNAはカハール小体に正常に局在し、適切な蓄積にSM部位が必要であることを確認しました。
- SM部位を持たないsnRNAはカハール小体への局在が不足し、細胞質に残りました。
- コントロール注入は予想されたトラフィッキングパターンを示し、結果の検証に役立ちました。
- マイクロインジェクション方法のインキュベーションと慎重な調整が成功の結果に重要でした。
結論
- この研究は、生きた細胞内でのsnRNAの輸送と局在を調査するための詳細なプロトコルを提供します。
- RNAの局在メカニズムを理解することで、RNAの活性に関連する潜在的な調整経路の解明に役立ちます。
- この研究から得られた洞察は、RNAの機能と細胞組織に関連する幅広い分子生物学研究に貢献する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding spliceosomal snRNA localization into Cajal bodies provides mechanistic insight into RNA processing pathways relevant to target validation in nucleic acid therapeutics. The microinjection-based localization assay enables rapid interrogation of sequence determinants governing subcellular trafficking, supporting early-stage de-risking of RNA-targeted modalities. This approach contributes to predictive confidence in identifying functional RNA elements critical for therapeutic efficacy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates RNA sequence elements that govern subcellular localization, enabling hypothesis testing of functional domains in snRNA.
- Operational Value: Facilitates rapid screening of mutant constructs to identify sequences essential for nuclear body accumulation.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking specific RNA motifs to validated subcellular localization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables quantitative assessment of RNA trafficking via fluorescence intensity ratios in defined subcellular compartments.
- Operational Value: Provides a reusable platform for testing RNA variants with standardized readouts for localization efficiency.
- Assay Readiness: Generates quantitative, imaging-based outputs suitable for hit confirmation in RNA-focused screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system compatibility by using human HeLa cells to model snRNA localization mechanisms.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by defining sequence-function relationships in RNA nuclear trafficking.
- Predictive De-risking: Reduces mechanistic ambiguity in RNA therapeutic design by validating localization-dependent functionality.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling sequence-function analysis prior to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA sequence determinants in subcellular localization and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative fluorescence readouts and reproducible localization metrics.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (Cajal body/nucleoplasm fluorescence ratios) enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use of human cell models and defined localization endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized capability for RNA localization testing applicable across multiple target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of RNA therapeutics by validating sequence-specific localization to functional nuclear compartments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility through controlled microinjection, fixation, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking RNA sequence features to validated subcellular trafficking, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RNA targets based on demonstrated localization competence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, fluorescence microscopy, and ImageJ-based quantification.
- Dependent on microfluidic injection systems, fluorescence microscopes with Z-sectioning capacity, and deconvolution software.
- Necessitates standardization of injection pressure, incubation time, and fixation protocols across users and cell lines.
- Requires adaptation considerations when extending to non-adherent or primary cell models.
- Practical limitations include RNA degradation risk and variable injection success, necessitating quality controls for labeled RNA integrity.
