Name: 超低入力キャリア-CAGEを使用した転写開始サイトマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学ぶ超低入力SLIC-CAGE法による転写開始サイトマッピング。10ナノグラムのRNAからシーケンス対応ライブラリーを生成し、プロモーターとエンハンサーの高解像度解析を実現します。

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この研究は、ウェルカム・トラスト助成金(106954)がB.L.と医学研究評議会(MRC)コア・ファンディング(MC-A652-5QA10)に授与されました。N. C. は EMBO 長期フェローシップ (EMBO ALTF 1279-2016) によってサポートされました。E. P. は、英国医学研究評議会によって支援されました。B. L. は、英国医学研究評議会 (MC UP 1102/1) によってサポートされました。

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分解性キャリアRNA/DNAの特許が満たされています。

SLIC-CAGEライブラリの準備を成功させるためには、サンプル吸着によるサンプル損失を防ぐために、低結合のヒントとチューブを使用することが重要です。上清の取り出しを伴うすべてのステップで、サンプル量全体を回収することをお勧めします。プロトコルには複数のステップがあるため、サンプルの連続的な損失はライブラリの失敗につながります。
CAGE(nAnT-iCAGE)が日常的に行われていない場合は、同じ総RNAサンプルの異なる入力量(10ng、20ng、50ng、100 ng、200 ng)でSLIC-CAGEをテストし、合計RNAの5μgを使用して調製されたnAnT-iCAGEライブラリと比較することをお知りください。nAnT-iCAGEライブラリーが失敗した場合(サンプルごとに得られたDNAライブラリーの0.5-1 ng未満)、SLIC-CAGEは機能しそうになく、サンプル損失を最小限に抑える必要があります。
上限のない劣化RNAまたはrRNAを欠いている高品質のライブラリーを確保するための重要なステップは、セクション7で説明するキャップトラップです。ストレプトアビジンビーズが洗浄バッファーで完全に再懸濁され、洗浄バッファーが次の洗浄工程またはcDNAの溶出に続く前に除去されることが非常に重要です。
キャリア劣化の最初のラウンド後のqPCRの結果が、アダプター_f1とcarrier_f1プライマーの使用との間に違いがない場合は、プロトコルを継続することをお勧めします。キャリア劣化の第2ラウンドの後、Ct値の差が5未満の場合、キャリア劣化の第3ラウンドが推奨される。我々は必要な劣化の第三ラウンドを見つけたことがなく、それが発生した場合は、ホーミングエンドヌクレアーゼ株を交換することをお勧めします。
取得したライブラリの最終的な量がシーケンスに十分でない場合は、PCR 増幅の追加ラウンドがプロトコルに追加される可能性があります。PCR増幅は、サイズ選択で避けることができないサンプル損失を考慮して、シーケンシングに十分な材料を得るために必要な増幅サイクルの最小数で設定できます。SPRI磁気ビーズを使用した精製またはサイズ選択は、すべての小さな(<200 bp)フラグメントが除去されるまで実行され(必要に応じて0.6:1ビーズをサンプル比に使用)、ライブラリはPicogreenを使用して定量化する必要があります。
ライブラリは、シングルエンドモードまたはペアエンドモードでシーケンスできます。ペアエンドシーケンスを使用すると、トランスクリプトアイソフォームに関する情報を取得できます。さらに、逆転写はランダムプライマー(TCT-N 6、N6はランダムヘキサマー)を用いて行われるので、配列された3'エンドからの情報は、PCRの重複を崩壊させる一意の分子識別子(UMI)として使用することができる。適度な数のPCR増幅サイクルが使用される(最大18)ため、UMIの使用は以前に不要であることが分かっています。
プロトコルのコアは nAnT-iCAGE11に依存しているため、SLIC-CAGE は 8 つのバーコードを使用します。したがって、現在、8 個を超えるサンプルの多重化はサポートされていません。さらに、SLIC-CAGEとnAnT-iCAGEの両方は、プロトコルがAMPure XPビーズを使用してサイズ除外を通じてリンカーとPCRアーティファクトを除去するように設計されているので、200 bpより短いRNAをキャプチャするのに適していません。
SLIC-CAGEは、全RNA材料のナノグラムを用いて転写開始開始部位をマッピングするための唯一の偏りのない低入力単一ヌクレオチド分解能法である。代替方法は、キャップトラップの代わりにバーコードキャップRNAに逆転写酵素のテンプレート切り替え活性に依存する(例えば、NanoCAGE15およびNanoPARE16)。テンプレートの切り替えにより、これらの方法はTSS検出において配列固有のバイアスを示し、偽陽性TSSの数が増加し、真のTSS9、10の数が減少します。

遺伝子発現のキャップ解析(CAGE)は、RNAポリメラーゼII転写開始部位(TSSS)1の単一ヌクレオチド分解能ゲノムワイドマッピングに用いられる方法である。その定量的な性質により、5'エンド中心の式プロファイリングも可能になります。TSSを取り巻く領域(上流および下流約40bp)はコアプロモーターであり、RNAポリメラーゼIIと一般的な転写因子が結合する物理的位置を表す(前述の2、3を検討)。TSSの正確な位置に関する情報は、コアプロモーターの発見およびプロモーターダイナミクスの監視に使用できます。さらに、アクティブエンハンサーは双方向転写のシグネチャを示すので、CAGEデータはエンハンサーダイナミクス4のエンハンサー検出およびモニタリングにも使用できます。CAGEの方法論は、最近、ENCODE 5、modENCODE 6、およびFANTOMプロジェクト7などの注目の研究プロジェクトでの幅広い応用と使用のために人気が高まっています。さらに、TSS情報はまた、疾患特異的TSSが診断目的8に使用することができるので、健康な組織および疾患組織を区別するために重要であることが証明されている。
TSSマッピングのためのいくつかの方法(CAGE、RAMPAGE、STRT、ナノケージ、ナノケージ-XL、オリゴキャッピング)が利用可能ですが、私たちと他の人は最近、CAGEが偽陽性の数が最も少ない真のTSSをキャプチャする最も公平な方法であることを示しました9,10.最近のCAGEプロトコルnAnT-iCAGE11は、制限酵素を使用してフラグメントを短いタグに切断することを回避し、PCR増幅を使用しないため、TSSプロファイリングのための最も公平なプロトコルです。nAnT-iCAGEプロトコルの制限は、大量の出発物質(例えば、各サンプルに対する総RNAの5μg)の要件である。特定の、生物学的に関連する質問に答えるために、多くの場合、そのような大量の出発物質(例えば、FACS選別細胞または初期胚期)を得ることは不可能である。最後に、nAnT-iCAGEが成功した場合、各サンプルから入手できるDNAライブラリー材料は1~2ngのみで、達成可能なシーケンシング深さを制限します。
総RNAのナノグラムのみを用いてTSSプロファイリングを可能にするために、最近、超低入力キャリアCAGE 10(SLIC-CAGE、図1)を開発しました。SLIC-CAGEは、高複雑性ライブラリを得るために合計RNAのわずか10 ngしか必要としならない。当社のプロトコルは、目的のRNAに追加された慎重に設計された合成RNAキャリアに依存し、合計5μgのRNA材料を達成します。合成キャリアは、過剰に均質な分子によって引き起こされる可能性のある潜在的なバイアスを回避するために、長さの分布の標的DNAライブラリーを模倣します。担体の配列は、2つの理由から、大腸菌ロイチルtRNA合成酵素遺伝子(表1)の配列に基づいている。第一に、最終ライブラリー内のキャリアの残りは、たとえ配列されたとしても、真核生物ゲノムにマッピングされない。第二に、大腸菌は中親和種であるため、そのハウスキーピング遺伝子はSLIC-CAGEに適した温度範囲に最適化されています。キャリア配列はまた、キャリアRNA分子に由来するDNAの特異的な分解を可能にするためにホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位と組み込まれています。ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が長いため、標的、サンプル由来ライブラリーはそのまま残ります(I-CeuI = 27 bp;I-SceI = 18 bp)および真核生物ゲノムに統計的に見られる可能性は低い。キャリアの特定の劣化とサイズ除外によるフラグメントの除去後、ターゲットライブラリはPCR増幅され、次世代シーケンシングの準備が整います。開始RNA量(1-100 ng)に応じて、13〜18 PCR増幅サイクルが必要とされる。各サンプルあたりのDNAの最終的な量は5〜50 ngの間の範囲で、非常に深いシーケンシングのための十分な材料を得る。総RNAの1-2 ngのみを使用する場合、真のTSSを検出することができます。ただし、ライブラリの複雑さは低くなるものが予想されます。最後に、SLIC-CAGEはnAnT-iCAGEプロトコル11に基づいているため、シーケンス前に最大8つのサンプルの多重化が可能です。

<table><tbody><tr><td>2-プロパノール、Bioultra、分子生物学用、&ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59304-100ML-F</td><td>RNAclean XP精製に使用されます。</td></tr><tr><td>3'リンカー</td><td></td><td></td><td>配列は、本稿のMurata et al. 2014および補足表1に記載されています。3'リンカーを生成するためのストランドのアニーリングは、このプロトコルの補足に記載されています。</td></tr><tr><td>5'リンカー</td><td></td><td></td><td>配列は、本稿のMurata et al. 2014および補足表1に記載されています。5'リンカーを生成するためのストランドのアニーリングは、このプロトコルの補足に記載されています。</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP, 60 mL</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63881</td><td>DNAの精製</td></tr><tr><td>アジャンコートRNAClean XP キット</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63987</td><td>ケージステップでのRNAおよびRNA:cDNAハイブリッドの精製。</td></tr><tr><td>Axygen 0.2 mL ポリプロピレン PCR チューブストリップおよびドーム型キャップストリップ</td><td>Axygen (コーニングから入手可能)</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td>または任意の 8 チューブ PCR ストリップ (水と混合物にのみ使用)。</td></tr><tr><td>Axygen 1 x 8 ストリップドーム型 PCR キャップ</td><td>Axygen (コーニングから入手可能)</td><td>PCR プレート用</td> <td>PCR-02CP-C</td> キャップ。</tr><tr><td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock Microcentrifuge Tube</td><td>Axygen (Corningから入手可能)</td><td>MCT-150-L-C</td><td>低結合1.5 mLチューブで、酵素ミックスやサンプル濃縮に使用されます。</td></tr><tr><td>Axygen 96 well no skirt PCR microplate</td><td>Axygen (Corningから入手可能)</td><td>PCR-96-C</td><td>低結合PCRプレート - プロトコルのすべてのステップに使用する必要があります。サンプルの視認性を高めるために、プレートは2 x 8ウェルを含むようにカットする必要があることに注意してください</td></tr><tr><td>バイオアナライザー(またはタペステーション):RNAナノおよびHS DNAキット</td><td>アジレント</td><td></td><td>RNAの品質、効率的なサイズ選択、およびライブラリの最終品質を決定するため(タペステーションも使用できます)</td></tr><tr><td>ビオチン(ロングアーム)ヒドラジド</td><td>ベクターラボ</td><td>SP-1100</td>ビ<td>オチン化/タグ付け</td></tr><tr><td>Cutsmart</td><td>バッファーNEB</td><td></td><td>制限酵素バッファー</td></tr><tr><td>ディープベント(exo-)DNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0259S</td><td>セカンドストランド合成</td></tr><tr><td>DNAライゲーションキット、マイティミックス</td><td>宝</td><td>6023</td><td>5'および3'リンカーライゲーション</td></tr><tr><td>dNTPミックス(各10 mM)</td>に使用 キャリア<td>テンプレート(またはPCRに適した任意のdNTP)の生産用</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18427013</td> dNTPミックス</tr><tr><td>Dynabeads M-270 ストレプトアビジン</td><td>Invitrogen</td><td>65305</td><td>キャップトラッピング。他のビーズは、使用するバッファーで最適化されているため、使用しないでください。</td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12321D</td><td>1.5 mLチューブ用マグネットスタンド - ストレプトアビジンビーズの調製に使用します。</td></tr><tr><td>DynaMag-96 サイドスカートマグネット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027</td><td>PCR プレート用マグネットスタンド (96 ウェルプレート) - カットプレートと併用して 2 x 8 ウェルを収納できます。</td></tr><tr><td>エタノール、BioUltra、分子生物学用、&ge;99.8%</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>51976-500ML-F</td><td>アンピュアウォッシュに使用。任意の分子生物学的に適したエタノールを使用することができる。</td></tr><tr><td>エキソヌクレアーゼ I (E. coli)</td><td>NEB</td><td>M0293S</td><td>残余プライマー分解</td></tr><tr><td>ゲルローディング色素、パープル (6x)、SDS なし</td><td>NEB</td><td>B7025S</td><td>アガロースゲルローディング色素</td></tr><tr><td>HiScribe T7 高収量 RNA 合成キット</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>E2040S</td><td>キャリア in vitro 転写用キット</td></tr><tr><td>水平電気泳動装置</td><td></td><td></td><td>アガロースゲル</td></tr><tr><td>I-Ceu</td><td>NEB</td><td>R0699S</td><td>ホーミングエンドヌクレアーゼ</td></tr>からのキャリアDNAテンプレートの精製は、キャリア分解に使用されます。<tr><td>I-SceI</td><td>NEB</td><td>R0694S</td><td>キャリア分解に使用されるホーミングエンドヌクレアーゼ。</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HS ReadyMix (2x)</td><td>Kapa Biosystems (Roche社製)</td><td>KK2601</td><td>ターゲットライブラリ増幅用PCRミックス</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST qPCRキット (ユニバーサル) 2x</td><td>Kapa Biosystems (Roche社製)</td><td>KK4600</td><td>qPCRミックスで、分解効率とPCR増幅サイクルの必要数を評価</td></tr><tr><td>マイクロピペットとマルチチャンネルマイクロピペット (0.1-10 &micro;L、1-20 &micro;L、20-200 &micro;L)</td><td>ギルソン</td><td></td><td>結合力の低いソレンソンチップを使用したギルソンの使用をお勧めします。他のマイクロピペットは互換性がない可能性があります。ブランドが異なれば、結合力の低いチップの品質も同じでない場合があり、サンプルの損失が増加する可能性があります。</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td></td><td></td><td>最終ライブラリのピコグリーン濃度測定用。マイクロプレートは、少量の測定を可能にし、サンプルの無駄を減らすために使用されます。</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーウォーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9937</td><td>または任意のヌクレアーゼ(DNaseおよびRNase)フリーウォーター</td></tr><tr><td>PCRサーマルサイクラー</td><td>インキュベーション</td><td></td><td></td>ステップとPCR増幅</tr><tr><td>Phusion ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td>キャリアテンプレート(または任意のハイフィデリティポリメラーゼ)の増幅用DNAポリメラーゼ</td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット (50)</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>アガロースゲルからのキャリアPCRテンプレートの精製。</td></tr><tr><td>PCR増幅数とキャリア分解の程度を測定する</td><td>qPCRマシン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P11495</td><td>最終的なライブラリ濃度の測定に使用 - 私たちの手の中では、Qubitよりも正確で再現性が高いため、推奨されます。</td></tr><tr><td>クイックロードパープル 100 bp DNAラダー</td><td>NEB</td><td>N0551S</td><td>DNAラダー</td></tr><tr><td>クイックロードパープル 1 kb プラスDNAラダー</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td>DNAラダー</td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼH</td><td>タカラ</td><td>2150A</td><td>キャップトラップ後のRNAの消化。</td></tr><tr><td>RNase ONE リボヌクレアーゼ</td><td>Promega</td><td>M4261</td><td>cDNAによって保護されていない一本鎖RNAの分解。</td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>in vitro転写後のキャリアDNAテンプレートの除去。</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>in vitro転写またはキャッピングからのキャリアRNAのクリーンアップ用</td></tr> 酢<tr><td>酸ナトリウム、1 M、aq.soln、pH 4.5 RNAseフリー</td><td>VWR</td><td>AAJ63669-AK</td><td>または任意のヌクレアーゼ(DNaseおよびRNase)フリー溶液</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム、1 M、aq.soln、pH 6.0 RNAseフリー</td><td></td><td></td><td>または任意のヌクレアーゼ(DNaseおよびRNase)フリー溶液</td></tr><tr><td>過ヨウ素酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td>Oxidation of vicinal diols</td></tr><tr><td>Sorenson low binding aerosol barrier tips, MicroReach Guard, 容量範囲 10 &mu;L、Graduated</td><td>Sorenson (SIGMA-ALDRICHから入手可能)</td><td>Z719390-960EA</td><td>低結合のヒント - サンプルの損失を最小限に抑えるために、プロトコル全体で使用することをお勧めします。</td></tr><tr><td>Sorenson 低結合エアロゾル バリア チップ、MultiGuard、容量範囲 1,000 &mu;L , Graduated</td><td>Sorenson (SIGMA-ALDRICHから入手可能)</td><td>Z719463-1000EA</td><td>低結合のヒント - サンプルの損失を最小限に抑えるために、プロトコル全体で使用することをお勧めします。</td></tr><tr><td>Sorenson 低結合エアロゾル バリア チップ、MultiGuard、容量範囲 20 &mu;L , Graduated</td><td>Sorenson (SIGMA-ALDRICHから入手可能)</td><td>Z719412-960EA</td><td>低結合のヒント - サンプルの損失を最小限に抑えるために、プロトコル全体で使用することをお勧めします。</td></tr><tr><td>Sorenson 低結合エアロゾル バリア チップ、MultiGuard、容量範囲 200 &mu;L , Graduated</td><td>Sorenson (SIGMA-ALDRICHから入手可能)</td><td>Z719447-960EA</td><td>低結合のヒント - サンプルの損失を最小限に抑えるために、プロトコル全体で使用することをお勧めします。</td></tr><tr><td>SpeedVac 真空濃縮器</td><td></td><td></td><td>様々なステップでサンプルを濃縮し、体積を減少させる</td></tr><tr><td>SuperScript III 逆転写酵素</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック<td>18080044</td><td>逆転写に使用(第1 CAGEステップ)</td></tr><tr><td>トレハロース/ソルビトール溶液</td><td></td><td></td><td>調製は、Murata et al. 2014に記載されています。</td></tr><tr><td>Tris-HCl、1 M aq.soln、pH 8.5</td><td></td><td></td><td>1 M溶液、DNaseおよびRNaseを含まない</td></tr><tr><td>tRNA(20 mg/mL)</td><td></td><td></td><td>tRNA溶液。調製については、Murata et al. 2014に記載されています。</td></tr><tr><td>UltraPure 低融点アガロース</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>16520050</td><td>または、適切な純粋な低融点アガロース。</td></tr><tr><td>USB Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP)</td><td>Applied Biosystems (Provided by ThermoFisher Scientific)</td><td>78390500UN</td><td></td></tr><tr><td>USER 酵素</td><td>NEB</td><td>M5505S</td><td>3'リンカーの上鎖の分解、ウラシル特異的切除試薬/酵素</td></tr><tr><td>Vaccinia キャッピングシステム</td><td>NEB</td><td>M2080S</td><td>キャリア分子のin vitroキャッピング用酵素キット</td></tr><tr><td>ウォッシュバッファーA</td><td></td><td></td><td>キャップトラッピングウォッシュ。調製については、Murata et al. 2014に記載されています。</td></tr><tr><td>ウォッシュバッファーB</td><td></td><td></td><td>キャップトラッピングウォッシュ。調製については、Murata et al. 2014に記載されています。</td></tr><tr><td>ウォッシュバッファーC</td><td></td><td></td><td>キャップトラッピングウォッシュ。調製については、Murata et al. 2014に記載されています。</td></tr></tbody></table>

超低入力キャリア-cageを使用した転写開始サイトマッピング

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

遺伝子発現のキャップ解析(CAGE)は、RNAポリメラーゼII転写開始部位(TSS)の単一ヌクレオチド分解能検出に用いられる方法である。TSSの正確な検出は、コアプロモーターの同定と発見を強化します。さらに、活性エンハンサーは、双方向転写開始のシグネチャを介して検出することができる。ここでは、超低入力キャリアケージ(SLIC-CAGE)を実行するためのプロトコルです。CAGEプロトコルのこのSLIC適応は、目的のサンプルに追加されたインビトロ転写RNAキャリアミックスの使用を通じてRNA量を人工的に増加させることによりRNA損失を最小限に抑え、合計ナノグラム量からのライブラリー調製を可能にします。RNA(すなわち、何千もの細胞)。キャリアは、予想されるDNAライブラリー断片長分布を模倣し、それによって均質なキャリアの豊富さによって引き起こされる可能性のあるバイアスを排除する。プロトコルの最後の段階では、ホーミングエンドヌクレアーゼでキャリアが分解され、ターゲットライブラリが増幅されます。標的サンプルライブラリーは、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識部位が長く(18~27bpの間)、真核ゲノム中に存在する確率が非常に低いため、劣化から保護されています。最終的な結果は、次世代シーケンシングの準備ができているDNAライブラリです。プロトコル内のすべてのステップは、シーケンスまで、6日以内に完了できます。キャリアの準備は、完全な営業日を必要とします。しかし、それは大量に調製することができ、-80 °Cで凍結保存することができます。配列決定後、読み取りを処理してゲノム全体の単一ヌクレオチド分解能TSSsを得ることができます。プロモーターに集約されると、データは 5'中心の式プロファイリングにも使用できます。

本報告では、開始総RNA材料のナノグラムからシーケンシング対応ライブラリを取得するための完全なSLIC-CAGEプロトコルについて説明します(図1)。合成RNAキャリアミックスを得るためには、まず、PCR担体を調製し、PCR副産物を排除するためにゲル精製する必要がある(図2A)。各PCRテンプレート(合計10個)は、共通のフォワードを使用して生成されますが、異なるリバースプライマー(表2)を使用して、合成RNAキャリアのサイズ変動を可能にするためにPCRテンプレートの長さが異なります。精製されると、PCRテンプレートは、キャリア分子のインビトロ転写に使用される。テンプレートがゲル精製された場合、単一のRNAキャリア産物が期待されます(図2Bの代表的なゲル分析を参照)。キャリアの調製は、必要性に応じてアップスケールすることができ、準備すると、将来の使用のために-80 °Cで混合し、凍結します。
推奨されるサンプル総RNA(10ng)の推奨最小量と16-18サイクルのPCR増幅を組み合わせることで、高い複雑性SLIC-CAGEライブラリを実現できます。最終的なライブラリーを増幅するために必要なPCRサイクルの数は、使用される入力RNAの総数に大きく依存します(予想サイクル数は表4に示されています)。
劣化の最初のラウンドの後、qPCR結果(ステップ17)では、アダプター_f1またはcarrier_f1プライマーを使用して得られたCt値の予想差は1-2であり、アダプター_f1で得られたCt値はcarrier_f1よりも低い。
最終ライブラリにおけるフラグメント長の分布は200~2,000 bpで、平均フラグメントサイズは700~900bpです(Bioanalyzerソフトウェアを使用した領域解析に基づく図4B、D)。図4A、Cに示すように、短いフラグメントは、サイズ除外の追加ラウンドによって除去されなければならない(ステップ20〜21)。これらの短いフラグメントは、対象ライブラリではなく、PCR増幅アーティファクトです。フラグメントが短いほど、シーケンス フロー セルのクラスタが向上し、シーケンスの問題が発生する可能性があることに注意してください。
サンプル当たり得られるライブラリー材料の期待量は5〜50ngの間である。有意に低い量は、プロトコル中のサンプル損失を示します。取得した低い量がシーケンスに十分である場合 (プールされたライブラリの 2 ~ 3 ng が必要)、ライブラリの複雑さが低くなる可能性があります (下記参照)。
シーケンスマシンによっては、フローセルにロードされるライブラリの量を最適化する必要がある場合があります。Illumina HiSeq 2500 を使用して、8-12 pM SLIC-CAGE ライブラリを読み込むと、平均で 150 ~ 2 億の読み取りが得られますが、読み取りの 80% が品質スコア Q30 をしきい値として渡します。
得られた読み取りは、参照ゲノムにマッピングされます [50 bp 読み取り、Bowtie212は、シード シーケンスごとのミスマッチをゼロにするデフォルト パラメータ (22 bp)] で使用できます。予想されるマッピング効率は、RNA 入力の合計量に依存し、表 5に示します。一意にマップされた読み取りは、R グラフィカルおよび統計計算環境13にロードし、CAGEr (生体伝導体パッケージ14)を使用して処理できます。パッケージビネットは簡単に追従でき、マッピングされたデータのワークフローと処理を詳細に説明します。ライブラリの複雑さの容易な視覚的制御は、低複雑性ライブラリが人工的に狭いプロモーターを持つため、プロモーター幅の分布です(図5A、SLIC-CAGEライブラリは、総RNAの1 ngから派生した、詳細については、前を参照してください)パブリケーション 10)。ただし、複雑度の低い SLIC-CAGE ライブラリでも、低/中入力 TSS マッピングの代替方法よりも高い精度で真の CTSS を識別できます (図 5B、C)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg"> 図 1:SLIC-CAGE プロトコルの手順。サンプルRNAは、全RNA材料の5μgを達成するためにRNAキャリアミックスと混合される。cDNAは、逆転写を介して合成され、キャップは、ナトリウム周期を使用して酸化されます。酸化は、ビオチンヒドラジドを使用してキャップにビオチンの添付を可能にします。ビオチンは、周期ナトリウムを使用して酸化されるので、mRNAの3′末端に付着します。mRNA:cDNAを不完全に合成したcDNAとmRNAの3′末端からビオチンを排除するために、サンプルはmRNAの5′末端に達したRNase I.cDNAで処理され、次にストレプトアビジン磁気ビーズの親和性精製によって選択されます(キャップトラップ)。cDNAの放出後、5'-および3'リンカーがライゲーションされる。キャリアに由来するライブラリー分子は、I-SceIおよびI-CeuIホーミングエンドヌクレアーゼを使用して分解され、断片はSPRI磁気ビーズを使用して除去されます。その後、ライブラリはPCR増幅されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg"> 図2:インビトロ転写におけるキャリアPCRテンプレートおよびキャリアの代表的なゲル分析。(A)ゲル精製前のキャリアPCRテンプレート:第1ウェルは1kbpマーカーを含み、続いてキャリアPCRテンプレート1、1〜10が続く。(B)インビトロ転写物中のキャリア:第1のウェルは1kbpマーカーを含み、続いてキャリア転写物1〜10が続く。キャリア転写物は、積載前に95°Cで5分間加熱することにより変性した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg"> 図3:キャリア劣化の第1ラウンド前のSLIC-CAGEの代表的なDNA品質(高感度DNAチップ)の痕跡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg"> 図4:PCR増幅後のSLIC-CAGEライブラリーの代表的なDNA品質(高感度DNAチップ)の痕跡。(A) SLIC-CAGE ライブラリで、短いフラグメントを削除するために追加のサイズ選択が必要です。(B) SLIC-CAGE ライブラリ 0.6x SPRI ビーズを使用してサンプル比を使用してサイズ選択後。(C) SLIC-CAGE ※短いフラグメントの除去にサイズ選択が必要な出力量が少ない。(D) SLIC-CAGEライブラリは、0.6:1 SPRIビーズをサンプル比に使用してサイズ選択後の出力量が少ない。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg"> 図 5:SLIC-CAGE ライブラリの検証。(A) SLIC-CAGEライブラリーにおけるタグクラスター間質幅の分布は、S.セレビシエ総RNAの1、5、または10ngから調製し、およびS.セレビシエ総RNAの5μgから調製されたnAnT-iCAGEライブラリー内で。1 ng SLIC-CAGE ライブラリ内の狭いタグ クラスタの量が多い場合は、その複雑さが低いことを示します。(B) S. セレビシエSLIC-CAGE ライブラリーにおける CTSS 識別のための ROC 曲線。すべてのS. セレビシエnAnT-iCAGE CTSSS が真のセットとして使用されました。(C) S.セレビシエナノケージライブラリーにおけるCTSS同定のためのROC曲線。すべてのS. セレビシエnAnT-iCAGE CTSSS が真のセットとして使用されました。ROC曲線の比較は、SLIC-CAGEがCTSS同定においてナノケージを強く上回っていることを示している。アレイエクスプレスE-MTAB-6519からのデータが使用されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:担体合成遺伝子の配列。I-SceI サイトは太字で紫色で斜体化され、I-CeuI 認識サイトは緑色です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>キャリア</td>
			<td colspan="2">リバースプライマー 5'-3'</td>
			<td>PCR 製品の長さ / bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NnNNNNNCTACGTCGCAGAAATT</td>
			<td>1034年</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966の</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NnNNNCACTGGGGCTCTCTTTACG</td>
			<td>889の</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NnNNNGCCGTCACTTTCGTTCGT</td>
			<td>821の</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NnNNNNNNナグットガットガガグトCTTC</td>
			<td>744の</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAGAGAGAATTTTTCCCA</td>
			<td>676の</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTAAC</td>
			<td>599の</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNNNNNTCGCGGTGTCGTAC</td>
			<td>531の</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCCGCGCCCCGCAGG</td>
			<td>454名</td>
		</tr>
<tr>
<td>10歳</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNAGAGGGCGTTTTGCCCCA</td>
			<td>386の</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">*フォワードプライマーは、すべてのキャリアテンプレートで同じです。下線が引かれているのはT7プロモーターシーケンスです。PCR_GN5_f1: タアダクアクトカタニャンNNCAGCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: キャリア テンプレート増幅用のプライマー。フォワード プライマーは、すべてのキャリア テンプレートで同じです。下線が引かれているのはT7プロモーターシーケンスです。PCR_GN5_f1:タアタクアクトカッタGNNNCAGCGTTCGCTA.異なるリバースプライマーを使用して、PCRテンプレート、したがって、異なる長さのキャリアRNAが生成されます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>キャリア</td>
			<td>長さ</td>
			<td>上限なし/μg</td>
			<td>上限/μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>1034年</td>
			<td>3.96件</td>
			<td>0.45分</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>966の</td>
			<td>8.36件</td>
			<td>0.95件</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>889の</td>
			<td>4.4年</td>
			<td>0.5年</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>821の</td>
			<td>6.6年</td>
			<td>0.75年</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>744の</td>
			<td>4.4年</td>
			<td>0.5年</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>676の</td>
			<td>3.08件</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>599の</td>
			<td>4.4年</td>
			<td>0.5年</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>531の</td>
			<td>3.96件</td>
			<td>0.45分</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>454名</td>
			<td>2.64から</td>
			<td>0.3年</td>
		</tr>
<tr>
<td>10歳</td>
			<td>386の</td>
			<td>2.2年</td>
			<td>0.25分</td>
		</tr>
</tbody></table>表3:RNAキャリアミックス。キャリアミックス0.3-1 kbpの合計49 μg:上限なし= 44 μg、キャップ= 5 μg。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>合計 RNA 入力 /ng</td>
			<td>PCR サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>18歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>17歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>16歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>15-16日</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>14-15日</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>13-15日</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>12-14日</td>
		</tr>
</tbody></table>表 4:サンプル総RNA入力の依存性におけるPCRサイクルの予想数。概算サイクル数は、サッカロマイセスセレビシエ、ショウジョウバエメラノガスター、およびマスマス全RNAを用いて行われた実験に基づいている。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>合計 RNA 入力/ng</td>
			<td>全体マップ率</td>
			<td>% 一意にマップ</td>
			<td>% キャリア</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 ng</td>
			<td>30歳</td>
			<td>20-30日</td>
			<td>30歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ng</td>
			<td>60歳</td>
			<td>20から50</td>
			<td>10歳</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 ng</td>
			<td>60から70</td>
			<td>40から60</td>
			<td>5-10日</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 ng</td>
			<td>60から70</td>
			<td>40から60</td>
			<td>5-10日</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 ng</td>
			<td>65から80</td>
			<td>40から70</td>
			<td>0~5</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 ng</td>
			<td>65から80</td>
			<td>40から70</td>
			<td>0~3</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 ng</td>
			<td>70から85</td>
			<td>40から70</td>
			<td>0~2</td>
		</tr>
</tbody></table>表5:予想されるマッピング効率と総RNA入力量の依存性について。おおよその数が提示され、サッカロマイセスセレビシエとムスムスルムス総RNAを用いて行われた実験に基づいて提示される。

遺伝子発現のキャップ解析(CAGE)は、単一ヌクレオチド分解能でRNAポリメラーゼII転写開始部位を捕捉するためにmRNA5'端部のゲノム全体の定量マッピングのための方法である。本研究では、総RNAのナノグラム量を用いて高品質なライブラリを生成するための低入力(SLIC-CAGE)プロトコルについて述べている。

超低入力キャリア-CAGEを使用した転写開始サイトマッピング

Cap analysis of gene expression (CAGE) is a method used for single-nucleotide resolution detection of RNA polymerase II transcription start sites (TSSs). ...

この方法は、低量の出発物質を使用してコアプロモーターおよびエンハンサー発見を可能にするため、遺伝子調節の分野における主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、全RNAの10ナノグラムのみを使用してRNAポリメラーゼII転写開始部位の公平な、ゲノム全体の単一ヌクレオチド分解能マッピングを可能にすることです。CAGEは、診断マーカーとして使用できる疾患関連の転写開始部位を明らかにするのに非常に貴重であることが証明されています。SLIC-CAGEは、これらの発見を拡張して、組織生検などのサンプルをスケーリングします。SLIC-CAGEは、初期の胚発生段階または幅広いモデル生物からの胚組織を含む虚弱細胞タイプの詳細かつ高解像度プロモーター分析に理想的です。このプロトコルには多数のステップがあるため、チューブ間を移動する際にできるだけ多くの材料を取り出すように注意して、各ステップでサンプル損失を最小限に抑えることが重要です。まず、各テンプレートに PCR ミックスを準備します。バッファー、dNTP、ユニークなフォワードプライマー、鋳型プラスミドと合成キャリア遺伝子、および原稿の指示に従った融合ポリメラーゼを組み合わせます。ピペットによる試薬を混合する。各リバースプライマーの10マイクロリットルにPCRミックスの90マイクロリットルを加え、混合します。サーモサイクリングの条件については、原稿を参照してください。目的のRNAに対して逆転写またはRTを行う。1マイクロリットルの逆転写プライマー、10ナノグラムのRNA、および4,990ナノグラムのキャリアミックスを合計10マイクロリットルで組み合わせます。上下にピペットを入れ、混ぜます。混合物を摂氏65度に5分間加熱し、すぐに氷の上に置きます。原稿の方向に従ってRTミックスを準備し、RNAの10マイクロリットルにミックスの28マイクロリットルを追加します。均質になるまでピペッティングしてチューブの内容物を混ぜます。サーモサイクラーでRTを実行します。逆転写が完了したら、DNaseおよびRNaseフリーのSPRI磁気ビーズで製品を精製します。1.8対1の体積比でRTミックスにビーズを追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を室温で5分間座らせます。その後、ビーズを磁気スタンドに置き、5分間分離させます。上清を捨て、作りたての70%エタノールを200マイクロリットルをビーズに加えます。ビーズを混ぜたり、磁気スタンドから取り出したり、添加後すぐにエタノールを取り除いたりしないでください。チューブを磁気スタンドに置き、残りの液滴をP10ピペットで押し出してエタノールの痕跡をすべて取り除いてください。42マイクロリットルの水を即時に加え、ピペットを60回上下して溶出サンプルに加え、発泡を引き起こさないのに注意してください。蓋を付けずに5分間摂氏37度でチューブをインキュベートし、磁気スタンドのビーズを分離します。その後、上清を新しいチューブのセットに移し、すべての上清を取り出すが、ビーズの持ち越しを避けるように注意してください。RNase I処理後、45マイクロリットルのサンプルを105マイクロリットルのストレプトアビジンビーズと混合し、37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション中、10分ごとにサンプルをピペットして混合する。次に、磁気スタンドのビーズを分離し、上清を取り除きます。バッファーA、B、C.バッファAでビーズを洗い、150マイクロリットルのバッファーでビーズを再懸濁します。磁気スタンドで2~3分分分離し、上清を取り外します。バッファBとCを摂氏37度に予熱し、洗浄手順を繰り返します。すべての非キャップRNAを除去するには、ストレプトアビジンビーズとチューブウォールを十分に洗浄し、次のものを追加する前に洗浄バッファーを完全に取り除くすることが重要です。cDNAを放出するには、ビーズを1X RNase Iバッファーの35マイクロリットルで再懸濁し、摂氏95度で5分間インキュベートします。インキュベーション後、すぐにビーズを氷の上に2分間置きます。磁気スタンドのビーズを分離し、上清を新しいチューブセットに移します。ビーズを1X RNase Iバッファの30マイクロリットルに再懸濁し、磁気スタンドで分離します。上清と以前に収集した上清を組み合わせて、合計容量は約65マイクロリットルです。qPCR を実行して、ターゲットライブラリ増幅の PCR サイクル数を決定します。キャリアからDNAのライブラリー全体を増幅するためにqPCRマスターミックスを準備します。原稿の方向に従ってサーモサイクリング条件を設定し、準備したサンプルを増幅します。SLIC-CAGEプロトコルは開始RNA材料のナノグラムからシーケンシング対応ライブラリを得ることを可能にする。最終ライブラリのフラグメント長は、200 から 2,000 の基本ペアの範囲です。短いフラグメントは PCR アーティファクトであり、行の下にシーケンスの問題を引き起こす可能性があります。サイズ選択の追加ラウンドを実行して、サイズを削除できます。NanoCAGEと比較して、SLIC-CAGEは転写開始部位同定において有意に優れた性能を示し、これはS.cerevisiae総RNAの様々な量に対して行われた2つの技術の特性曲線を操作する受信機から明らかである。このプロトコルを実行する際は、サンプルの損失が複雑性の低いライブラリにつながる可能性があることを念頭に置いておく必要があります。それを防ぐために、低結合ピペットの先端および管を使用しなければならない。SLIC-CAGEがなければ、様々な細胞タイプのプロモーター分析は、これまでアクセスできないです。これには、幅広いモデル生物からの胚発生期または胚組織の分析が含まれる。

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