超低入力キャリア-CAGEを使用した転写開始サイトマッピング

この方法は、低量の出発物質を使用してコアプロモーターおよびエンハンサー発見を可能にするため、遺伝子調節の分野における主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、全RNAの10ナノグラムのみを使用してRNAポリメラーゼII転写開始部位の公平な、ゲノム全体の単一ヌクレオチド分解能マッピングを可能にすることです。CAGEは、診断マーカーとして使用できる疾患関連の転写開始部位を明らかにするのに非常に貴重であることが証明されています。

SLIC-CAGEは、これらの発見を拡張して、組織生検などのサンプルをスケーリングします。SLIC-CAGEは、初期の胚発生段階または幅広いモデル生物からの胚組織を含む虚弱細胞タイプの詳細かつ高解像度プロモーター分析に理想的です。このプロトコルには多数のステップがあるため、チューブ間を移動する際にできるだけ多くの材料を取り出すように注意して、各ステップでサンプル損失を最小限に抑えることが重要です。

まず、各テンプレートに PCR ミックスを準備します。バッファー、dNTP、ユニークなフォワードプライマー、鋳型プラスミドと合成キャリア遺伝子、および原稿の指示に従った融合ポリメラーゼを組み合わせます。ピペットによる試薬を混合する。

各リバースプライマーの10マイクロリットルにPCRミックスの90マイクロリットルを加え、混合します。サーモサイクリングの条件については、原稿を参照してください。目的のRNAに対して逆転写またはRTを行う。

1マイクロリットルの逆転写プライマー、10ナノグラムのRNA、および4,990ナノグラムのキャリアミックスを合計10マイクロリットルで組み合わせます。上下にピペットを入れ、混ぜます。混合物を摂氏65度に5分間加熱し、すぐに氷の上に置きます。

原稿の方向に従ってRTミックスを準備し、RNAの10マイクロリットルにミックスの28マイクロリットルを追加します。均質になるまでピペッティングしてチューブの内容物を混ぜます。サーモサイクラーでRTを実行します。

逆転写が完了したら、DNaseおよびRNaseフリーのSPRI磁気ビーズで製品を精製します。1.8対1の体積比でRTミックスにビーズを追加し、ピペットでよく混ぜます。混合物を室温で5分間座らせます。

その後、ビーズを磁気スタンドに置き、5分間分離させます。上清を捨て、作りたての70%エタノールを200マイクロリットルをビーズに加えます。ビーズを混ぜたり、磁気スタンドから取り出したり、添加後すぐにエタノールを取り除いたりしないでください。

チューブを磁気スタンドに置き、残りの液滴をP10ピペットで押し出してエタノールの痕跡をすべて取り除いてください。42マイクロリットルの水を即時に加え、ピペットを60回上下して溶出サンプルに加え、発泡を引き起こさないのに注意してください。蓋を付けずに5分間摂氏37度でチューブをインキュベートし、磁気スタンドのビーズを分離します。

その後、上清を新しいチューブのセットに移し、すべての上清を取り出すが、ビーズの持ち越しを避けるように注意してください。RNase I処理後、45マイクロリットルのサンプルを105マイクロリットルのストレプトアビジンビーズと混合し、37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション中、10分ごとにサンプルをピペットして混合する。

次に、磁気スタンドのビーズを分離し、上清を取り除きます。バッファーA、B、C.バッファAでビーズを洗い、150マイクロリットルのバッファーでビーズを再懸濁します。磁気スタンドで2~3分分分離し、上清を取り外します。

バッファBとCを摂氏37度に予熱し、洗浄手順を繰り返します。すべての非キャップRNAを除去するには、ストレプトアビジンビーズとチューブウォールを十分に洗浄し、次のものを追加する前に洗浄バッファーを完全に取り除くすることが重要です。cDNAを放出するには、ビーズを1X RNase Iバッファーの35マイクロリットルで再懸濁し、摂氏95度で5分間インキュベートします。

インキュベーション後、すぐにビーズを氷の上に2分間置きます。磁気スタンドのビーズを分離し、上清を新しいチューブセットに移します。ビーズを1X RNase Iバッファの30マイクロリットルに再懸濁し、磁気スタンドで分離します。

上清と以前に収集した上清を組み合わせて、合計容量は約65マイクロリットルです。qPCR を実行して、ターゲットライブラリ増幅の PCR サイクル数を決定します。キャリアからDNAのライブラリー全体を増幅するためにqPCRマスターミックスを準備します。

原稿の方向に従ってサーモサイクリング条件を設定し、準備したサンプルを増幅します。SLIC-CAGEプロトコルは開始RNA材料のナノグラムからシーケンシング対応ライブラリを得ることを可能にする。最終ライブラリのフラグメント長は、200 から 2,000 の基本ペアの範囲です。

短いフラグメントは PCR アーティファクトであり、行の下にシーケンスの問題を引き起こす可能性があります。サイズ選択の追加ラウンドを実行して、サイズを削除できます。NanoCAGEと比較して、SLIC-CAGEは転写開始部位同定において有意に優れた性能を示し、これはS.cerevisiae総RNAの様々な量に対して行われた2つの技術の特性曲線を操作する受信機から明らかである。

このプロトコルを実行する際は、サンプルの損失が複雑性の低いライブラリにつながる可能性があることを念頭に置いておく必要があります。それを防ぐために、低結合ピペットの先端および管を使用しなければならない。SLIC-CAGEがなければ、様々な細胞タイプのプロモーター分析は、これまでアクセスできないです。

これには、幅広いモデル生物からの胚発生期または胚組織の分析が含まれる。