Name: 連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 学ぶ、Streptococcus mutansにおける高分子塊タンパク質の精製法。PCRのみを用いた効率的な手法で、膜タンパク質の研究に有用です。他の細菌種への応用も可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、日本学術振興会(JSPS)(助成番号16K15860、19K10471~T.M.、17K12032~N.H.、セコム科学技術振興財団(助成番号201)の支援を受けています。.

注:gtfC遺伝子のコード領域全体をspcrに置き換えるS.mutansの生成は、これらのプロトコルを実行する前に完了する必要があります。ジェネレーション5の詳細については、公開された資料を参照してください。
1. プライマーデザイン
<ol><li>
S.ミュータンの建設のためのプライマーを準備する彼の- gtfC. 注:このプロトコルで使用されるプライマー シーケンスを表1に示します。S.mutans His-gtfCの生成のための2段階融合PCR法は、図2に概略的に示されている。<ol>
<li>hisタグコード配列の添付のための設計プライマー(gtfC-リバースおよびspcr-forward)を設計し、gtfC遺伝子とspcr(図2A)の間に介入する。 <ol>
<li>GS リンカーと HIS タグコーディング シーケンスをgtfC-リバースプライマーとspcr-forward プライマーの両方に含め、5' 領域の 24 個のベースが互いに補完的です。 注:GSリンカーおよびHis-tagのアミノ酸配列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-His)は、遺伝子翻訳を介してGTF-SIのC終点に付着している。</li>
			<li>遺伝子の下流1kbの下流にあるS.mutans WTゲノム>1 kbのgtfC遺伝子を標的とするgtfC-FORWARDプライマーを設計し、spc rの下流側の側面領域を標的にする S. ミュータンスでgtfC.gtfC-forward およびspcr-リバース プライマーの融解温度8 (Tm)を、gtfC-リバースおよびspcrの融解温度と一致するように設定します。フォワードプライマーは、それぞれ。</li>
		</ol>
</li>
		<li>2 番目の PCR (図 2B)の入れ子になったプライマー (入れ子になった転送とネストされた逆) を設計します。</li>
		<li>形質転換体のゲノムDNAに特異的な設計プライマー(gtfC-フォワードおよびコロニーリバース)(図2C;プライマーはコロニーPCRに使用される)。 注:アンプリコンはgtfCとspcrの間の境界線にまたがっています。gtfC-FORWARD プライマーは、フォワード プライマーとして適用できます。</li>
		<li>S.mutans His-gtfCの生成の最終確認のための設計プライマー(アップフォワードおよびダウンリバース)(図2C;プライマーによって増幅されたPCR製品は、DNAシーケンシングに使用される)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. S.ミュータンからのゲノムDNA抽出
注:各S.ミュータン株は、嫌気性条件下で37°Cで脳心注入(BHI)培地で培養する必要があります。S.ミュータンスgtfCおよびS.ミュータンスHis-gtfCの変異株は、100 μg/mLスペクチノマイシンを補充したBHIで培養される。 
<ol><li>ストリークS. ミュータンs WT とS. ミュータンスgtfCを各 BHI 寒天プレートに別々に取り付けます。37 °Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>殺菌された爪楊枝を使用してS.ミュータンsWTまたはS.ミュータンスの単一のコロニーを選択し、BHIスープの1.5 mLに接種します。37 °Cで一晩インキュベートします。 注:コロニーは、最初のPCRのテンプレートDNAの供給源として使用することができる(ステップ3.1)。</li>
	<li>各細菌培養の1mLを1.5mLマイクロ遠心管に移す。15,000 x gで1分間培養を遠心分離します。</li>
	<li>上清を取り出し、トリス-EDTAバッファー(pH 8.0)の1 mLを加えてセルペレットを再サスペンドします。</li>
	<li>15,000 x gで1分間の懸濁液を遠心分離します。上清を取り除く。トリス-EDTAバッファー(pH 8.0)の50 μLでセルペレットを再ステーペントします。</li>
	<li>ブロックインキュベーターを用いて95°Cで5分間懸濁液を加熱します。15,000 x gで5分間の懸濁液を遠心分離します。</li>
	<li>上清を新しい1.5mLマイクロ遠心分離管に移します(上清は最初のPCRのテンプレートDNAとして機能します)。</li>
</ol>3. PCR増幅
注:表1、表2、表3は、それぞれPCRプライマー、試薬、増幅サイクルをまとめた。
<ol><li>S.ミュータンs WTおよびS.ミュータンスgtfCゲノムをPCRテンプレートとして用いて最初のPCRを実行する。 gtfC遺伝子の下流部分を収容する領域と、ステップ1.1.1.2(図2A)で説明するプライマーを使用してspcrを収容する領域を増幅する。</li>
	<li>1%アガロースゲル上の各PCR製品を電気フォラーゼ。約1,000 bpおよび2,000 bpの所望のDNA断片を物品法で取り除き、シリカ膜系ゲル抽出法を用いてゲルから断片を精製する。 注:PCR9、DNAゲル電気泳動10、およびDNA精製11の基本的な手順は、他の場所で詳しく説明されている。</li>
	<li>ネストされたフォワードとネストされたリバースプライマーを持つPCRテンプレートとして、最初のPCR(約等価)の製品を使用して2番目のPCRを実行します(図2B)。</li>
	<li>アガロースゲル上のPCR混合物の10分の1の電気フォレーゼ。約3,000bpの適切なアンプリコンの生成を確認します。</li>
	<li>
残りのPCR製品を沈殿させる。 注:第2のPCRによって生成される非特異的アンプリコンは相同組換えを妨げないため、PCR産物の精製は必要ない。<ol>
<li>PCR混合物にヌクレアーゼフリー水を追加し、総体積を100μLにし、続いて3M酢酸ナトリウム(pH 5.2)と2.5体(250μL)の絶対エタノールの0.1体積(10μL)を加えます。混合物を室温(RT)で10分間混ぜて保存します。</li>
		<li>4°Cで15,000 x gで20分間サンプルを遠心分離します。上清を捨てます。DNAペレットを洗浄するために70%エタノールの1 mLを追加します。</li>
		<li>4°Cで15,000 x gで5分間サンプルを遠心分離します。上清を捨てます。空気乾燥し、ヌクレルトフリー水の10 μLでDNAペレットを溶解します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 細胞変換
<ol><li>有能なS. mutans WT を準備して、前のパブリケーション5で説明した手順に従って 2 番目の PCR 製品を導入します。細胞を-80 °Cに保管してください。 注:この実験では、有能なS.ミュータンのWT細胞は、すでに-80 °Cに保存されており、S.ミュータンスgtfCを生成している。</li>
	<li>濃縮された第2PCR産物の5μLを、以前に凍結した氷冷有能な細胞の50μLアリコートに混ぜる。エレクトロポレーションキュベットに混合物を追加します。エレクトロポレーション装置を使用してセルに単一の電気パルス(1.8 kV、2.5 ms、600 Ω、10 μF)を与えます。</li>
	<li>BHIスープの500 μLで細胞を再中断します。直ちに、スペチノマイシンを含むBHI寒天プレートに懸濁液の10-100 μLを広げる。コロニーが十分に成長するまで、37°Cで2〜6日間プレートをインキュベートします。</li>
</ol>5. Gエノム組み換えと貯蔵の検証
<ol><li>コロニー PCR を実行し、gtfC フォワードプライマーとコロニーリバース プライマーを使用して、組み換えのスクリーニングを行います。アガロースゲル上の各コロニーPCR産物を電気フォラーゼする。約1,500bpのDNA断片を確認します。</li>
	<li>殺菌された爪楊枝を使用して陽性コロニーの1つを選択し、スペクチノマイシンを含むBHIブロスの2 mLで細胞を一晩サブ培養する。</li>
	<li>-80 °C または -20 °C で無菌 50% グリセロールとストックの 0.8 mL と細菌培養の 0.8 mL を混合します。</li>
	<li>残りの1mLのセル懸濁液を1.5mLのマイクロ遠心分離管に移します。ステップ2.3~2.7を繰り返し、細胞からゲノムDNAを抽出します。</li>
	<li>アップフォワードとダウンリバースプライマーとゲノムDNAをテンプレートとして使用してPCRを実行します。ステップ3.2を繰り返し、ゲルから増幅されたDNA産物を精製する。</li>
	<li>DNAシーケンシングにより精製アンプリコンのDNA配列を決定する。 注:DNAシーケンシングにより、S.ミュータンの生成を確認してください。</li>
</ol>6. ポリヒスチジンタグ付きGTF-SIの精製
<ol><li>ストリークS.ミュータンス彼の-gtfCをスペクチノマイシン含有BHI寒天プレート上に。37 °Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>BHIスープの3 mLで殺菌された爪楊枝とサブ培養細胞を使用して単一のコロニーをピックアップします。37 °Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>スペクチノマイシンなしでBHIスープの1 Lで2つの円錐状フラスコを準備します。BHIスープの1Lに一晩培養懸濁液の1mLを接種する。37 °Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>硫酸アンモニウム沈殿による培養上清からのタンパク質を濃縮する。 注:標的タンパク質が細胞内にある場合は、細胞体から抽出します。硫酸アンモニウム沈殿のための基本的な手順は、他の場所で詳細に12.<ol>
<li>4°Cで10,000 x gで20分間細菌培養懸濁液を遠心分離する。培養上清を3Lガラスビーカーに回収する。</li>
		<li>上清の2Lに硫酸アンモニウム1,122g(80%飽和)を加え、磁気攪拌機を用いて激しく撹拌する。沈殿物を攪拌しながら4°Cで4時間以上形成できるようにする。 注:沈殿物の形成は一晩続けることができる。</li>
		<li>硫酸アンモニウム沈殿液を15,000 x gで遠心分離し、4°Cで20分間使用します。上清をデカント。</li>
		<li>ヘラで沈殿物を収集し、200 mLガラスビーカーに転送します。結合バッファーの35 mLでペレットを再ステース(50 mM NaH2PO 4、300 mM NaCl、5 mMイミダゾール、pH 8.0)で再ステースする。</li>
		<li>再生セルロース透析チューブを用いて結合バッファーの2,500mLに対して懸濁液を透析し、4°Cで、撹拌する。2時間後に透析液を交換し、一晩透析を続けます。</li>
		<li>透析液をもう一度交換してください。さらに2時間透析を続けます。</li>
	</ol></li>
	<li>4°Cで10分間20,000 x gで透析液を遠心分離します。吸引ろ過装置を使用して膜フィルターを通して上清をろ過する。濾液を75cm2フラスコに移します。</li>
	<li>固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)による濾過懸濁液からポリヒスチジンタグ付きGTF-SIをフラクショナルレートします。
	<ol>
<li>Ni-電荷IMAC樹脂スラリーの2mL(樹脂約1mL)を、シリコーンチューブにコンセントを取り付けたクロマトグラフィーカラムに移します。重力の流れによって貯蔵ソリューションを取り除きます。 注意:IMAC全体で樹脂を乾燥させないようにしてください。</li>
		<li>樹脂を洗浄するために、カラムに蒸留水の3 mLを追加します。樹脂を平衡化するために結合バッファーの5 mLを追加します。</li>
		<li>ホフマンのピンチコックで流れを止めろステップ6.5からフィルタリングされたサスペンションの5 mLを追加してスラリーを作ります。</li>
		<li>残りのフィルタリングされたサスペンションにすべてのスラリーを追加します。4°Cで30分間穏やかに混合物を旋回します。</li>
		<li>混合物を列に戻します。重力の流れによって懸濁液を取り外します。IMAC樹脂を20mLの結合バッファーで洗浄します。 注:その後の IMAC 全体でホフマンピンチコックを使用して、流量を約 2 mL/min に調整します。</li>
		<li>溶出バッファーの20 mL(50 mM NaH2PO 4、300 mMNaCl、500 mMイミダゾール、pH 8.0)で組換えGTF-SIを溶出します。 注:プロトコルはここで一時停止できます。溶出物は4°Cで保存する必要があります。IMAC樹脂は再利用可能です。IMAC樹脂の説明書を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>溶出バッファーをストレージバッファ(50 mMリン酸バッファー、pH 6.5)に置き換え、組換えGTF-SI溶液を遠心超濾過ユニットを使用して約1mLに濃縮します。組換えGTF-SI溶液を4°Cに保管してください。 注:SDS-PAGE 13およびウェスタンブロッティング14を用いてポリヒシジンタグ付きGTF-SI精製を確認し、ワサビペルオキシダーゼ結合抗ポリヒスチジンモノクローナル抗体を用いて確認する。CHAPSの追加(最終濃度、0.1%)溶離剤には、標的タンパク質に応じて、ユニットへの非特異的な吸着を避けるために必要とされる場合があります。</li>
</ol>7. 組換えGTF-SIによる機能修復
<ol><li>各S.ムタンの株をBHI寒天プレートに個別にストリークします。プレートを37°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>殺菌されたつまようじを使用して、BHIスープの2 mLに接種する単一のコロニーを拾います。37 °Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>S.mutansの一晩培養物の20 μLを使用して、ガラス試験管に抗生物質を含まない1%ショ糖を含むBHIスープの2mLを接種する。GTF-SIまたは車両の同等の体積をS.mutansのgtfC培養物に加え、チューブを一晩傾斜位置に置いて細胞を培養する。 注:無菌注射器フィルターでGTF-SI溶液を殺菌し、使用前にビシンコニン酸タンパク質アッセイ15を用いてタンパク質濃度を決定する。</li>
	<li>10 s. サスペンションをデカントのための渦ミキサーで培養懸濁液を攪拌します。十分な量の蒸留水で試験管を洗います。</li>
	<li>0.25%クーマシーブリリアントブルー(CBB)の1 mLでチューブウォールのバイオフィルムを汚します。</li>
	<li>1分後に染色液をデカントし、十分な量の蒸留水で試験管を洗浄します。試験管を空気乾燥させます。</li>
</ol>

<ol><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual+3rd+Edition%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).</li>
<li>Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+functional+analysis+of+a+gene+of+interest+in+Streptococcus+mutans%3A+gene+disruption+followed+by+purification+of+a+polyhistidine-tagged+gene+product%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product.</a> Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Murata, T., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+chloride+channel+permease+to+fluoride+resistance+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101(2016).</li>
<li>Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+gene-disrupted+Streptococcus+mutans+strain+without+gene+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).</li>
<li>Hanada, N., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+Streptococcus+mutansgtfC+gene%2C+coding+for+synthesis+of+both+soluble+and+insoluble+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans.</a> Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).</li>
<li>LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+nucleotide+base+sequence+analysis+of+a+spectinomycin+adenyltransferase+AAD%289%29+determinant+from+Enterococcus+faecalis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR%3A+The+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+Purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gel Purification.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+precipitation+using+ammonium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Protein precipitation using ammonium sulfate.</a> Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2019).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+putative+cariogenic+properties+in+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans.</a> Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).</li>
<li>Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+ligation+mutagenesis+in+transformable+streptococci%3A+application+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency.</a> Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).</li>
<li>Ge, X., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+gene+deletions+in+Streptococcus+sanguinis+by+high+throughput+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

プライマーの設計は、プロトコルの最も重要なステップです。gtfC -リバースプライマーとspcr-forward プライマーのシーケンスは、gtfC の 3'終了領域とspcrの 5′ 終了領域の両方のシーケンスに基づいて自動的に決定されました。各プライマーには、GS リンカーと 5' リージョンの His タグ コーディング シーケンスをエンコードする 24 の相補ベースが含まれています。上流の側面領域に位置するネイティブの規制シーケンスの中断は、3'末端にHisタグコーディングシーケンスを追加することによって回避することができます。DNAストップコドンは、gtfC-リバースプライマーから除去し、spcr-FORWARDプライマーに追加する必要があります。さらに、gtfC-forwardおよびspcr-reverseは、S.mutans WTゲノムにおける相同組換えの標的領域の約1kb上流...

遺伝子の機能の分析は、通常、目的の遺伝子が破壊された株に野生型株の表現形質の比較を含む。遺伝子破壊株が産生されると、遺伝子産物の外因性添加が機能的回復を可能にする。
その後の修復アッセイに必要な精製遺伝子産物を得るための最も一般的な方法は、大腸菌1で異種発現を行うことである。しかしながら、膜タンパク質または高分子量タンパク質の発現は、このシステム1を用いて困難であることが多い。これらの場合、標的タンパク質は、通常、複雑な一連のステップを通じてタンパク質をネイティブに合成する細胞から単離され、遺伝子産物の損失につながる可能性があります。これらの問題を克服するために、遺伝子破壊法2、PCRベースのDNAスプライシング法3(指定2段階融合PCR)、遺伝子のエレクトロポレーションに続く遺伝子産物精製のための簡単な手順が開発されました。連鎖球菌変異体の変換.遺伝子産物のC終産にポリヒスチジンタグ(His-tag)を添加すると、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)による精製が容易になります。
Hisタグ発現株を単離するために、目的の遺伝子のゲノムDNA全体(このHisタグ発現遺伝子破壊株)は、抗生物質耐性マーカー遺伝子に置き換えられる。Hisタグ発現株を生成する手順は、前述の4,5のように遺伝子破壊株を生成する手順とほぼ同じである。したがって、遺伝子破壊および遺伝子産物単離の方法は、機能解析のための連続実験として行われるべきである。
本研究では、ポリヒスチジンコード配列がgtfC(GenBank遺伝子座タグSMU_1005)遺伝子の3'末端に付着し、S.ミュータンス6にグルコシルトランスフェラーゼ-SI(GTF-SI)をコードする。次いで、連鎖球菌種における発現研究を行った。大腸菌による不一相gtfC発現の達成は困難であり、GTF-SIの分子量が高いためである可能性が高い。この株はS.ミュータンスHis-gtfCと名付けられています。野生型S.mutans(S.mutans WT)およびその誘導体におけるgtfCおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子カセット(spc r)7遺伝子の組織を示す概略図図 1.GTF-SIは、カリオ原性歯科バイオフィルム6の開発に貢献する分泌タンパク質です。ショ糖の存在下では、接着性バイオフィルムはWT S.ミュータンス株の滑らかなガラス表面で観察されるが、S.mutans gtfC-破壊株(S.mutans ΔgtfC)2、5では観察されない。.バイオフィルム形成は、組換えGTF-SIの外因性添加時にS.ミュータンスΔgtfCで復元される。 株、S.ミュータンスHis-gtfCは、次いで組換えGTF-SIを生成するために使用されます。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス <td>日本ジェネティクス</td><td>NE-AG02</td><td>アガロースゲル電気泳動用</td></tr><tr><td>アナエロパック</td><td>三菱ガス化学</td><td>A-03</td><td>嫌気性培養システム</td></tr><tr><td>抗His-Tagモノクローナル抗体</td><td>MBL</td><td>D291-7</td><td>HRP標識</td></tr><tr><td>BCAタンパク質アッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23227</td><td>タンパク質濃度の測定</td></tr><tr><td>ブレイン ハート インフュージョン ブロス</td><td>ベクトン、ディキンソン</td><td>237500</td><td>細菌培養培地</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>和光</td><td>031-17922</td><td>バイオフィルム染色用</td></tr><tr><td>遠心限外ろ過ユニット</td><td>ザルトリウス</td><td>VS2032</td><td>バッファーの交換とタンパク質濃度</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>クボタ</td><td>7780II</td><td></td></tr><tr><td>クロマトグラフィーカラム</td><td>バイオ・ラッド</td><td>7321010</td><td>IMAC</td></tr><tr><td>透析メンブレンクランプ</td>用 <td>フィッシャーブランド</td><td>21-153-100</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>As One</td><td>2-316-06</td><td></td></tr><tr><td>DNAポリメラーゼ</td><td></td><td>宝R045A</td><td>ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td></tr><tr><td>DNAシーケンシング</td><td>ユーロフィンズゲノミクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL基質</td><td>バイオ・ラッド</td><td>170-5060</td><td>ウェスタンブロッティング用</td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M pH 8.0)</td><td>Wako</td><td>311-90075</td><td>Tris-EDTA buffer preparation</td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット</td><td>Bio-Rad</td><td>1652086</td><td>0.2 cm gap</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652100</td><td></td></tr><tr><td>EtBr溶液</td><td>Nippon Gene</td><td>315-90051</td><td>アガロースゲル電気泳動用</td></tr><tr><td>ゲルバンドカッター</td><td>日本ジェネティクス</td><td>FG-830</td><td></td></tr><tr><td>Gel抽出キット</td><td>日本ジェネティクス</td><td>FG-91202</td><td>アガロースゲルからのDNA抽出</td></tr><tr><td>イメージャー</td><td>GEヘルスケア</td><td>29083461</td><td>SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング用</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>和光</td><td>095-00015</td><td>結合緩衝液および溶出緩衝剤調製</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>日本メディカル&化学機器</td><td>EZ-022</td><td>温度設定:4°C;C</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>日本メディカル&化学機器</td><td>LH-100-RDS</td><td>温度設定:37°C;C</td></tr><tr><td>メンブレンフィルター</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td>0.2 & micro;m径</td></tr><tr><td></td><td>クボタ</td><td>3740</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>和光</td><td>191-01665</td><td>結合緩衝液および溶出緩衝液の調製</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;2H2O</td><td>和光</td><td>192-02815</td><td>結合緩衝液および溶出緩衝液</td></tr><tr><td>の調製 NaOH</td><td>和光</td><td>198-13765</td><td>結合緩衝液および溶出緩衝液</td></tr><tr><td>(NH4)2SO4</td>和<td>光</td><td>015-06737</td><td>硫酸アンモニウム沈殿</td></tr><tr><td>Niチャージ樹脂</td><td>Bio-Rad</td><td>1560133</td><td>IMACの場合</td></tr><tr><td>PCR プライマー</td><td>Eurofins Genomics</td><td>カスタムオーダー</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質標準</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0381</td><td>SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティング</td></tr>用 <tr><td>溶媒ろ過装置</td><td>1つとして</td><td>FH-1G</td><td></td></tr><tr><td>スペクチノマイシン</td><td>ワコー</td><td>195-11531</td><td>抗生物質; 100 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>滅菌シリンジフィルター</td><td>Merckmillipore</td><td>SLGV004SL</td><td>0.22 &micro;m 直径</td></tr><tr><td>Streptococus mutans &#916;ラボでgtfC</td><td>Stock株。</td><td></td><td>gtfCをspcr</td></tr><tr><td>Streptococus mutans UA159</td><td>ストック株に</td>置き換えました。<td></td><td>S. mutans ATCC 700610, 野生型</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>ワコー</td><td>196-00015</td><td>バイオフィルム開発用</td></tr><tr><td>TAE (50 回; )</td><td>Nippon Gene</td><td>313-90035</td><td>アガロースゲル電気泳動用</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1 M, pH 8.0)</td><td>和光</td><td>314-90065</td><td>Tris-EDTA緩衝液調製</td></tr></tbody></table>

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

遺伝子の機能の解明は、通常、目的の遺伝子が破壊された野生型株と株の表現型形質の比較を含む。遺伝子破壊後の機能の喪失は、その後、破壊された遺伝子の生成物の外因性添加によって回復される。これは、遺伝子の機能を決定するのに役立ちます。前述の方法は、gtfC遺伝子破壊連鎖球菌株を生成することを含む。ここで、遺伝子破壊に続いて新たに生成されたS.ミュータン株からgtfC遺伝子産物を精製するための要求の厳しい方法が記載されている。目的の遺伝子の3'末端にポリヒスチジンコード配列を添加することを含み、固定化金属親和性クロマトグラフィーを用いて遺伝子産物を簡単に精製することができます。この方法では、PCR以外の酵素反応は必要ありません。遺伝子破壊後の外因性添加による遺伝子産物の回復は、遺伝子機能を決定するための効率的な方法であり、異なる種に適応することもできる。

図3は、第1PCR(図3A)および第2PCR(図3B)からの各アンプリコンのサイズを示す。各アンプリコンのサイズは、表1に説明するように、予測サイズに対応しました。図4Aは、第2のPCR産物で形質転換し、スペクチノマイシンを含むBHI寒天プレート上にメッキされたS.ミュータンコロニーを示す。その後、コロニーPCR産物をアガロースゲル(図4B)で走らせた。各アンプリコンは、表 1に説明するように、予測サイズのサイズでした。図 5は、SDS-PAGE とウェスタン ブロットの画像を示しています。IMACで精製したタンパク質は、SDS-PA...

ここで説明する、連鎖球菌変異体における遺伝子産物の精製のための簡単な方法である。この技術は、タンパク質、特に膜タンパク質および高分子量タンパク質の精製に有利であり、かつ様々な他の細菌種と共に使用することができる。

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

この方法は、大腸菌で発現しにくい遺伝子製品がどのように精製されるのかなど、微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、PCR以外の酵素反応が担体ではなく、タンパク質精製のための一般的な用途が使用できることです。この方法は、レンサ球菌突然変異体におけるタンパク質精製に関する洞察を提供することができるが、他の微生物叢種にも鑑たることができる。この手順のデモンストレーションは、当研究室の大学院生である山下真美子博士です。レンサ球菌変異体からのプライマー設計およびゲノムDNA抽出後、野生型レンサ球菌変異体およびGFC破壊ストレプトコッカス・ミュータンスゲノムをPCRテンプレートとして使用して最初のPCRを行う。調製したgtfC-フォワードおよびリバースプライマーおよびspc r-フォワードおよびリバースプライマーを使用して、gtfC遺伝子の下流部分を収容する領域およびスペクチノマイシン耐性遺伝子を収容する領域を増幅する。次いで、1%アガロースゲル上の各PCR産物をエレクトロフォレス化した。ゲルバンドカッターを使用して、ゲルからマイクロ遠心チューブに約1,000塩基対と2,000塩基対の所望のDNA断片を切除します。各チューブに500マイクロリットルの可溶化バッファーを加え、56°Cで10分間インキュベートしてゲルスライスを溶解します。シリカ膜ベースのゲル抽出法を用いて断片を精製する。最初の PCR の産物を、ネストフォワードおよびネストされた逆のプライマーを含む PCR テンプレートとして使用して、2 番目の PCR を実行します。2番目のPCR産物が電気泳動で確認できない場合は、別のネストされたプライマーのペアを設計する必要があります。アガロースゲル上のPCR混合物の5マイクロリットルのエレクトロフォレス。エチジウムブロマイドゲル染色像により約3,000塩基対の適当なアンプリコンの生成を確認し、原稿に従って進める。今、濃縮された第二PCR産物の5マイクロリットルを氷冷、有能な野生型レンサ球菌突然変異細胞の50マイクロリットルのアロクォートに混合し、以前に凍結した。混合物をエレクトロポレーションキュベットに加え、エレクトロポレーション装置のキュベットチャンバーにキュベットを入れます。1.8キロボルト、600オーム、10マイクロファラドを2.5ミリ秒の単一の電気パルスを細胞に与えます。キュベットに500マイクロリットルの脳・心注入スープを加えます。すぐに10〜100マイクロリットルの懸濁液を、スペチノマイシンを含む脳-心輸液オーガープレートに広げる。コロニーが十分に成長して拾われるまで、37°Cで2〜6日間プレートをインキュベートします。ストレプトコッカス・ミュータンスポリヒスチジンコード配列の生成後、原稿による分光マイシンを伴わない菌株および一晩の接種を組み込み、摂氏4度で10,000倍gで20分間細菌培養懸濁液を遠心分離する。培養上清を3リットルガラスビーカーに移します。培養上清からタンパク質を濃縮するには、2リットルの上清を磁気攪拌機に置き、激しい攪拌を開始します。硫酸アンモニウム1、122グラムを加え、沈殿物を4時間または一晩にわたって摂氏4度で激しく攪拌して形成させます。次に。硫酸アンモニウム沈殿液を摂氏4度で20分間15,000回沈殿させた。上清をデカントします。ヘラで、沈殿物を収集し、200ミリリットルのガラスビーカーに移します。ペレットを35ミリリットルの結合バッファーに再懸濁します。次いで、約25ミリリットルの懸濁液を再生したセルロース透析管に移す。透析チューブを攪拌結合バッファーの 2.5 リットルに入れ、攪拌機の 4°C でサスペンションを透析します。2時間後に透析液を交換し、一晩透析を続けてください。次に、チューブから透析したサスペンションを遠心分離チューブに移し、チューブを20,000倍gの遠心分離機に摂氏4度で10分間置きます。セクションろ過装置では、上清を0.2マイクロメートルの膜フィルターで注ぎ、フィルターを付けます。濾液を75ミリリットルのフラスコに移します。濾過懸濁液からポリヒスチジンタグ付きgtfSIを分画するために、まず固定化された金属親和性クロマトグラフィーを調製する。原稿に従って樹脂を平衡化した後、ホフマンピンチコックを閉じます。フィルターした懸濁液を5ミリリットルのカラムに加え、スラリーを作ります。その後、残りの濾過された懸濁液にすべてのスラリーを移し、4°Cで30分間穏やかに混合物を渦巻きます。混合データを列にロードして戻します。ホフマンピンチコックを開き、重力の流れでサスペンションを取り除きます。IMAC樹脂を20ミリリットルの結合バッファーで洗浄し、次いで、溶出バッファーの20ミリリットルを溶出して組換えgtfSIを得た。その後、遠心超濾過チューブに溶出液を積み込み、溶液を2,000回gで遠心分離し、溶液を濃縮して1〜5分間濃縮します。濾液容器を空にし、15ミリリットルの貯蔵バッファーをチューブに加えます。サンプルを再び遠心分離し、さらに2回繰り返します。組換えgtfSI溶液は、最終的に約1ミリリットルに濃縮される。濃縮物をマイクロ遠心チューブに移し、摂氏4度で保管します。残りの機能復元プロトコルを続行します。このプロトコルにおいて、アガロースゲル電気泳動は、第1PCRおよび第2PCRからの各アンプリコンのサイズが予測サイズに対応していることを示している。ストレプトコッカスミュータンスコロニーは、第2のPCR産物で形質転換し、スペチノマイシンを含む脳心注入オーガープレートにメッキした。アガロースゲル上で実行されるコロニーPCR産物は、各アンプリコンが予測サイズであったことを示している。固定化された金属親和性クロマトグラフィーで精製されたタンパク質は、SDS-PAGEにより単一バンドとして観察された。ウェスタンブロットは、抗ポリヒスチジン抗体を用いて行い、観察されたバンドが160キロダルトンの期待されるポリヒスチジンタグ付きタンパク質であることを確認した。スクロース由来のバイオフィルム形成能は、1%スクロースの存在下でチューブ壁に付着性バイオフィルムを形成したレンサ球菌変異体野生型およびレンサ球菌変異体His-gtfCでのみ見られた。これはレンサ球菌ミュータンスデルタgtfCでは認められなかった。しかし、組換えgtfSIの25マイクログラムを添加すると、レンサ球菌ミュータンスデルタgtfCにおける接着性バイオフィルム形成能が回復した。この方法の成功は、第2のPCR増幅に依存するため、2番目のPCR産物は電気泳動によって確認されなければならない。すでに、この方法により得られたヒスチジン型タンパク質は、タンパク質相互作用などの機能性酸にも連結されている。その開発後、この技術は遺伝子破壊と組み合わせて、微生物学の分野の研究者が遺伝子機能を探求する道を開いた。

purification-of-a-high-molecular-mass-protein-in-streptococcus-mutans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ママはmagnetosome活性化に関与することが示されていたユニークなMagnetosome関連するタンパク質である。ここでは、からママ欠失変異体（MamAΔ41）の精製のプロトコールを提示...

の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

マススペクトロメトリー（APMS）との組み合わせでタグ付けされたタンパク質のアフィニティー精製は、タンパク質相互作用ネットワークの体系的マッピングのため、生物学的プロセスの基本メカニズムを調査するための強力な方法です。ここでは、細菌のために開発最適化された順次ペプチドアフィニティー（SPA）をAPMSの手順を説明...

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

出典: Murata, T., et al. Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (2019)このビデオでは、...

Streptococcus mutansからのポリヒスチジンタグ付きタンパク質の精製手順

生化学的ア ​​プローチは、膜タンパク質のin vivoでのタンパク質-タンパク質相互作用（PPI）を識別するために記載されている。この方法は、タンパク質架橋、アフィニティー精製および質量分析を組み合わせて、ほぼすべての細胞型または生物に適用可能である。このアプローチでは、一過性のPPIのさえ識別が可能となる。...

膜脊柱：膜タンパク質のタンパク質 - タンパク質相互作用を識別するために、生化学的ツールインビボ

この方法は、ツインのStrepタグ融合タンパク質と共有結合的にビス（スルホスクシンイミジル）（BS3）で架橋された修正されたストレプトアビジン（ストレプト-Tactinの）樹脂上での具体的な複合体の効率的な精製方法が記載されている。この方法は、速い速度の利点は、良好な標的タンパク質の回収および高純度を有し、質量分析によるその後の分析に対応している。...

ツイン連鎖球菌タグタンパク質とのStrep-Tactinの樹脂ビスで架橋された（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）に対するそれらの複合体のいずれかの段階精製

エラスチン様ポリペプチドは、組換えタンパク質の精製からの薬物送達に至るまでのアプリケーションとの刺激応答性のバイオポリマーである。このプロトコルは、クロマトグラフィーへの単純な代替手段としての下限臨界溶液温度の相転移挙動を使用して大腸菌のエラスチン様ポリペプチドおよびそれらのペプチドやタンパク質融合物の精製および特性について説明します。...

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) は、ヒトの病原体であるClostridium...

の生産、結晶化と構造決意<em&gt; C。ディフィシル</em&gt; PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

このプロトコルは、組換えタグフリーカルシウム結合タンパク質S100A12およびヒト単球刺激アッセイのためのイオン誘導オリゴマーの精製方法を説明する。...

免疫細胞刺激のためのヒトS100A12とそのイオン誘発オリゴマーの精製

この記事では、C41(DE3)発現系で毒性ヌクレアーゼである組換えNsp15を過剰発現し、その後、アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用してタグ付きタンパク質を精製する方法論について説明します。これらのプロトコルは、他の困難な有毒タンパク質にも適応できます。...

大腸菌からの有毒ヌクレアーゼの過剰発現と精製

本プロトコルは、大腸菌からエラスチン様ポリペプチド(ELP)を精製するための迅速かつ再現性のある有機溶媒ベースの抽出および沈殿法を説明 しており、...

有機溶媒を用いた抽出・沈殿法を用いた大 腸菌 からのエラスチン様ポリペプチド(ELP)の効率的な精製

学ぶ、Streptococcus mutansにおける高分子塊タンパク質の精製法。PCRのみを用いた効率的な手法で、膜タンパク質の研究に有用です。他の細菌種への応用も可能です。

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

さらに動画を探す