Name: 初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶ初代ヒト気道上皮細胞を用いた気道表面液pHのリアルタイム蛍光測定法。半自動化されたこの技術は、嚢胞性線維症や喘息などの慢性気道疾患における新規治療薬の効果評価に応用可能です。

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この作業は、2つの CF 信託戦略研究センター助成金 (SRC003 と SRC013) と医学研究評議会 (MRC) コンセプト・グラント (MC_PC_15030) の信頼によって支えられました。JG は、医学研究財団 (MRF-091-0001-GARNE) からの助成金によって支持されました。MB は医学研究評議会の臨床医科学者フェローシップ (MR/M008797/1) によってサポートされました。IH はウェルカムトラスト臨床トレーニングフェローシップ (203520/Z/16/Z) によって支持された。この研究は国立衛生研究所によって支持され、ニューカッスル病院では NHS 財団信託とニューカッスル大学に拠点をおいています。表現された見解は作者のものであり、NHS、NIHR、保健省のものであるとは限りません。Dr. Randell からの初代細胞は、嚢胞性線維症財団補助金 (BOUCHE15R0) および NIH 助成 (P30DK065988) によって支持された。

主要な非 CF (n = 3 ドナー、年齢34、27、23歳) および CF (n = 3 ドナー、すべての F580del/F508del; 年齢40、41、不明) hAECs は、スコット・ H ・ Randell 博士からの親切な贈り物でした (Marsico 肺研究所、ノースカロライナ大学チャペルヒル、アメリカ) obtai議定書の下のネッド #03-1396 チャペルヒル生物医学的機関の審査委員会でノースカロライナ大学によって承認されました。細胞を、Fulcher および Randell35、36によって記述された成長および分化媒体を用いて以前に公表した方法に従って増殖した。
1. サンプル調製
<ol><li>前に説明した35、36のように、少なくとも28日間、空気液界面で 6.5 mm 径の半透過性サポート (材料のテーブル) でプライマリ hAECs を成長させます。</li>
	<li>HCO3含有クレブス溶液中に 50 mL の無菌溶液 (HCO3- KRB、濃度は mM NaHCO3 (25) NaCl (115)、KCl (5)、CaCl2 (1)、MgCl2 (1)、D-グルコース (5)) の滅菌液の調製0.2 μ m のスポイトフィルターを使用してフィルター殺菌しなさい。</li>
	<li>1.135、36に記載されているように、basolateral 培地を新規分化培地に変更する。 注: basolateral グルコース濃度が ASL の pH33に影響を与えることが示されています。この段階では、basolateral コンパートメントのグルコース含量を、公知のグルコース濃度の緩衝溶液によって培地に置き換えることによって制御することができる。</li>
	<li>150μ l の HCO KRB を加えて細胞の頂端表面を洗浄し、37° c、5% co2 で20分間インキュベートします。</li>
	<li>滅菌ガラスパスツール pipet を使用して慎重に吸引し、回収ボトルに真空を作成する吸引ポンプにリンクされた滅菌 P200 pipet チップを用いて上皮を破壊することなく、頂端洗浄を除去します。この段階では、空気と液体の界面を回復させるために、頂端面にはできるだけ小さな液体が残っているはずです。</li>
	<li>37° c でさらに30分、5% の CO2 で細胞をインキュベートします。</li>
</ol>2. バックグラウンド測定
<ol></ol>3. キネティック測定
<ol><li>ステップ2.1 を2.4 に繰り返して、プレートリーダーを準備します。</li>
	<li>開いているアイコンをクリックし、背景の測定に使用する方法ファイルを選択します。</li>
	<li>キネティックループパネルで、ループタイプを継続時間として保持し、08時間に設定します。間隔の種類を固定に変更し、5分に設定します。蛍光強度パネルをバックグラウンド測定と同じに保つ 注: 連続読み取りを可能にするために、バックグラウンド測定の区間タイプは「未定義」に設定されています。キネティックとキャリブレーションの実験では、区間タイプは間隔5分で「固定」に設定されています。これは、実験の設計と条件の数に応じて調整することができます。</li>
	<li>プレートリーダードロワーを開きます。それぞれの側に dH2O の 6 mL を充填した湿度カセットを挿入します。プレートの蓋と底がきれいであることを確認してください-ない場合は、組織の部分に 70% エタノールできれいに-そして、そのカバーと、湿度カセットにプレートを置きます。</li>
	<li>[開始] をクリックして蛍光測定を開始します。湿度カセットの蓋が所定の位置にあることを確認した後、[ OK ] をクリックします。</li>
	<li>N サイクル (通常は 12 ~ 24) の後、1 ~ 2 時間に相当しますが、[一時停止] をクリックして実験を中断します。プレートを取り出し、さまざまなサンプルに basolaterally 薬/アゴニストを適用します。 注意: 細胞がプレートリーダーから取り出されると、CO2はエスケープし、これは、ph 感受性色素蛍光の低下によって示されるように、ASL pH の増加を誘発する。この CO2誘導 pH 変化は、培養物をプレートリーダーに戻した後、10-15 分以内に逆転します。</li>
	<li>プレートをトレイの湿度カセットに戻し、湿度カセット蓋を再配置し、さらに ASL の pH を記録し、ASL の pH に薬/アゴニストの効果を監視するために続行をクリックします。</li>
</ol>4. in situ pH キャリブレーション
<ol><li>プレートリーダーからプレートを取り出します。</li>
	<li>Basolateral 培地/溶液を吸引除去する。</li>
	<li>Basolateral コンパートメントと頂端面に、それぞれ高度に緩衝された標準曲線溶液の750μ l および1μ l を加えます。 注: 非常に緩衝された標準的なカーブの解決は (mM) NaCl (86)、KCl (5)、CaCl2 (1.2)、MgCl2 (1.2)、NaHEPES または MES またはトリス (100 の mM) を含んでいる。MES を使用して、ph が7より低い NaHEPES、ph 8 の溶液の場合は pH 7-7.5 およびトリスの溶液に対して溶液を緩衝します。HCl を使用して、pH を所望の値にクランプする。</li>
	<li>プレートリーダーで CO2をオフにするか、0.1% に設定し、プレートを湿度カセットに戻します。</li>
	<li>前に説明したのと同じパラメータを使用してプレートリーダーを設定しますが、ステップ3.2 では CO2は使用しません。</li>
	<li>1-1.5 h のための5分ごとの蛍光の読書を、開始しなさい。</li>
</ol>5. キャリブレーションデータにおける色素濃度と懸濁液量の影響評価
<ol><li>十分な pH 感受性および無感覚色素混合物を調製して、3つの異なる体積で最低4つの異なる pH 値で蛍光を記録します。 注: ここで、混合物1は、26μ l の pH 感受性 (1mg/mL) および2.6 μ l の ph 感受性 (10mg/ml) と混合物 2 (1 mg/mL) および1.3 μ l の ph 感度 (10mg/ml) で調製した。</li>
	<li>ミックス1またはミックス2の2.2 μ l または1.1 μ l をそれぞれ96ウェルプレートの12ウェルに分配し、十分な校正ソリューションを追加して、50、100または200μ l の最終容量を得てよく混ぜる。 注: この設定では、色素の濃度は5μ g/mL (200 μ l)、10μ g/ml (100 または200μ l)、20μ g/mL (50 または100μ l) または40μ g/mL (50 μ l) に記録されます。</li>
	<li>プレートリーダーをオンにし、温度を37° c に設定し、プレートリーダーにプレートを挿入します。CO2コントローラの電源をオンにしないでください。 注: これは短い実験であり、温度を平衡化のに十分な時間を必要とするので、湿度カセットは必要ありません。</li>
	<li>96ウェルプレートの z 位置とゲインを調整し、半透過性のサポートで実行される実験と同じパラメーターを使用します。</li>
</ol>6. データ分析
<ol><li>すべてのデータをスプレッドシートに保存し、新しいファイルを作成します。</li>
	<li>バックグラウンドファイルで、両方の波長のサンプル/条件のすべての平均データを選択し、コピーして、新しいファイルに貼り付けます。各ウェルと各波長の平均背景を計算します。</li>
	<li>キャリブレーションおよびキネティックデータでこれを繰り返し、各波長の各データポイントからバックグラウンドを減算します。</li>
	<li>各時点および各サンプルについて、pH 感受性および pH 非感受性蛍光の比率を計算する</li>
	<li>すべてのサンプルが個々のドナーから取得された場合、較正曲線の各時点における比率の平均を計算する 注: ドナーまたは basolateral のソリューションと同じ数の較正曲線を生成することが重要です。実際に、これらのパラメータは、バックグラウンド読み取り値または流体の吸収率に影響を与える可能性があり、その結果、染料濃度および計算された pH に影響します。</li>
	<li>各時点で、比率から標準曲線を生成し、x 軸上の既知の pH 値と y 軸上の比率をプロットします。</li>
	<li>比率が安定している時点を特定し、線形回帰直線を当てはめて、このラインの方程式を取得します。</li>
	<li>キネティックデータから、各時点の pH を計算して、pH を y 軸上にプロットし、x 軸上の時間 注: 休止/基礎 pH は、任意のアゴニストまたは他の介入の添加前に pH の安定測定上のデータ点を平均することによって計算することができる。アゴニストの効果は、治療の前後の pH (一定の時間) の差を計算するか、または介入直後のデータ点に非線形曲線を当てはめることによって特徴付けられます。これにより、t1/2および最大値に関する追加情報が得られます。最後に、酸性化またはアルカリ化の速度は、介入後の最初の点に嵌合した直線の傾きからも得ることができる。</li>
</ol>

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MB: この仕事に関連していない: ファイザーとロシュの診断から研究者主導の調査助成;ノバルティス、ロシュ診断、テバからニューカッスル大学に支払われたスピーカー料金。Boehringer ハイムと頂点医薬品からの教育会議への旅費

ここでは、初代ヒト気道上皮細胞における ASL pH の動的測定のための詳細なプロトコルを提供する。重要なステップは、細胞の頂端面から粘液を洗浄し、測定し、実験と同じパラメータを使用して背景を減算、z 位置とゲインを最適化し、その場で pH キャリブレーションを実行することが含まれます。
細胞を洗浄する最初のステップは、粘液の厚い層として重要である (i) 色素が periciliary 層 (PCL) に到達するのを防止し (ii)、アゴニスト/阻害剤に応答して蛍光の変化を検出することを防止する。この方法は、アゴニストに応答して HCO3および H+トランスポーターの活性をどのように原発 hAECs 変調したかを研究するために開発された。PCL pH の変化が粘液の pH の変化にどのように関連するかを調査することは興味深いことですが、異なる分子量-dextrans を使用して2層と z スキャンを別々に標的にすることを含む、このプロトコルのさらなる発展が必要です。全 ASL
バックグラウンド測定は、このプロトコルのもう一つの重要なステップです。完全に分化した一次気道上皮の頂端面は、光経路およびしたがって背景に影響を与える完全に平坦であることはまれである。バックグラウンドの読み取りが、実験中のウェルの同じローカルポイントで実行されることを確認することは、記録の再現性と安定性にとって重要です。
Z 位置とゲインの最適化は、使用する蛍光染料の濃度ごとに設定する必要があるステップです。これにより、高い実験間変動を防ぐことができます。一度設定すれば、私達の試金は安定した、再生可能な結果を提供する。この理由の1つは、色素が、上皮によって容易に再吸収される少量の体液中の細胞の頂端表面に添加され、homogenously というラベルの付いた ASL が残ることである。ASL を染色する別の方法は、同様に成功することができる、乾燥粉末または PFC における「懸濁液」を使用した。これは時間を節約するかもしれませんが (実験は通常2時間以内に行われるため)、可溶化では乾燥染料が完全にフォームの束。したがって、異なる濃度の pH 感受性色素が上皮細胞の表面にわたって見出されるであろう。
In situ pH キャリブレーションは、正確で再現性のある結果を得るために重要なステップです。結果のセクションで説明されているように、ASL のボリュームの違いは、蛍光カウントと補間された pH 値に影響を与えます (図 2および図 3)。異なるグループが以前に、ASL pH 測定を公表している間、同じグループ8,17によって出版された異なる研究の間でも幅広い値が得られる。私たちは、その場でキャリブレーションを行うことにより、結果がより再現性になることを信じています。標準曲線28、29、30を生成するために高 K+/nigericin (または複数のカルシウムイオノフォア) 法を使用する他の pH 較正技術と比較して、ここで提示されるアッセイは、、すべてのステップが安全キャビネット内で行われる限り、ASL の pH に使用される細胞は、処理が上皮細胞に不可逆的に影響しないことを提供して、他の実験のために洗浄、保持および再利用することができる。
このアッセイの開発と最適化は再現性のある結果を提供しており、この方法は他のグループが ASL の pH 測定を行うのに役立つと考えています。ただし、この方法には、設定や使用されているセルの種類によってもいくつかの制限があります。ここに提示されているよりも長い期間にわたって ASL の pH を監視すること (> 8-10 h) は、長期的な高湿度環境が機器を損傷する可能性があり、ほとんどのプレートリーダーは、上にキネティック測定値を記録するためのオプションを提供しているという事実として困難である可能性があります一定の時間 (通常は 24 h)。完全に分化した一次 hAECs の使用は、異なる分化段階が HCO および H+輸送体の発現に影響を与える方法において極めて重要である。しかしながら, 薄膜状態の下で成長した細胞における ASL の量を正確に制御する可能性はほとんどありません。プロトコルと結果のセクションで述べたように、ボリュームの変化は、蛍光比に影響を与え、それは残念ながら、単一の個体から成長した細胞で、異なる半透過性のサポートに同じ日に播種し、ASL のボリュームを仮定する必要がありますは同じです。この制限から生じる, 流体の分泌または吸収に影響を与える任意のアゴニストや阻害剤は、ASL のボリュームとおそらく蛍光比に影響を与えます.しかし、我々のアッセイでは、実験の最後に較正曲線が実行されるので、これらの体積変化は、運動実験中と同じように較正比に影響すると推測することができます。このような理由から、我々は、このアッセイを開発することに興味があるグループに助言し、これが各条件のための標準曲線の確立を可能にするようにテストされた1つの条件につき少なくとも2-3 の反復を使用する。
ここでは、薄膜状態下での粘膜表面 pH のリアルタイム測定を可能にする、シンプルで半自動化されたアッセイをご紹介します。それは、内部およびドナー内の比較を可能にするほぼ同時の方法で多くの文化の動的 pH 応答を調査する能力を持っています。この方法を、偏光系 (HTS 96 ウェルプレート)38を用いて96ウェルプレートフォーマットにアップスケーリングすることは、創薬アッセイとしてさらに高いスループットを提供するであろう。さらに, 我々は、この技術は、ASL pH のアゴニストの急性効果を研究するために使用することができる方法を示していると我々はすでにこの方法は、CF hAECs ASL39に頂端プロトンポンプ阻害剤の長期的効果を研究するために使用することができることを発表しました。PH が感染、炎症、粘液粘度およびイオン輸送を調節することが示されているように、pH を増加させることができる分子標的を同定することは、慢性肺疾患の研究分野において貴重であり、この技術は潜在的に促進する個別化医療における薬物スクリーニングの開発最後に、酸塩基の恒常性の調節異常は他の疾患において主要な役割を果たしているので、このプロトコルは、最適化のステップによって、異なる装置 (プレートリーダー) および細胞タイプ (他の上皮細胞など) に適合させることができる。細胞外の酸性度は、癌40、41、42の特徴であり、このアッセイは、固形腫瘍が低 pHeを産生する方法を決定するのに役立つ可能性があるか、または低スループットの薬物スクリーニングアッセイとして使用することができますpH 恒常性の回復。同様に、慢性気道疾患についても、個別化医療のアプローチの開発のためのプラットフォームを提供することができます。

気道上皮は、気道表面液 (ASL) と呼ばれる薄い (〜10μ m) 流体層によって覆われている。この ASL の組成と深さ (水和) は厳しく規制されており、粘液線毛エスカレーター1、2、3、4による気道クリアランスの効率を制御します。近年では、asl の重要性 H+/HCO3-コンテンツは、asl の水和5、気道の炎症6と感染7を調節する能力のために異なるグループによって実証されています 8だけでなく、粘液粘度8,9。重要なことには、いくつかの論争が存在するが、多くの研究は、喘息10、11、12、COPD11などの慢性気道疾患における気道 pH の調節異常を報告しており、気管支拡張症11、慢性 rhinosinusitis13、14および嚢胞性線維症 (CF)5、9、15、16、17、は、ASL を回復する療法は、慢性気道疾患の複数のタイプを治療するために有用であり得ることを示唆しています。CF は、白人の人口の中で最も一般的な常染色体劣性遺伝病であり、CF 膜貫通コンダクタンスレギュレータ (CFTR) 遺伝子の突然変異によるものです。この遺伝子は、上皮18全体のイオンおよび流体輸送およびホメオスタシスにおいて重要な役割を果たしているアニオン (HCO3および Cl-) チャネルをコードする。Cf は多臓器疾患であるが、肺病理は罹患率及び死亡率19,20の主な原因であり、CF の主な欠損を考慮すると、Cl-及び HCO3-の障害輸送である、1つは cf の人々の細胞外液 pH が CF を持っていない人に比べて dysregulated されることを仮定することができます。したがって、ASL の pH の測定は、CF 研究の局所領域となっており、異なるグループは、CF の ASL pH を測定するための技術を開発しました航空。
インビボでは、気道 pH は、異なる技術を使用して測定され、マイクロプローブ (光ファイバー、金または mobidium プローブ) から5、21、22、23、24までの ph 測定値expectorated 物質または呼気凝縮液 (EBC)10,11,12,25,26,27.CF の研究分野では、その潜在的な臨床的影響のために、pH が広く研究されています。理論的には、気道をよりアルカリ性にすることで、細菌の死滅を増加させ、全体として粘液線毛クリアランスおよび気道恒常性を改善することができる。しかしながら、インビボ/ex インビボ研究は広範囲の ph 値を報告し、そしてこれまでに、非 CF および cf 気道間の ph の差の存在に関して結果は決定的ではない。2000年代初頭には、異なるグループが EBC の pH を報告しました。非罹患群において、pH 値は4.6 〜8.5 の範囲であったが、興味深いことに、EBC pH は、CF12,27を有する人々における増悪時により酸性であった。より最近では、ヒトおよび動物モデルの CF における ASL のインビボ測定は、競合する結果16、17、21、22、23を報告しており、 24そして、cf 気道が非 CF 気道よりも酸性である場合、それはまだ不明です.
より低い ASL の測定値の生体内計測が困難であるため、気道を裏打ちする流体の非常に少ない量と疾患における粘液栓の潜在的存在に起因して、多くのグループは、主に3つの異なる使用して、ASL の pH を測定するために in vitro 実験になっています方法。最初のアプローチでは、透過性に直接、ASL に、またはパーフルオロカーボン (PFC)5、8、16と呼ばれる不活性流体を使用して、乾燥粉末として添加されたデキストラン結合細胞と pH 感受性蛍光染料を使用します。,17,28,29,30,31,32しかし、この技術は、培養物に添加される染料の正確な量をほとんど制御することができず、色素凝集体のリスクおよびサンプルおよび/または実験間の濃度の大きな差をもたらし、同じサンプル内であっても.また、一般的には、その適用性を制限し、多くの場合、複数のサンプルや記録条件の変化の詳細な監視を防止する共焦点顕微鏡で行われています。ASL の ph を測定するために採用された第二の方法は、ph 感受性 microelectrodes の使用です5,15.ASL の pH 測定は、したがって、蛍光色素濃度に依存せず、より堅牢で再現性のある結果を与える必要があります。しかし、この方法は、ASL の pH の動的な、リアルタイムの測定を可能にしない、また、異なる条件下で複数の測定値を作成することは容易ではありません。それはまた労働集約的で、複雑なプロセス、専門の装置 (電極の製造/電気生理学的記録装置) およびそれに続く pH の測定および調整のためのサンプルのコレクションのための訓練を要求する。さらに、これらの2つの技術はまた、再現性のある結果を生成する能力にいくつかの不整合を示している: pH 感受性蛍光染料法を使用して、唐 et al. は、CF ASL8の非 cf asl と7.0 のための7.35 の報告された値の一方で、より同じ群からの最近の論文は、ASL pH は、それぞれ17の非 CF および cf について6.9 および6.4 であった。同様の方法で、電極測定は 200315からの研究では、cf asl の非 cf asl と6.1 で6.4 の値を与えたのに対し、同じグループは 6.455からの研究では、cf asl のために6.7 の値を報告しました。最後に、3番目のアプローチでは、研究者は比較的多量の弱緩衝溶液を培養の頂端 (粘膜) 表面に加え、薄膜の状態を破壊して ASL の組成を変更し、潜在的にその調節を加える。ph は、次いで、ph 感受性蛍光染料33を用いて測定され、ウッシングチャンバー室13、14における ph stat 滴定方法によって、または ph を用いて測定された培養および ph から除去される希釈 ASL を必要とする電極、検光子またはリトマスは34を取り除く。ASL pH の正確な測定におけるもう一つの難しさは、可能な限り正確な標準曲線の確立です。実際に、測定値が樹脂を介して電位の差を測定する電極、または pH 感受性蛍光染料を使用して行われるかどうかは、これらのアプローチの両方が、サンプルの局所微小環境に影響されます。測定。より具体的には、染料の解離定数 (Kd) は、温度、イオン強度、粘度、ならびにタンパク質および潜在的に粘液などの細胞成分を有する染料の潜在的相互作用によってかなり変化し得る。
これらの技術的な問題の多くを克服し、よりダイナミックで、よりシンプルでより高いスループットの方法を開発するために、我々は、細胞透過性 pH 感受性を使用して、プライマリ hAEC 培養中の ASL pH を記録する in vitro 技術を確立しました標準的な商業版読者の蛍光染料。この方法は、薄膜状態の下で完全に分化した3D 細胞培養の ASL pH の再現性のある、動的な、半自動のリアルタイム測定を生成します。多重井戸の版の読者の使用によって、この半自動化された試金は 12 h 上の24の条件のための pH の近い同時測定をし、さまざまなアゴニストまたは抑制剤を加える効果を監察できる。本稿では、その手法を検証するための方法を詳細に説明し、代表的な結果を正と負の制御条件下で報告する。

<table><tbody><tr><td>0.2 &マイクロ;mシリンジフィルターStarlab</td><td></td><td>E4780-1226</td><td></td></tr><tr><td>6.5 mmトランズウェル、0.4&マイクロ;m 細孔ポリエステル膜インサート</td><td>コーニング</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>CFTRInh172</td><td>RnD Systems (Tocris)</td><td>3430</td><td>ストック濃度: 50 mM;最終濃度:20 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>Costar 24-well Clear TC処理マルチウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr>デ<tr><td>キストラン結合pH非感受性蛍光色素:AlexaFluor488-デキストラン</td><td>ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>ストック濃度:1 mg/mL;最終濃度:0.67 mg/mL</td></tr><tr><td>デキストラン結合pH感受性蛍光色素:pHrodo-デキストラン</td><td>ThermoFisher</td><td>P10361</td><td>ストック濃度:1 mg/mL;最終濃度:0.67 mg/mL</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>RnD Systems (Tocris)</td><td>1099</td><td>ストック濃度:50 mM;最終濃度:10 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96ウェルプレート</td><td>Cellstar</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>湿度カセット</td><td>TECAN</td><td>30090495</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NaHepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー:TECAN SPARK 10M</td><td>TECAN</td><td>30086375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルpH電極 DJ 113</td><td>VWR</td><td>662-1385</td><td></td></tr></tbody></table>

初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 ph をリアルタイムで半自動で蛍光測定

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

近年、気道における粘膜表面 pH の重要性は、気道表面液 (ASL) 水和、粘液粘度および抗菌ペプチドの活性を調節する能力によって強調されているが、先天性の防御に関与する主要なパラメータ肺。これは、これらのパラメータが dysregulated である嚢胞性線維症 (CF) などの慢性呼吸器疾患の分野において主要な関連性である。異なるグループがインビボおよび in vitro の両方で ASL の pH を研究している間、彼らの方法は、比較的広い範囲の ASL の pH 値を報告し、非 CF と CF の細胞間の pH の違いについても矛盾した所見。さらに、それらのプロトコルは、再現性を保証するために十分な詳細を提供するとは限らず、ほとんどが低スループットであり、実装するために高価な装置や専門知識を必要とするため、ほとんどのラボで確立することは困難です。ここでは、より密接に生体内の状況に類似している薄膜状態下での ASL pH のリアルタイム測定を可能にする半自動蛍光プレートリーダーアッセイについて説明します。この技術は、同時に複数の気道培養からの多くの時間の安定した測定を可能にし、重要なことに、アゴニストおよび阻害剤に応答して ASL pH の動的変化を監視することができる。これを達成するために、完全に分化した初代ヒト気道上皮細胞 (hAECs) の ASL は、薄膜状態を確保するために過剰な流体の再吸収を可能にするために pH 感受性染料で一晩染色される。蛍光がアゴニストの有無でモニターされた後、pH 較正は、体積および染料濃度について補正するために現場で行われる。説明した方法は、最終的には個別化医療のための創薬プラットフォームとして使用することができる、安定した再現性のある ASL の pH 測定を行うために必要なコントロールを提供し、他の上皮組織や実験に適応炎症性および/または宿主病原体モデルなどの条件。

上述の技術は、最大24の別々のプライマリ hAECs 培養における ASL pH の動的測定を可能にします。図 1に、主な手順と設備の概略図を示します。一晩ロードされた細胞は、抗デキストラン結合された ph 感受性および ph 非感受性染料からの蛍光を5分毎に記録した co2 および温度制御プレートリーダーに置かれる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig1.jpg"> 図 1: ASL pH 測定法の概略培養物を洗浄してバックグラウンドでの読み取りを行った後、初代ヒト気道上皮細胞 (hAECs) ASL は、37° c、5% CO2 で一晩中 pH 感受性および pH 非感受性色素の混合デキストランを結合して装填される。次の日に、プレートは、温度および CO2 制御プレートリーダーに移し、両染料からの蛍光が経時的に記録される。実験の後、in situ キャリブレーションを実行し、データを分析し、時間の経過とともに ASL の pH として提示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig1large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
最初に、蛍光カウントに対する異なる体積および色素濃度の影響、したがって560/495 比について調べた。実際に、pH 感受性染料に対する pH 非感受性を加える目的は、ASL のローディングにおける変動性のために修正することである。しかし、この仮定をテストし、すべての実験と細胞の種類の96ウェルプレートの細胞が存在しない場合に実行される標準的な較正曲線を使用できるかどうかを評価することが重要でした。50、100または200μ l の較正溶液 (pH 5.5、6.5、7または 8) での蛍光カウントを5、10、20、または40μ g/mL の染料でモニタリングしました。結果は図 2a-Cに示されており、同一の pH および同濃度の染料については、報告される pHsens/pHins の発光比 (y 軸上の 560/495) が体積に応じて異なっていることを示している (図 2a)。さらに、同じ pH および同じ容積で、異なる色素濃度は異なる比値を提供する (図 2b)。したがって、体積または染料濃度の変化は、放出比から計算された pH の絶対値に影響を与える。図 2cは、温度平衡に必要な時間が約15-20 分であることを示しています。色素濃度と体積が発光比に及ぼす影響を確認するために、一次非 CF および CF hAECs の ASL に装填された染料から蛍光を記録した。次に、キャリブレーションを実行し、(1) すべてのサンプルから1つのグローバル標準曲線を生成するか、(2) 各セルタイプ (非 CF および CF) に対して2つの独立した標準曲線を生成することにより、結果を分析しました。両方のセルタイプからの ASL pH は、その後、時間に対してプロットされました (図 3a、B) と平均 (図 3c)。単一のグローバルな標準曲線から得られた asl の ph 値は、非 cf と cf の培養 (図 3a、C) の間に有意な差を示したのに対し、asl の ph は、ph を計算したときの cf と非 cf hAECs の間で有意に異なっていなかった独立した標準曲線 (図3b、C)。これらの結果は、それぞれの実験のために、実験の間に独立した較正曲線を生成することの重要性を示し、各ドナーサンプルについて、較正曲線が一緒に平均化されたときから、より高い pHsens/pHins 比値が CF 培養物に見出された、より酸性 pH を示す (図 3c)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig2v4.jpg"> 図 2: インビトロでの pH 較正の最適化。既知の pH および異なる色素濃度の溶液の異なる容積を96ウェルプレート上に装填し、蛍光を1時間にわたって記録した。体積 (a) および色素濃度 (B) の蛍光比への影響。比は、時間−ポイント24分について pH に対してプロットした (C) 蛍光の変化の傾きを各溶液について計算し、時間の関数としてプロットした (min)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig3.jpg"> 図 3: 一次 hAECs の pH 較正の分析を現場で最適化する。(A) 単一の標準曲線から得られた ASL pH の代表的な痕跡で、非 CF および cf 培養からのデータを平均化する。(B) 非 CF または cf 培養で実行された独立した標準曲線から得られる ASL pH の代表的な痕跡。各データセットは、独自の較正曲線から計算されました。(C) キャリブレーションがどのように行われたかの関数としての非 CF および cf 培養間の ASL pH の差の評価。データは、n = 3 実験からの平均± SEM、2ウェイ ANOVA、Sidak の多重比較検定) を表す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
さらに我々の技術を検証するために、我々は、技術が ASL pH の「予想される」変化を検出することができることを実証するためにポジティブコントロールを必要としました。CF 細胞におけるより酸性の ASL の存在はまだ論争しているように、我々は CFTR を介して HCO3分泌を刺激するために、ポジティブなコントロール条件として、収容所アゴニストフォルスコリンを使用しました。期待される結果は、変異の重症度に応じて、CF 細胞で主に減少または廃止される非 CF 細胞において、フォルスコリンによって引き起こされた足しの ASL を示しています。図 4aは、時間の経過に伴う非 CF および cf 細胞の asl ph の代表的な痕跡を示し、図 4bは、両方の細胞タイプでフォルスコリンで処理する前後の asl ph の平均データを示しています。これらの結果から異なる情報を得ることができます。第1に、図 3bに既に示したように、C、安静 ASL pH は非 CF と cf 上皮とで異なっていなかった。第2に、フォルスコリンで細胞を治療するために実験を一時停止した後の最初の3-4 タイムポイントは、〜15分以内に回収された pH の大きな増加を示した。これは、プレートリーダー間の CO2濃度の低下によるものであった (5%)そして組織培養安全キャビネット (~ 0%)。ヘンダーソンハッセルバルヒの方程式によれば、5% co2 環境中の pH が7の HCO は、3 ~ 9.3 mM の濃度に相当します。細胞がプレートリーダーから除去されると、CO2 濃度が 0 % に低下すると、理論的には &gt; 8 の pH の上昇につながります。図 4aに、ASL pH が〜7.8 に増加したことを示しており、これは、プレートリーダー内でプレートを再配置する時間の経過によって説明することができる (すなわち、 5% co2 環境における)。最後に、予測されたように、basolateral 10 μ m フォルスコリン (Fsk) の添加は、非 CF 培養において ASL pH を有意に増加させた。CF と非 CF 上皮間の定常的な ASL の pH に違いが存在することが異なるグループによって示されているので、我々はさらに我々の実験と CFTR の役割の pH 差の明らかな欠如を調査したかった。これを行うために、特定の CFTR 阻害剤である非 CF 培養物をプレインキュベーションした、CFTRinh172 (172)。プロトコルセクション2.8 に記載されているように、染料混合物を上記のように調製し、0.1 X = 2 μ m の濃度で阻害剤を添加した。文献によると、非 CF 細胞の ASL の高さは、約10μ m である。6.5 mm 直径の半透過性のサポートでは、ASL の理論体積はπ× 3.252 = 0.3 μ l です。2μ m で染料 + 172 の3μ l を添加することにより、阻害剤の濃度は、過剰な流体の吸収後、理論的には20μ m (1x、所望の濃度) となる。図4cの代表的なトレースと図 4dの平均要約は、172が安静時の asl の ph を低下させなかったが、フォルスコリンが asl の ph の上昇を抑制し、したがって非 cf対cf から得られた結果を確認したことを示しています。文化を、さらに我々の技術を検証します。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig4v5.jpg"> 図 4: フォルスコリンによる CFTR 活性化に対応した動的 ASL pH 測定。(A) フォルスコリンの効果の代表的な痕跡 (Fsk, 10 μ m) 非 CF および cf hAECs で時間をかけて ASL pH の動態に.データは n = 3 実験からの平均± SEM を表す。(B) 非 CF および cf 培養における ASL pH に対する Fsk の影響の要約データは、n = 69 非 CF 培養物からの平均± SD および 35 CF 培養物を表す (2 ウェイ分散分析、Sidak の多重比較検定)。(C) 非 CF hAECs における ASL pH における Fsk 誘発性のinh172 (172、20μ m) の効果の代表的な痕跡。データは n = 5 実験からの平均± SEM を表す。(D) 非 CF 培養における足しの Fsk 誘導性に対する172の効果の概要データは n = 5 実験からの平均± SEM を表す (2 ウェイ ANOVA、Sidak の多重比較検定)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig4large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
最後に、プロトコルセクション6.8 に記載されているように、酸性化/アルカリ化の割合は、介入後の初期の時間点に線形回帰を当てはめることによって計算することができる。図 5a は、basolateral HCO3含有溶液 (HCO3- KRB) を除去して HEPES 緩衝溶液に置き換えることを示し、co2 の非存在下で、ASL の著しい酸性化を誘発した。これは、HCO3阻害経上皮 HCO3分泌の欠如と一致し、これらの気道細胞による恒常的なプロトン分泌が着実に ASL の pH15, 17を減少させる。興味深いことに、非 CF 細胞の初期の酸性化率は、CF 培養よりも有意に遅かった (図 5b)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59815/59815fig5.jpg"> 図 5: HCO3-除去に応答して ASL pH の動的変化。(A) 非 cf および cf hAECs の経時的な ASL pH の動態に HCO3除去の効果を示す代表的なトレース。酸性化の初期速度は、HCO3-除去後7時間点に嵌合した直線の傾きを介して得られた。データは、それぞれ非 CF および CF 培養における n = 6 および7実験からの平均値± SEM を表す。(B) HCO に続く酸性化の初期速度の要約3-除去。データは、それぞれ非 CF 及び CF 培養に対する n = 6 及び7実験からの平均値± SEM を表す (マン・ホイットニー検定)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59815/59815fig5large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

我々は、プレートリーダーを用いて、薄膜状態下で気道表面液 pH の動的測定を行うためのプロトコールを提示する。

初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

私たちのプロトコルは、安静時およびアゴニストまたは阻害剤処理の後の両方でリアルタイムで気道表面液体(ASL pH)の動的測定を可能にする最初のものです。この方法は、細胞外pH調節に関与するイオンチャネルおよびトランスポーターを同定するのに役立ち、癌などの重要な他の細胞系に適用することができる。以前に公開されたメソッドと比較して、この新しい手法は比較的簡単に実行できます。特殊な機器は必要ありません。また、空気液体界面、または薄膜条件下で複数培養でASL pH測定を同時に行うことができます。重要なことに、この新しい技術は、嚢胞性線維症だけでなく、喘息やCOPDなどの他の慢性気道疾患に対しても、新しい治療法の効果を評価する可能性を秘めています。少なくとも28日間培養した後、クレブス緩衝液を含む150マイクロローリットルの重炭酸塩を細胞培養インキュベーター上でヒト気道上皮細胞培養の有端表面を20分間洗浄する。インキュベーションの終わりに、吸引ポンプに連結された無菌P200ピペットチップを有する無菌ガラスピペットを使用し、上皮を破壊することなく洗浄を慎重に吸引する。空気液界面を復元するために、できるだけ少ない液体が有端表面に残っているはずです。その後、細胞を細胞培養インキュベーターに30分間戻す。バックグラウンド測定を実行するには、プレートリーダーとコンピュータの電源を入れます。ダッシュボードを開いた後、[Spark 10M] をクリックし、温度制御を摂氏 37 度に設定します。次に、ガスコントロールを開き、温度とガスが目標に達したら二酸化炭素を5%に設定し、プレートリーダーの引き出しを開き、各側に6ミリリットルの蒸留水を充填した湿度カセットをリーダーに挿入します。細胞培養板の蓋と底がきれいであることを確認し、プレートを湿度カセットの上に置き、蓋を元に戻し、引き出しを閉めます。Spark メソッド エディタを開き、適切なプレート テンプレートを選択し、実験中に監視するウェルを選択します。温度と二酸化炭素コントロールパネルを追加し、パネルを摂氏37度と5%にそれぞれ設定します。その後、温度/ガスボックスの待ち時間をチェックします。運動ループパネルを追加し、ループタイプとして継続時間を選択します。継続読み取りを得るために、期間を5分に設定し、実験の間隔タイプを未定義に設定します。運動ループ内で、ドラッグアンドドロップ機能を使用して、pH感受性およびpH感受性蛍光色素に個別に設定される2つの蛍光強度パネルを追加します。pH感受性色素の励起波長と発光波長をそれぞれ560ナノメートルと590ナノメートルに設定します。pH無感症色素に対してそれぞれ495および520ナノメートル。各フルオロフォアのフラッシュ数を 30、z 位置を 33,200 に設定します。4,750マイクロメートルの境界を持つ円で3×3として、ユーザー定義に井戸あたりの複数読み取りを設定します。開始をクリックしてバックグラウンド測定の読み取りを開始し、[大丈夫]をクリックして、湿度カセットの蓋が所定の位置にあることを確認します。測定の最後に、プレートをプレートリーダーから組織培養用安全キャビネットに移し、作りたてのデキストラン結合蛍光色素溶液を細胞のアプリカル表面に3マイクロリットル添加します。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに一晩戻す。キネティクスの測定では、バックグラウンド測定に使用する方法ファイルを開きます。すべてのパラメータが設定されたら、プレートリーダーの引き出しを開き、湿度カセットを挿入します。清潔なプレートをカバー付きの湿度カセットに入れ、クリックして蛍光測定値を開始します。次に、湿度カセットの蓋が所定の位置にあることを確認するために、大丈夫をクリックします。最低12サイクル後、一時停止をクリックして実験を中断し、プレートを取り除き、適切なサンプルに薬物またはアゴニストをバソラター的に適用します。プレートをトレイの湿度カセットに戻し、湿度カセットの蓋を再配置して、続けてクリックする前に、ASL pHをさらに記録し、処理の効果を監視します。situ pHキャリブレーションでは、プレートリーダーからプレートを取り出し、バソラテラ溶液を吸引します。高バッファリングされた標準曲線溶液の750マイクロリットルをバソラショナルコンパートメントに加え、溶液を1マイクロリットルの溶液を素地表面に加えます。プレートリーダーの二酸化炭素をオフにし、プレートを湿度カセットに戻します。次に、示されたのと同じパラメータをプレートリーダーに設定しますが、二酸化炭素は含まず、5分ごとに蛍光測定値を1〜1時間半開始します。データ分析では、各サンプルの平均データをすべて選択し、バックグラウンドファイルの両方の波長の条件を選択して、データをコピーして新しいファイルに貼り付けます。次に、各ウェルと各波長の平均背景を計算します。キャリブレーションとキネティックデータを同じ方法でコピーして貼り付けた後、各波長の各データポイントから背景を差し引きます。各時点とサンプルごとに、pH感受性とpH感受性蛍光との比率を計算します。各時間ポイントについて、比率から標準曲線を生成し、既知の pH 値を x 軸に、y 軸の比率をプロットします。比率が安定している時点を決定し、線形回帰直線に適合し、この線の方程式を得ます。次に、各時点の pH を計算し、y 軸に pH を、x 軸上の時間をプロットします。この代表的な予備実験では、同じpHと同じ濃度の細胞を含まない、pH感受性およびpH感受性の発光率は、色素の体積によって異なった。さらに、同じpHと同じ体積において、異なる色素濃度が異なる比率値を提供し、その体積または染料濃度の変化が発光率から算出されたpHの絶対値に影響することを示す。また、温度平衡に要する時間は、染料量や濃度に関係なく約15~20分です。単一のグローバル標準曲線から得られたASL pH値は、非嚢胞性線維症と嚢胞性線維症培養との間に有意な差を示す。一方、ASL pHは、独立した標準曲線からpHを計算する場合、嚢胞性線維症と非嚢胞性線維症ヒト気道上皮細胞との間で有意に異なっていない。したがって、各実験および各実験内で、各ドナーサンプルについて、較正曲線が一緒に平均化されるときのように、より高いpH感受性、pH感受性比値がより酸性pHを示す嚢胞性線維化培養において見られる独立した較正曲線を生成することが重要である。予想通り、バソラショナルフォルスコリンの添加は、非嚢胞性線維症培養物のみでASL pHを有意に増加させる。これらの細胞は無菌状態で保たれているため、後日の実験のために洗浄、再供給、使用することができます。すべての生物学的ヒト標本は潜在的に危険であると見なされるべきである。したがって、あなたのサンプルに応じて、適切なレベルの閉じ込めと個人用保護具を使用してください。ドナー間変動を低減し、精度を向上させるためには、サンプルの各セットに対してバックグラウンド測定とpHキャリブレーションを実行することが重要です。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

本報告書における調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも疾病管理予防センターの見解を示すものではない。...

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初代ヒト気道上皮細胞の気道表面液 pH をリアルタイムで半自動で蛍光測定

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