Name: がん研究における治療・診断抗体生体分布の評価のための生体内免疫蛍光局所法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶ 生体内免疫蛍光局所法（IVIL）を用いて、がん研究における治療・診断抗体の生体分布を評価する方法。この技術はリアルタイムで抗体動態を可視化し、がん治療薬の有効性評価に貢献します。

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ディスカッションと機器の使用に関して、アンドリュー・オルソン博士(スタンフォード神経科学顕微鏡サービス)に感謝します。ユルゲン・K・ウィルマン博士の指導に感謝します。本研究は、NIH R21EB022214助成金(KEW)、NIH R25CA118681研修助成(KEW)、およびNIH K99EB023279(KEW)によって支援されました。スタンフォード神経科学顕微鏡検査サービスはNIH NS069375によってサポートされました。

ここに記載されているすべての方法は、スタンフォード大学の実験室動物ケア(APLAC)に関する機関行政委員会によって承認されています。
乳癌発症のトランスジェニックマウスモデル
<ol><li>先に進む前に触診またはキャリパー測定を介して適切な腫瘍増殖のための所望の癌モデルからマウスを観察する。 注:ここでは、乳癌発症のトランスジェニックマウスモデル(FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J)(MMTV-PyMT)を用いた。これらの動物は、各乳腺20の生後6~12週の間に自発的に浸潤性乳癌を発症する。正常な乳腺は、トランスジーン陰性、年齢に一致したリターメイトからのコントロールとして使用された。</li>
</ol>2. 特異的および非特異的抗体剤の静脈内注射
<ol><li>脱塩カラム(例えば、PD-10)上のウサギの抗マウスB7-H3およびウサギIgGアイソタイプコントロール抗体を精製し、製造元の指示に従って防腐剤および貯蔵バッファーを除去する。 注:一部の抗体は、タンパク質Aアガロースビーズベースのプロトコル21でさらなる精製を必要とする場合があります。</li>
	<li>個々のマイクロ遠心管における各抗体共重ゲートの33μgのアリコト用量。 注:投与剤の投与量は、用途に応じて変化し、抗体コンジュゲートが日常的に使用される用量と一致する。体積が動物の安全性のために100 μLを超える場合は、抗体溶液の濃度が必要です。</li>
	<li>組織採取前の所望の時点で、ここで96時間、2%のイソファルランで腫瘍ベアリング動物を麻酔し、2L/minで酸素中に流れるイソムランを、37°C加熱ステージ上に置く。手順の前に麻酔の適切なレベルに達していることを確認するためにつま先のピンチを行います。</li>
	<li>抗体溶液の尾静脈接種に備え、アルコール拭きで3回拭き取って動物の尾を消毒する。約30sのヒートパッドで加熱することにより、尾静脈を拡張し、動物全体を加熱しないようにします。ヒートパッドを取り外した後、アルコール拭きでもう一度尾を拭きます。</li>
	<li>27G尾静脈カテーテルを使用して、2つの横尾静脈のいずれかに蝶の針を挿入し、慎重に外科テープの一部でステージに挿入された針で尾を固定します。 注:カテーテルへの目に見える血流は尾静脈内の針の適切な位置を示す。</li>
	<li>無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)の25μLでカテーテルをフラッシュし、インスリン注射器を使用してカテーテルに抗体溶液を注入する。無菌PBSの25 μLでカテーテルをもう一度洗い流します。</li>
	<li>尾から針を取り出し、出血を止めるために圧力をかけます。</li>
	<li>麻酔をオフにし、苦痛の兆候のために完全に目を覚ますまで動物を観察します。</li>
</ol>3. 標的腫瘍組織の採取と調製
<ol><li>所望の時点で、許容される制度的手順に従って動物を人道的に安楽死させ、ここでは、室内変位流量10〜30%の圧縮ガスタンクから100%CO2を徐々に吸入することによって、体積/分の室変位流量を有する。 注:IVIL技術の一部のアプリケーションは、自由に循環する抗体19、22を除去するためにPBSとの心臓灌流による安楽死を必要とする。</li>
	<li>呼吸および心臓運動の停止、つま先のつまみ応答の欠如、粘膜の灰色化を通じて人道的安楽死を確認した後、外科用はさみと鉗子を用いて腫瘍組織を切除する。<ol>
<li>マウスを上皮の位置に置き、尾に最も近い乳腺のセット(5番目)の間の皮膚の外側の層だけを鉗子でつかみ、外科はさみで小さな切開を行う。</li>
		<li>カットに閉じたはさみを導入し、ゆっくりと先端を開き、皮膚を下層の腹壁膜から慎重に分離し、そのままにします。</li>
		<li>腹部を上に垂直切開し、皮膚を内膜から分離し続ける。第3および第4の乳腺の間で、皮膚の引き込みと乳腺の視覚化を可能にするために腹部を横切って水平方向のカットを行う。 注:乳腺腫瘍および腺は皮膚の下に表面的に位置する。</li>
		<li>鉗子で各腫瘍または正常腺をつかむ, 慎重に外科はさみを使用して付属の皮膚をトリミング.</li>
	</ol>
</li>
	<li>切除された組織を組織の使い捨てベース金型に入れ、あらかじめ標識し、最適な切断温度(OCT)埋め込み媒体で充填し、ドライアイス上に配置することにより、金型を迅速に凍結します。オフターゲット分娩を研究するために、他の組織または目的の器官(例えば、肝臓または肺)を切除する。 注:この時点でプロトコルを一時停止するには、続行する準備ができるまで-80 °Cで凍結組織ブロックを保管してください。</li>
	<li>クライオスタットを使用して、セクション凍結組織ブロックを10 μmの厚さでブロックし、隣接するセクションをあらかじめラベル付けされた接着ガラススライドに配置します。 注: この時点でプロトコルを一時停止するには、続行する準備ができるまで-80 °C にスライドを保存します。</li>
</ol>4. 生体染色プロトコル
注:蛍光顕微鏡画像間の定量的比較のために、すべてのスライドは、同じ準備された溶液と同時に染色されます。
<ol><li>OCTを除去するために5分間室温PBSで凍結組織スライドをすすいでください。</li>
	<li>疎水性バリアペンで組織切片を脱臼し、染色に必要な溶液の量を減らします。 注:ペンがスライドから組織を取り除いたり、影響を受けた組織部分に適切な染色を防ぐことができるので、ペンが組織サンプルの上を走らないように注意してください。組織のセクションが任意の時点で脱水しないようにしてください。</li>
	<li>4%のパラホルムアルデヒド溶液で組織切片を5分間固定します。</li>
	<li>PBSで5分間スライドをすすいで下します。</li>
	<li>PBSで0.5%のトリトン-X 100で組織切片を15分間透過化する。</li>
	<li>PBSで5分間スライドをすすいで下します。</li>
	<li>3%w/vウシ血清アルブミン(BSA)および5%v/vヤギ血清で組織をブロックし、両方とも室温で1時間PBS(ブロッキング溶液)で。 注:ブロッキング溶液血清を二次抗体宿主動物と一致させる。</li>
	<li>PBSで5分間スライドをすすいで下します。</li>
	<li>所望に従って記録保持一次抗体を有する切片をインキュベートし、おそらく一般的な核(例えば、DAPI)、血管(例えば、CD31)、または細胞質マーカー(例えば、アクチン)である。ここで、1:100希釈時のラット抗マウスCD31(血管マーカー)を、スライドトレイ上の脱水から保護された4°Cで一晩ブロッキング溶液中のメーカーの指示に従って用いた。 注:追加の一次抗体または抗体コンジュゲートを追加しないでください。注入し、生体内の組織に蓄積させたコンジュゲートは、一次抗体として作用する。</li>
	<li>PBSで5分間3回スライドし、毎回PBSを変更します。</li>
	<li>二次抗体を使用してスライドをインキュベートし、一次抗体を標識します。本アプリケーションでは、AlexaFluor-546共役ヤギ抗ウサギ抗体(1:200希釈、メーカーの指示に従って最適化)とCD31をAlexaFluor-488ヤギ抗ラット二次抗体(1:200)を用いて可視化します。希釈は、ブロッキング溶液中の製造元の指示に従って最適化され、スライドトレイ上の光および脱水から保護され、室温で1時間。 注:二次抗体は、同じ宿主動物由来であるが、それぞれの一次抗体の宿主種に対する二次抗体の親和性と一致する。スライドは、この時点以降の光から保護されます。</li>
	<li>PBSで5分間3回スライドし、毎回PBSを変更します。</li>
	<li>取り付け媒体をティッシュスライスの中心に1滴ずつ塗布し、気泡の閉じ込めを避けてカバースリップを慎重に配置します。</li>
	<li>明確なマニキュアでカバースリップの端をシールし、乾燥させます。 注: この時点でプロトコルを最大 1 週間一時停止するには、スライドを -20 °C に保存し、続行する準備が整いました。</li>
</ol>5. 共焦点顕微鏡イメージングと定量画像解析
注:共焦点顕微鏡およびイメージングパラメータの準備は、使用する共焦点システムによって異なります。ここで使用される顕微鏡は市販品(例えば、ツァイスLSM510メタシステム)を購入し、関連する取得ソフトウェア(例えば、Zen 2009)を使用した。しかし、これらのステップの多くは、任意の共焦点顕微鏡に適用され、基本的な共焦点顕微鏡の知識を仮定します。
<ol><li>システムの電源を入れ、ウォームアップした後、目的の目的を選択します。ここでは、20倍(数値絞り= 0.8)の目的を使用しました。</li>
	<li>正のコントロールスライドをロードし、カバースリップダウンし、最も明るい信号の最適化を設定できるようにします。赤いチャネルでのイメージングは、ライブイメージングモードでサンプルにシステムを集中させます。</li>
	<li>使用するレーザー チャネルごとに、レーザー強度、マスター ゲイン、およびピンホール サイズを次のように最適化します。<ol>
<li>イメージング用の連続モードに切り替えます。</li>
		<li>ルックアップテーブル(LUT)ヒストグラムを監視しながら、レーザー強度(レーザーパワーを制御する)とゲイン(光増量管の電圧を制御するマスター)スライドバーを最適化します。ヒストグラムのダイナミックレンジがピクセルを飽和させることなく塗りつぶされるまで、これら 2 つの設定を調整します。 注:レーザー強度が高すぎると光漂白が発生します。ゲイン(マスター)が高すぎると、画像がノイズになります。理想的には、ゲイン(マスター)はその範囲の中央になります。</li>
		<li>ピンホールを1つの風通しの良いユニット(AU)に設定し、最も高い解像度と最も薄いZスライスを与えます。</li>
		<li>デジタルオフセットバーをスライドさせて、LUT ヒストグラムのノイズフロアを最小限に抑え、真の黒い背景を表示します。 注:顕微鏡検査の設定が各レーザーチャネルと目的に合わせて最適化されたら、イメージングセッション全体とすべてのスライドのイメージングのためにそれらを一定に保ち、スライド間の定量的な比較を可能にします。</li>
	</ol></li>
	<li>[取得モード]タブで、[平均化]で、目的の数値とビット深度を選択します。最適なボタンをクリックして、最適なピクセルサイズを設定します。</li>
	<li>[スナップ取得] ボタンを使用して、高品質のイメージを収集します。ここでは、腫瘍内からランダムな視野を選択したが、他の対象領域は、異なる用途(血管、腫瘍マージン、浸透深さなど)に適用される場合があります。</li>
	<li>オフライン処理と定量化のために、共焦点ソフトウェア(ここでは「.lsm」)で使用される形式で画像ファイルを保存します。 注: すべてのスライドが同じセッション中にイメージ化されていない場合は、設定を保存して後続の訪問時に再読み込みしますが、同じスライドを再撮影することは、光の漂白のためにお勧めしません。</li>
	<li>定量蛍光強度測定を行います。フィジー(フィジーはジャストイメージJソフトウェア)19、23を開き、ステータスバーにドラッグして.lsmイメージファイルをロードします。</li>
	<li>カラー チャンネル データを分割します。イメージ> スタック > スプリット チャンネルに移動します。</li>
	<li>必要に応じて蛍光画像を前処理し、バックグラウンド信号(プロセス>バックグラウンドを減算)を減らすか、フィルタリング方法を使用してノイズを低減します。</li>
	<li>信号強度にしきい値を設定して、参照タンパク質(血管、核、細胞染色)に対応するカラーチャネルをセグメント化します(画像> 調整> しきい値)。 注: 手動しきい値化では、画像分析に主観性がもとなるため、自動しきい値アルゴリズムまたは参照イメージヒストグラムを使用すると、画像解析結果の偏りが少なくなります。</li>
	<li>このしきい値を使用してバイナリ マスク (プロセス > バイナリ > マスクに変換) を作成します。</li>
	<li>マスク内の ROI を測定してラベル付けする(> パーティクルの分析 > [マネージャに追加] をオンにします)。</li>
	<li>対象の抗体に対応するカラーチャネルにROIを適用する(チャンネル画像をクリックし、分析>ツール> ROIマネージャ> メジャー)。これにより、マスクROIを抗体画像に適用し、[結果]ウィンドウの標識セクションの画像測定を提供します。結果ウィンドウを保存します (ファイル > 保存)。</li>
	<li>ここで24に説明する平均蛍光強度などの目的の所望の統計量を計算する。</li>
	<li>一連のスライド内の各イメージと同じ処理手順を実行します。マクロを作成して、大きなイメージ バッチ23に対してこれを自動的に行います。</li>
	<li>定量的な測定後にのみ画像表示を行う場合は、すべてのスライドで最小、最大、明るさ、コントラストを同じレベルに調整して、生物分布パターンの視覚化を最適化する定性的な画像調整を適用します(画像> 調整)> 明るさ/コントラスト)</li>
	<li>イメージの種類 (イメージ > タイプ > RGB カラー)を変換し、プレゼンテーションやパブリケーションで使用するために、.tiff (ファイル > 保存 As > Tiff...</li>
</ol>

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<li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Fluorescence+Immunohistochemistry%3A+Localization+of+Fluorescently+Labeled+Cetuximab+in+Squamous+Cell+Carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+resistance+to+immune+checkpoint+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors.</a> British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).</li>
<li>Rexer, B. N., Arteaga, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+acquired+resistance+to+HER2-targeted+therapies+in+HER2+gene-amplified+breast+cancer%3A+mechanisms+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications.</a> Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

この方法には、いくつかの重要な手順があり、実装を成功させるために潜在的な変更が必要です。まず、抗体/抗体コンジュゲート静脈内注射の投与量およびタイミングは、特定の用途に合わせて調整されなければならない。一般に、抗体コンジュゲートが一般的に使用される方法、すなわち、治療用抗体または抗体ベースの造影剤の一致する用量と一致する用量を使用すべきである。また、標的組織の採取時期も慎重に検討する必要があります。抗体および抗体コンジュゲートは、標準的な薬剤および造影剤よりも長い循環時間を持っていますが、これらは非常に可変であり、所望の用途に最適化されるべきですが、少なくとも24時間の循環時間27を許可することをお勧めします。.第2に、標的組織採取の間に、血液プール19から自由に循環する抗体を除去する心内灌流技術を実施することが必要でありよい。B7-H3-ICGの腫瘍分布を見ていると、十分に長い循環時間(96時間)と薬剤の血管局在化のために不要であることが判明した。しかし、IVIL法のnetrin-1の適用については、心灌流は、ネトリン-1の内皮発現及びその...

モノクローナル抗体(mAb)は、B細胞によって分泌され、免疫系の主要な機能を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの大きな糖タンパク質(約150 kDa)であり、生物学的機能を同定し阻害するか、または破壊、細菌またはウイルス病原体、および癌細胞1上の異常なタンパク質発現を認識することができる。抗体は、その特異的なエピトープからフェムトモラー濃度まで非常に高い親和性を有し、生物医学2において非常に有望なツールを作ることができる。ミルシュタインとケーラー(1984年にノーベル賞を受賞)によるハイブリドーマ技術の開発により、mAbsの生産が可能になりました3.その後、ヒトmAbsはファージディスプレイ技術またはトランスジェニックマウス株を用いて生成され、新規研究ツールおよび治療薬としての使用に革命を起こし、4,5.
がんは世界的な健康問題であり、予防、検出、治療のための新しいアプローチの必要性を生み出す主な死因6である。現在までに、mAbsは腫瘍形成における遺伝子およびそのタンパク質の役割の駆除を可能にし、癌バイオマーカーに対して指示された場合、患者の層形成のための腫瘍検出および特徴付けを可能にすることができる。がん治療では、二重特異性mAbs、抗体薬物コンジュゲート、およびより小さな抗体断片が治療薬として開発され、および治療有効性を高める標的薬物送達のために7.さらに、抗体は、蛍光誘導手術、光音響(PA)イメージング、超音波(米国)分子イメージング、臨床的に使用される陽電子放出などの分子イメージングモダリティに対する造影剤のバイオマーカーターゲティングに役立ちます。断層撮影(PET)または単一光子発光体コンピュータ断層撮影(SPECT)8.最後に、抗体は、標的治療9に対する患者の階層化および応答モニタリングを可能にするセラノスティック剤としても使用することができる。したがって、新しいmAbsは、がんの検出、診断、および治療において重要な役割を果たし始めています。
新規および非常に特異的なmAbsの開発および生産の重要な進歩にもかかわらず、診断および治療の適用は腫瘍環境の複雑さのために無効にすることができる。抗体相互作用は、エピトープの種類、すなわち、線形か立体構造10のいずれに依存する。抗原の認識に加えて、抗体は、抗原を発現する標的細胞に到達するために、血管壁、基底膜、腫瘍間質などの自然な障壁を克服する必要があります。抗体は、可変フラグメントメント抗原結合(Fab)ドメインを介してだけでなく、さらにオフサイト相互作用につながる一定結晶性断片(Fc)を介して組織と相互作用する11。標的化はまた、腫瘍血管化およびリンパ系12、13における腫瘍バルクおよび不均一性全体の腫瘍マーカーの不均一発現によっても複雑である。さらに、腫瘍微小環境は、腫瘍細胞を支えるがん関連線維芽細胞、抗腫瘍免疫反応を抑制する腫瘍免疫細胞、酸素や栄養素の輸送をサポートする腫瘍内皮で構成されています。抗体ベースの治療薬または診断の浸透、分布、および入手可能性を妨げる。全体的に、これらの考慮事項は、治療または診断の有効性を制限し、治療応答を減少させることができ、腫瘍抵抗性をもたらす可能性があります。
したがって、効率的な抗体ベースの治療および診断の開発のためには、腫瘍微小環境内における抗体ベースのコンジュゲートの生体分布および相互作用を評価することが重要である。現在、前臨床試験において、腫瘍研究モデルにおけるマーカー発現は、腫瘍セクション14の免疫蛍光(IF)染色によりexvivoを分析する。標準的なIF染色は、一次マーカー特異的抗体で行われ、その後、動物から単離された生体内腫瘍組織スライス上の二次蛍光標識抗体によって強調表示される。この技術は、組織固定時のマーカーの静的位置を強調し、抗体ベースの治療薬または診断が生理学的条件でどのように分配または相互作用するかについての洞察を提供しない。PET、SPECT、米国、およびPAによる分子イメージングは、生きている前臨床モデル8、15における抗体共役造影剤分布に関する情報を提供することができる。これらのイメージングモダリティは非侵襲的なので、縦方向の研究を行うことができ、時間に敏感なデータをグループあたり最小限の数の動物で収集することができます。しかし、これらの非侵襲的な分子イメージングアプローチは十分に敏感ではなく、細胞レベルでの抗体分布の局在化のための十分な分解能を有していない。さらに、一次抗体の物理的および生物学的特性は、造影剤16の結合によって劇的に変化してもよい。
抗体ベースの治療と診断が腫瘍環境内でどのように相互作用するかを考慮し、高分解能細胞および細胞下分布を得るために、生体内の生理的および病理学的状態を考慮するために非共役抗体のプロファイルは、抗原特異的抗体が生体内に静脈内に注入される生体内免疫蛍光局在化(IVIL)とみなされるIFアプローチを提案する。抗体ベースの治療または診断は、一次抗体として作用し、機能性血管内を循環し、高精度で生きている腫瘍環境で標的タンパク質に結合する。一次抗体を用いて生体内の腫瘍を単離した後、二次抗体を用いて蓄積および保持された抗体コンジュゲートを局所化する。このアプローチは、蛍光標識抗体17を注入する前述のIF機関学アプローチに類似している。しかし、ここで、非共役抗体の使用は、抗体修飾によって誘導される生体分布特性の潜在的な変化を回避する。さらに、蛍光二次抗体のex vivoアプリケーションは、組織の収集および処理中に蛍光シグナルの損失の可能性を回避し、蛍光シグナル強度の増幅を提供する。当社のラベリングアプローチは、抗体ベースの薬剤および標的剤の生体内生分解に反映され、新規診断および治療薬の開発に重要な洞察を提供することができます。
ここでは、乳癌検出のための分子イメージングアプローチに対する抗体ベースの造影剤の生体分布とアクセシビリティを研究する前の研究で適用されたIVIL法の2つの応用例について述べた。まず、抗体近赤外色素コンジュゲート(近赤外蛍光色素に結合した抗B7-H3抗体、indocyanine green、B7-H3-ICG)および蛍光および光音響分子に対するアイソタイプ制御剤(Iso-ICG)の生体分布イメージングは18を探索される。このアプリケーションのメソッドは、プロトコルで説明されています。次に、netrin-1に対する立体構造に敏感な抗体の生体分布結果は、典型的には従来のIFイメージングでは検出できない、超音波分子イメージングと共に使用され、代表的な結果19に定量され、提示される。このプロトコルペーパーの結論では、読者は、独自の抗体ベースの研究アプリケーションにIVIL法を採用して快適に感じるべきです。

<table><tbody><tr><td> 動物モデル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>002374</td><td>女性、4-6週齢</td></tr><tr><td>動物ハンドリング用品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G カテーテル</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo MicroMarker 尾静脈アクセスカニューレ挿入キット</td><td></td></tr><tr><td>をご注文くださいアルコールワイプフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>22-246073</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼスポンジ(4 "x 4" 16プライ)</td><td>カーディナルヘルス</td><td>2913</td><td></td></tr><tr><td>ヒートランプモー</td><td>ガンビルサイエンティフィック</td><td>&nbsp;HL0100</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ヘンリーシャイン動物の健康</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>眼科軟膏</td><td>フィッシャー科学NC0490117</td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科テープ</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissueコレクション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てベースモールド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-556</td><td></td></tr><tr><td>最適な切断温度(OCT)ミディア</td>ム<td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>外科用ロンドン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11080-02</td><td></td></tr>外科<tr><td>用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-488ヤギ抗ラットIgG</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーA-11006</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-546 ヤギ抗ウサギ IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor-594 ヤギ抗ヒト IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11014</td><td></td></tr><tr><td>ヒト IgG アイソタイプコントロール</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-97043</td><td></td></tr><tr><td>ヒト化抗ネトリン-1抗体&nbsp;</td><td>Netris Pharma</td><td></td><td>contact@netrispharma.com</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3)</td><td>Abcam</td><td>ab134161</td><td>EPNCIR122 Clone</td></tr><tr><td>Rat anti-Mouse CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>MEC 13.3 Clone</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>クリアネイルポーランド</td><td></td><td></td><td>地元のドラッグストア</td></tr><tr><td>インドシアニン グリーン - NHS</td><td>Intrace Medical</td><td>ICG-NHS エステル</td><td></td></tr><tr><td>マウンティング 媒体</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>TA-006-FM</td><td></td></tr><tr><td>ノーマル ヤギ 血清</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>ICN19135680</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td></td> AAJ19943K2 <td></td></tr><tr><td>滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>トリトン-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>サプライ</ストロング>/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>接着ガラススライド</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>脱塩カラム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャー科学</td>的な<td>12-544G</td><td></td></tr><tr><td>疎水性障壁ペン</td><td>テッドペラ</td><td>22311</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離管フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>スライド染色トレイ</td><td></td>VWR87000-136<td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>LOCI、UW-Madison。</td><td>バージョン4.0</td><td>https://fiji.sc/</td></tr></tbody></table>

がん研究における治療・診断抗体生体分布の評価のための生体内免疫蛍光局所法

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

モノクローナル抗体(mAbs)は、がんの検出、診断、治療において重要なツールです。それらは、腫瘍形成におけるタンパク質の役割を解明するために使用され、腫瘍の検出および特徴付けを可能にする癌バイオマーカーに向けられ、免疫エフェクター細胞を活性化するためにmAbsまたは抗体薬物コンジュゲートとして癌治療に使用することができ、阻害するシグナル伝達経路、または特定の抗原を運ぶ細胞を直接殺す。新規および非常に特異的なmAbsの開発および生産の臨床的進歩にもかかわらず、診断および治療の適用は腫瘍微小環境の複雑さおよび不均一性によって損なわれる。したがって、効率的な抗体ベースの治療および診断の開発のためには、生体腫瘍微小環境との抗体ベースコンジュゲートの生体分布および相互作用を評価することが重要である。ここでは、生体内生理的および病理学的条件における抗体ベースの治療薬および診断の相互作用を研究するための新しいアプローチとして、生体内免疫蛍光局所化(IVIL)について説明する。この技術では、治療または診断抗原特異的抗体を生体内に静脈内注射し、単離腫瘍中の二次抗体を用いて局所的なex vivoを投与する。したがって、IVILは、抗体ベースの薬剤および標的剤の生体内生体分布を反映する。2つのIVILアプリケーションは、乳癌の分子イメージングのための抗体ベースの造影剤の生体分布およびアクセシビリティを評価する記載されている。このプロトコルは、将来のユーザーが独自の抗体ベースの研究アプリケーションにIVIL法を適応することを可能にします。

IVIL法は、B7-H3-ICGおよびIso-ICGの生体内生体分布および組織相互作用を調べるためにここで使用され、薬剤が生体動物に静脈内注射した後、96時間の標的組織と相互作用し、その後組織が一旦収穫され、排生免疫染色中に一次抗体として作用する。IVIL法はまた、B7-H3マーカーに対する組織の標準的なex vivo IF染色と比較した。正常なマウス乳腺はB7-H3マーカーを発現せず、ex vivoで確認され、標準的なIF染色、および他の受動機構を介して抗体を蓄積せず、したがって、B7-H3-ICGまたはIso-ICGの蓄積は検出されなかった、代表的な負の結果 (図 1、一番上の行) の。しかし、マウス乳腫瘍は血管系と上皮の両方でB7-H3を発現し(標準的なIF染色で確認)、IVILは血管系に強く蓄積し、部分的に余分に増殖させたB7-H3-ICG剤を強調することができた。血管系から癌細胞自体に結合するが、腫瘍全体のB7-H3マーカーの均一な分布と比較して不均一な方法で、<str...

インビボ免疫蛍光局在化(IVIL)法は、生体内腫瘍標的化とexvivo免疫染色の組み合わせを用いて、生体内の腫瘍学的目的のための抗体および抗体コンジュゲートの生体内生分解を調べるために使用することができる。メソッド。

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

インビボ免疫蛍光局在局(IVIL)のためのこのプロトコルは、がん研究、検出、および治療のための診断および治療用抗体または抗体ベースの薬剤の生体分布を評価する。IVIL法は、抗原の細胞発現がex vivoで明らかにされる従来の免疫蛍光染色とは対照的に、抗体および抗体ベースの薬剤が生きている動物でどのように分布するかを解明する。このビデオは、IVILメソッドの全体的なワークフローの理解を助ける。他のアプリケーションおよび抗体に対するプロトコルの再生を成功させるための重要な詳細を示す。先に進む前に触診またはキャリパー測定を介して適切な腫瘍増殖のための所望の癌モデルからのマウスを観察する。脱塩カラム上のウサギの抗マウスB7-H3およびウサギIgGアイソタイプコントロール抗体を精製し、メーカーの指示に従って防腐剤と保存バッファーを除去します。個々のマイクロ遠心分離管における各抗体コンジュゲートの33マイクログラムのアリコート投与量。テキストプロトコルに記載されている麻酔に続いて、抗体溶液の尾静脈接種に備える。アルコール拭きで3回拭いて動物の尾を消毒する。ヒートパッドで約30秒間温めることで尾静脈を拡張します。動物全体を加熱しないでください。27ゲージの尾静脈カテーテルを使用して、2つの側面尾静脈の1つに蝶の針を挿入します。カテーテルに血流を視覚化して、針が適切に配置され、溶液が動物に完全に入り込み、尾に捕捉されるようにします。手術用テープを使用して、挿入された針で尾を慎重にステージに固定します。25マイクロリットルの無菌リン酸緩衝生理食塩水でカテーテルを洗い流します。次いで、インスリン注射器を用いてカテーテルに抗体溶液を注入する。滅菌PBSの25マイクロリットルでカテーテルをもう一度洗い流します。針を尾から取り出し、圧力をかけて出血を止めます。テキストプロトコルに記載されているようにマウスの人道的安楽死を行い、仰向けの位置にマウスを置く。手術用ハサミと鉗子を使って腫瘍組織を切除する。鉗子を使用して、尾部に最も近い乳腺の組み合わせの間の皮膚の外層だけを把握し、外科用ハサミで小さな切開を行います。閉じたはさみをカットに導入し、ゆっくりと先端を開いて下の腹壁膜から皮膚を慎重に分離し、そのままに保ちます。腹部を垂直に切開し、皮膚を内膜から分離し続けます。3番目と4番目の乳腺の間で、皮膚の引き込みと乳腺の視覚化を可能にするために腹部を横切って水平に切り取る。各腫瘍または正常腺を鉗子でつかみ、外科用ハサミを使用して取り付けた皮膚を慎重に切り取る。切除された組織を、あらかじめラベル付けされ、最適な切断温度埋め込み媒体で満たされたティッシュの使い捨てベース型に入れます。ドライアイスに配置することで、金型を素早く凍結します。オフターゲットの送達を研究するために、他の組織または関心のある器官を物品化する。クライオスタットを使用して、10ミクロンの厚さの凍結組織ブロックを切り離し、隣接するセクションをあらかじめラベル付けされた接着ガラススライドの上に置きます。凍結した組織スライドを室温PBSで5分間リンスし、埋め込み培地を除去する。組織切片を疎水性バリアペンで区切り、染色時に必要な溶液の量を減らします。4%パラホルムアルデヒド溶液で組織切片を5分間固定します。スライドをPBSで5分間リンスした後、PBSで0.5%トリトンX-100で組織切片を15分間透過させる。PBS でスライドを再び 5 分間リンスします。1ボリュームのウシ血清アルブミンあたり3%の重量と室温で1時間の体積ヤギ血清あたり5%の体積を含むPBSで組織をブロックします。PBSでスライドを5分間リンスした後、一般的な核、血管、または細胞質マーカーなどの記録保持一次抗体で切片をインキュベートします。ここで、ラット抗マウスCD31は、ブロッキング溶液中の1対100希釈で使用される。一次抗体を有するスライドは、スライドトレイの脱水から保護された摂氏4度で一晩放置される。インキュベーションに続いて、PBSでスライドを5分間3回すすいだ。毎回 PBS を変更します。一次抗体を標識する二次抗体でスライドをインキュベートします。このアプリケーションでは、アレクサフルオール546コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体を使用して抗B7-H3抗体を可視化し、ブロッキング溶液中のアレクサフルーオール488ヤギ抗ラット二次抗体を用いてCD31を可視化します。スライドトレイの軽い脱水症状から、室温で1時間保護します。前のようにPBSでスライドをすすぐ後、組織スライスの中央に取り付け媒体の1滴を塗布する。気泡の封じ込めを避け、慎重にカバースリップを置きます。カバースリップの端を透明なマニキュアで密封し、乾燥させます。テキストプロトコルに記載されているように、共焦点顕微鏡イメージングと定量画像解析を進めます。代表的な共焦点顕微鏡写真は、正常または癌腫組織を含むマウス乳腺における特異的B7-H3抗体ICGコンジュゲートおよび非特異的アイソタイプ対照抗体ICGコンジュゲートの局在化の比較を示す。イソ-ICGまたはB7-H3-ICGを静脈内注射した動物からの正常なマウス乳腺およびCD31で染色されたカウンターは、抗体コンジュゲートの染色を示さない。正常組織は、標準的なex生体免疫蛍光染色法によるB7-H3の発現を有さないことを示した。浸潤性乳腺腫瘍では、B7-H3-ICGは、生体内の最初の接触点である血管系に強く結合し、その後、血管系から腫瘍上皮を不均一に染色するために外乳化することができる。イソICGは、腫瘍組織内の非特異的蓄積を示す。標準的なex vivo免疫蛍光染色は、上皮細胞および内皮細胞上のB7-H3マーカーの均一な発現を示す。代表共焦点顕微鏡写真は、マウス癌および正常乳腺におけるネトリン-1発現またはアイソタイプ制御発現を検出するin vivo免疫蛍光局在化法を示す。生体内免疫蛍光局在化は、MMTV-PyMT腫瘍ではネトリン-1の上皮シグナルを確認するが、正常な乳腺では確認しない。さらに、共局化した黄色のシグナルによって示されるように、乳房腫瘍の内皮細胞に強いネトリン-1シグナルがある。正常乳腺では信号が著しく弱い。IVIL法は、抗体投薬量、組織採取タイミング、二次抗体希釈の観点から最適化して実装を成功させる必要があります。IVILは組織処理を必要とする標準的な免疫蛍光染色を使用して検出できない立体構造エピトープを標的化することを可能にする。また、腫瘍を持つマウスの健康な器官を収集して、治療用抗体のオフターゲット送達を評価することができる。がんの研究・管理における抗体系治療薬や造影剤の使用が増加する中、IVIL法は医薬品の研究開発に非常に応用可能です。がん治療、分子イメージング、炎症、その他の分野の研究者は、IVIL法が有用な情報を提供することを発見するかもしれません。

in-vivo-immunofluorescence-localization-for-assessment-therapeutic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

びまん性蛍光トモグラフィは、前臨床、高を通じて比較的低コストの可能性のあるアプローチを提供しています...

癌バイオマーカーの局在の小型動物のCTガイド下時間領域拡散蛍光トモグラフィー

植物ウイルス粒子（VNPs）は生物医学への応用のための有望なプラットフォームです。ここでは、植物VNP伝播、精製、特性評価、バイオコンジュゲーションするための手順について説明します。最後に、我々は腫瘍ホーミングとマウス異種移植モデルおよび蛍光イメージングを用いたイメージング用VNPsの応用を示す。...

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

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腫瘍特異的抗体のin vivo局在を評価する技術

このビデオは、乳がんのマウスモデルにおける腫瘍標的抗体の生体分布を研究するためのin vivo免疫蛍光局在化(IVIL)技術を示しています。マウスに腫瘍特異的抗体を静脈内注射すると、腫瘍は外科的に単離され、腫瘍組織内の抗体の局在はex...

抗体の生体内分布を研究するためのin vivo免疫蛍光ローカリゼーション法

このビデオは、マウス腫瘍異種移植モデルにおけるin...

マウス腫瘍異種移植モデルにおける抗体局在化のためのin vivo蛍光イメージング

このビデオは、マウスモデルにおける腫瘍のin...

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二重特異性抗体誘導性T細胞の腫瘍への輸送を追跡するためのin vivo技術

このプロトコルは、蛍光色素標識ナノボディおよび従来の抗体を使用して、マウスにおけるin vivo近赤外蛍光異種移植イメージング実験のex...

ナノボディ及び抗体ベースの検証<em&gt;インビボ</em使用してマウスにおける&gt;腫瘍異種移植NIRFイメージング実験<em&gt;エクスビボ</em&gt;フローサイトメトリーおよび顕微鏡

ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80...

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

がん転移臨床生体内で追跡のためのプロトコルについて述べる。それは、非侵襲的 [18F] テトラフルオロホウ酸-ペット、および合理化された前のヴィヴォ確認のため蛍光蛋白質によって検出されたナトリウム...

放射性核種蛍光レポーターの遺伝子齧歯動物腫瘍モデルで腫瘍の進行を追跡するイメージング

ここでは、マウス腫瘍異種移植片モデルにおける抗体のin...

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

学ぶ 生体内免疫蛍光局所法（IVIL）を用いて、がん研究における治療・診断抗体の生体分布を評価する方法。この技術はリアルタイムで抗体動態を可視化し、がん治療薬の有効性評価に貢献します。

がん研究における治療・診断抗体生体分布の評価のための生体内免疫蛍光局所法

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