Name: フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 学ぶフィーダー・ゼノフリー条件下でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を分化させる方法。LM511-E8コーティングと流式細胞計測を用いて、CD34陽性・CD45陽性造血前駆細胞を効率的に産生する技術です。

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私たちは、彼らの技術支援に対して、有麗リーとセイコー・ベンノに感謝しています。また、渡辺晴美さん、行政支援を行ってくださったことに感謝します。本研究は、難治性疾患研究プログラム「ME.K.S.」の再生医療の実現に向けたiPS細胞研究センターネットワークの中核センターの支援を受けたものです。利用。AMED(17935423)の疾患特異的iPS細胞[M.K.S.]と科学技術振興機構(JST)イノベーションセンター[R.O.およびM.K.S.]。

1. 試薬
<ol><li>細胞株(ヒトPSC):胚性幹細胞(ESC)またはiPSC線409B2および201B7(317-9))およびCBA11のいずれかを得る。</li>
	<li>
試薬の調製
	<ol>
<li>PSCめっき媒体:10 μM Y-27632とPSCメンテナンス培地を混合し、4°Cで保存します。</li>
		<li>PSCスフェロイドタイリング培地:使用直前にPSCメンテナンス培地を625-1,250 ng/mLヒト組換えラミニンラミニン-511 E8フラグメント(LM511-E8)と混合します。 注:LM511-E8は、メディア15で混合することができる。フルレングスラミニン-511のような他のマトリックスは、事前にコーティングする必要があり、そうしたとしても、彼らは分化プロセス中に付着した中皮オルガノイドを維持しません。</li>
		<li>0日目分化培地:2 μM CHIR99021、80 ng/mL骨形態形成タンパク質4(BMP4)および80 ng/mL血管内皮成長因子(VEGF)とメソダーマル基底培地を混合する。</li>
		<li>2日目分化培地:1 μM SB431542、80 ng/mL VEGFおよび100 ng/mL幹細胞因子(SCF)とヘモジェニック基底培地を混合する。</li>
		<li>カルシウムやマグネシウムを使用せずにリン酸緩衝食塩水(PBS)を調べてください(材料の表を参照)。</li>
		<li>1 mMエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)バッファー:PBSの500 mLに0.5 M EDTAの1 mLを追加します。</li>
		<li>EHT培地:50 ng/mL SCF、20 ng/mLトロンボポエチン(TPO)、50 ng/mL Fms関連チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3L)、20 ng/mLインターロイキン-6/インターレウキン-6/インターレウキン-α(IL-6)を混合インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン、L-グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンB.</li>
		<li>FACSバッファー:2%の胎児子牛血清および1 mM EDTAとPBSを混合する。</li>
		<li>磁気分離バッファーを準備する(「材料の表」を参照)。</li>
		<li>メチルセルロースベースのメディアを準備する(「材料の表」を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PSCコロニー形成
<ol><li>0.5 μg cm-2 LM511-E8コーティングされた6ウェルプレートを37°Cのインキュベーターで5%CO2で70~80%の合流に成長させます。</li>
	<li>
PSC解離(日 -4)
	<ol>
<li>培地を吸引し、PBSで2回細胞を洗浄します。解離液で細胞をすすいで下します。37°Cで15分間インキュベートします(この時間では細胞は乾燥しません)。</li>
		<li>PSC維持培地で細胞を懸濁し、懸濁液を適宜大きさのチューブに移し、200×gで3分間遠心分離する。 </li>
	</ol>
</li>
	<li>PSC懸濁液を48,000~70,000セルcm-2(細胞株に応じて)の密度でマイクロ加工プラスチック容器にプレートし、5%CO2で37°Cインキュベーターで一晩インキュベートします。 注:96ウェルのマイクロ製造プラスチック容器に100 μLウェル-1の細胞懸濁液を推奨します。通常、20,000細胞を96ウェルプレートに-1でシードし、約100のスフェロイドを得ます。</li>
	<li>
PSC スフェロイドをタイリングするLM511-E8(日 -3)
	<ol>
<li>P1000マイクロピペッターを使用して穏やかにピペッティングすることにより、15 mL円錐形チューブにPSCスフェロイドを収集し、重力によって沈殿するために2分間室温に立つようにスフェロイドを残します。上清を吸引する。</li>
		<li>スフェロイドめっき媒体で懸濁液を、4-スフェロイドcm-2の密度で非コーティングされた6ウェル培養プレートに懸濁液を分配し、37°Cインキュベーターで培養し、3日間5%CO2で培養する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ヘモジェニック誘導(0日目)
<ol><li>培地を吸引し、5%O2及び5%CO2(低酸素インキュベーター)で37°CインキュベーターにDay0分化培地および培養剤を加加える。</li>
	<li>Day0分化培地で2日間培養した後、培地を吸引し、次いで低酸素化インキュベーターにDay2分化培地および培養を加える。</li>
</ol>4. ヘモゲン内皮の分離(4日目)
<ol><li>2日後、培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄する。解離液で細胞をすすいで下します。37°Cインキュベーターで30分間5%CO2でインキュベートします。</li>
	<li>1 mM EDTAで細胞を静かに懸濁して単一細胞レベルに解離し、懸濁液を50mL円錐管に移し、200 x gで細胞を遠心分離し、上清を3分間吸引し、300μLの磁気分離で細胞ペレットを懸濁する。バッファー。</li>
	<li>CD34+マイクロビーズと穏やかなピペを100 μLを追加します。室温で30分間インキュベートします。100 μL CD34+ビーズあたり最大2,000万個の細胞を使用できます。</li>
	<li>40 μmセルストレーナーを通して懸濁液をろ過します。</li>
	<li>磁気セパレータを使用してCD34+セルを分離します。</li>
</ol>5. 内皮から平行性への転移(EHT)
<ol><li>
フィブロネクチンコーティング
	<ol>
<li>PBSで1mg/mLフィブロネクチンを希釈して5μg/mLフィブロネクチンコーティング溶液の必要量を調製します。</li>
		<li>コーティング溶液の0.5 mLを24ウェル培養プレートの各ウェルに分配します。プレートを室温で30分間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>選別されたCD34+細胞を200xgで3分間遠心分離し、EHT培地の1mLで細胞ペレットを再ステースする。</li>
	<li>セル カウンタを使用して、実行可能なセル密度を決定します。EHT培地を添加して細胞密度を200,000セルmL-1に調整します。</li>
	<li>フィブロネクチンコーティングからコーティング溶液を吸引し、廃棄します。各フィブロネクチンコーティングによくCD34+セル懸濁液の0.5 mLを分配します。</li>
	<li>低酸素インキュベーターで1週間インキュベートします。</li>
</ol>6. 血化細胞のフローサイトメトリー解析
<ol><li>
フローティング セル コレクション:培養培地を15mL円錐管に移します。上清を吸引する場合は、200 x gで3分間遠心分離します。</li>
	<li>
付着細胞コレクション
	<ol>
<li>0.5 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。</li>
		<li>溶解溶液で細胞をすすいで、余剰液体を吸引します。</li>
		<li>プレートを37°Cインキュベーターで5分間インキュベートします。</li>
		<li>FACS バッファーの 1 mL でセルを再中断します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>浮動細胞と付着細胞を混ぜます。</li>
	<li>細胞を200 x gで3分間遠心分離し、上清を吸引する。FACSバッファの50 μLで再中断します。暗闇の中で室温で1時間抗CD34および抗CD45抗体で細胞をインキュベートする。</li>
	<li>PBSで2回、遠心分離機を200 x gで3分間洗浄し、0.5 μg/mL 4'、6-ダイアミド-2-フェニリンドールでFACSバッファーの0.5 mLで再中断します。</li>
	<li>フローサイトメーターでCD34およびCD45発現を測定します。</li>
</ol>7. 血化細胞のコロニー形成ユニット(CFU)アッセイ
<ol><li>
血化細胞コレクション:培養物から15mL円錐管に培地を移します。PBSで2回、井戸をゆっくりとすすいで下ろします。</li>
	<li>細胞を200 x gで3分間遠心分離し、上清を吸引する。EHT培地の1mLで再中断する。セル カウンタを使用してセル番号を決定します。</li>
	<li>抗生物質を添加したメチルセルロース系培体3mLに10,000細胞相当の懸濁量を加え、16Gまたは18G注射器で5回よく混ぜます。</li>
	<li>メチルセルロースベースのメディアサスペンション全体を6ウェルプレートの各ウェルに分配します。</li>
	<li>しっとりとした状態を保ちながら、2週間CO2を5%で37°Cインキュベーターでインキュベートします。料理の邪魔をしないでください。コロニーはモーションセンシティブです。</li>
	<li>2週間後、顕微鏡下でコロニーを数えます。</li>
</ol>

<ol><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).</li>
<li>Lancrin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haemangioblast+generates+haematopoietic+cells+through+a+haemogenic+endothelium+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage.</a> Nature. 457, 892-895 (2009).</li>
<li>Loh, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Pairwise+Choices+Leading+from+Pluripotency+to+Human+Bone%2C+Heart%2C+and+Other+Mesoderm+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types.</a> Cell. , 451-467 (2016).</li>
<li>Ng, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+HOXA%2B+hemogenic+vasculature+that+resembles+the+aorta-gonad-mesonephros%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros.</a> Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).</li>
<li>Batta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).</li>
<li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+path+to+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Defining the path to hematopoietic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).</li>
<li>Ivanovs, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+haematopoietic+stem+cell+development%3A+from+the+embryo+to+the+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish.</a> Development. 144, 2323-2337 (2017).</li>
<li>Blaser, B. W., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+HSCs+in+vitro%3A+don%27t+forget+the+hemogenic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium.</a> Blood. , (2018).</li>
<li>Speck, N., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+lineage+and+legacy%3A+the+development+of+mammalian+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+imunology%22%5BJournal%5D)">Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells.</a> Nature imunology. , (2008).</li>
<li>Niwa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+serum-free+monolayer+culture+for+orderly+hematopoietic+differentiation+of+human+pluripotent+cells+via+mesodermal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors.</a> PLoS One. 6, e22261(2011).</li>
<li>Sturgeon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+controls+the+specification+of+definitive+and+primitive+hematopoiesis+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).</li>
<li>Ditadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+definitive+haemogenic+endothelium+and+arterial+vascular+endothelium+represent+distinct+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages.</a> Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).</li>
<li>Sugimura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+and+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 545, 432-438 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Adhesion+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Using+Laminin+Fragments+in+an+Uncoated+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner.</a> Scientific Reports. 7, 41165(2017).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しない。

当社のフィーダーおよびゼノフリー定義誘導方法は、スケーラブルな方法でHE細胞を誘導するための正確で費用対効果の高いプラットフォームを提供します。従来のプロトコル10、11、12、13、14におけるヘモゲン内皮の忠実な形成は、PSCコロニー密度およびサイズの正確な制御の欠如によって妨げられている、モルフォゲン/サイトカインベースの指向分化の効率に影響を与えます。我々は、従来のプロトコルから各独立バッチにおけるヘモゲン内皮誘導の不整合を経験した。新しいプロトコルは、PSCコロニー密度とサイズの厳しい調節を可能にし、したがって、ヘモゲン内皮誘導の不整合を克服する。
我々は、スフェロイドの均一な形成を利用し、その後、合計4日間でHEを形成するためにフィーダーとゼノフリーの定義された状態を伝えた。我々は、スフェロイド形成がHE細胞の一貫した形成を保証する3つの独立した細胞株を用いて確認した。代表的な結果として、409B2細胞株は、3つの独立した実験に基づいて12.7%-23.6%CD34+細胞効率を得た。PSCスフェロイドをタイル化する重要な要因はLM511-E8です。私たちの経験では、マトリゲルやフルレングスラミニン製品などの他のマトリックスでこれを置き換えすることはお勧めしません。私たちは、中皮オルガノイドがマトリゲルから容易に切り離され、分化プロセス中に失われたことを経験しました。そして、マトリゲルまたはフルレングスラミニンのいずれも、事前コーティングなしで細胞を固定しません。
このプロトコルの潜在的な制限は、PSC を維持するために PSC メンテナンス 媒体に依存している場合です。StemFitなどの他のメディアをテストしましたが、造来誘導を危険にさらしました。おそらく細胞は、我々の短時間(4日間)誘導プロトコルで多能状態から出るのに耐性であった。他の培地でPSCを維持する場合は、PSC維持培地で細胞を適応させ、分化前にいくつかの通路を行うことをお勧めします。このプラットフォームは、細胞の系統的な操作と分析、および潜在的な臨床使用のための市販の生産と血化細胞の大規模な誘導を可能にします。このシステムの長期的な目標は、ヒト化マウスモデルにおける免疫不全疾患をモデル化し、責任ある細胞および分子機構を調査し、薬物スクリーニングを行うことです。

血液学的および免疫学的疾患に対する新しい治療法の開発は、疾患モデリングのための堅牢なプラットフォームの欠如と、患者由来の自家造血幹細胞(HSC)による高スループット薬物スクリーニングの欠如によって妨げられている。多能性幹細胞(PSC)。誘導(i)PSC技術のブレークスルーは、患者の細胞から疾患をモデル化するという約束を果たしているが、患者iPSCからの機能的HSCの確立は困難であった。ヒトPSCからHSCを導き出すために、胚パターンおよび転写プログラムの適切な誘導は、キー1、2、3、4、5、6、 7,8.ヘマトポエティック開発の最近の進歩は、HSC開発9におけるヘモゲン内皮(HE)の役割を実証している。HEはPSCから誘導することができ、遺伝子導入10、11、12、13などの下流介入に適しています。HEをプラットフォームとして使用し、5つの転写因子(ERG、HOXA5、HOXA9、LCOR、RUNX1)の組み合わせにより、長期的に生着し、複数の系統に分化する機能的HSCを誘導することに成功しました14。しかし、PSCからのHEの可変的かつ非効率的な生成は、市販の生産と臨床使用のための血行細胞の大規模な誘導と共に細胞の系統的な操作と分析を妨げている。
ここでは、フィーダーとゼノフリーの定義条件で4日間でHEを導出する費用対効果が高く正確な方法について説明する。この方法では、iMarix-511上のスフェロイド形成および自発的な再平坦化は、HE細胞の効率的な誘導に不可欠であるPSCコロニーの一貫した密度を保証する。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15575</td><td>0.5 M EDTA</td></tr><tr><td>40 &mu;mセルストレーナー</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>40&mu;M細胞ストレーナー</td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>353046</td><td>6ウェルプレート</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15240-112</td><td>ペニシリン/ストレプトマイシン/アムホテリシン B</td></tr><tr><td>抗CD34抗体</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A07776</td><td>抗CD34抗体</td></tr><tr><td>抗CD45抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>304012</td><td>抗CD45抗体</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&D Systems</td><td>314-BP-010</td><td>BMP4</td></tr><tr><td>CD34 マイクロビーズ</td><td>Miltenyi</td><td>130-046-703</td><td>CD34 マイクロビーズ</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>和光</td><td>038-23101</td><td>CHIR99021</td></tr><tr><td>エッセンシャル 6</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A15165-01</td><td>血行性基礎培地</td></tr><tr><td>エッセンシャル 8</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A15169-01</td><td>中胚葉基礎培地</td></tr><tr><td>エズスフィア SPマイクロプレート 96well</td><td>AGC</td><td>4860-900SP</td><td>微細加工プラスチック容器&nbsp;</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biosera</td><td>FB-1365/500</td><td>FCS</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>ミリポア</td><td>FC010-100MG</td><td>フィブロネクチン</td></tr><tr><td>FLT-3L</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ308-FK-005</td><td>FLT-3L</td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050-061</td><td>L-グルタミン</td></tr><tr><td>IL-6 / IL-6R&α;</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ8954-SR</td><td>IL-6 / IL-6R&alpha;</td></tr><tr><td>iMatrix-511</td><td>Matrixome</td><td>892 001</td><td>LM511-E8</td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51500-056</td><td>インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン</td></tr><tr><td>MACS バッファー</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td>磁気分離バッファー</td></tr><tr><td>Methocult 4435MethoCult&trade;H4435 Enriched</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>04435</td><td>メチルセルロース系培地</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>85850</td><td>PSC メンテナンス培地</td></tr><tr><td>PBS</td><td>nacalai tesque</td><td>14249-24</td><td>PBS</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>和光</td><td>031-24291</td><td>SB431542</td></tr><tr><td>SCF</td><td>R&Dシステム</td><td>ズ255-SC-010</td><td>SCF</td></tr><tr><td>ステムラインII造血幹細胞増殖培地</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>S0192-500ML</td><td>造血基礎培地</td></tr><tr><td>TPO</td><td>R&D Systems</td><td>288-TPN TPO</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12604-021</td><td>解離ソリューション</td></tr><tr><td>VEGF</td><td>R&Dシステム</td>ズ<td>293-VE-010</td><td>VEGF</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>和光</td><td>253-00513</td><td>Y-27632</td></tr></tbody></table>

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

ヒト多能性幹細胞(PSC)から機能的造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)を導出することは、血液学的および悪性疾患を治療するための自家移植の難解な目標であった。ヘモゲン内皮(HE)は、転写因子によって機能的なHSPCを産生したり、強牢な方法でリンパ球を誘導したりするのに適したプラットフォームです。しかし、HEを導出する現在の方法は、高価であるか、または収率で可変である。このプロトコルでは、フィーダーおよびゼノフリーの定義された条件で4日以内にHEを導出する費用対効果の高い正確な方法を確立した。その結果、HEは内皮から造血に転移し、CD34+CD45+クロノジェニック造血前駆術を産生した。機能的なHSPCを生成するための当社のプラットフォームの潜在的な能力は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広いアプリケーションを持つことになります。

PSCコロニーの形成の概略図を図1Aに示す。PSCスフェロイドは、1日の微細加工プラスチック容器上に形成される。代表的な結果として、20,000 409B2細胞は、微細加工プラスチック容器の96ウェル当たり処理することができましたが、他の細胞株は、より高密度(マイクロ製造プラスチック容器の96ウェル当たり30,000-40,000セル)を必要とする可能性があります。これらの球は、LM511-E8の存在下で培養皿にめっきすると、ほぼ2次元の培養物に自発的に平坦化される。
ヘモゲン誘導の概略図を図1Bに示す。PSCコロニーが直径750μmに成長すると、中皮オルガノイドを誘導するために培地が順次変化する。PSCコロニーは、4日目までの順次培地変化により中間筋オルガノイドとの分化中に徐々に日当たりの良い側アップ構造となる。4日目に、血原性内皮は磁気ソートによって中皮オルガノイドから指定され、その後EHT培地でフィブロネクチンにメッキされる。5-1000万CD34 +CD45-細胞は100万PSCを含むスフェロイドから期待される(図1C)。
細胞が内皮から血統細胞に形態的に変化することが観察される(補足ビデオ1)。7日目の造血カクテルによる刺激時の造血前駆細胞の代表的な位相対照画像を図2Aに示す。血化細胞コロニーが培養中に出現した。
代表的なフローサイトメトリープロットを図2Bに示す。全培養は無毛カクテルで刺激され、7日目には流量細胞メトリーによりCD34およびCD45の発現について分析する。血化前駆細胞はCD34およびCD45を発現する。
CFUアッセイは、CD34+CD45+造血前駆細胞からの顆粒球/マクロファージコロニーの生成を示した(図2C)。推定コロニー数は10,000セルあたり38 CFU-G/M (図 2D)
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2.jpg"> 図1:前記項PSCコロニーの概略図及びその後の無毛内皮による平隔化分化。(A) PSCコロニーを形成する概略プロセス。PSCはPSCの維持媒体のLM511-E8コーティングされた6ウェル版で維持される。4日目に、細胞を剥離し、解離溶液を使用して単一細胞レベルに解離し、その後、PSCメンテナンス培地の微細加工プラスチック容器にY-27632を用いてメッキし、一晩培養してスフェロイドを形成する。3日目に、スフェロイドはLM511-E8でPSCメンテナンス培地でメッキされ、3日間培養されます。0日目までに、スフェロイドはほぼ2次元の培養物に自発的に平坦化される。スケールバー = 200 μm. (B) 0日目に、培地をDay0分化培地に置き換え、低酸素インキュベーターで培養する。分化の2日目に、培地はDay2分化媒体に置き換えられます。血原性内皮濃縮の4日目に、CD34+細胞を磁気的に選別し、EHT培地中のフィブロネクチン被覆12ウェルプレート上で6日間培養する。(C)CD34でソートした4日目細胞のCD45及びCD34発現の代表的な流血量プロット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig1v2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59823/59823fig2.jpg"> 図2:無毛性固定資産の解析(A) 7日目に造血カクテルで刺激した後の造血前駆細胞の代表的な相対照画像。スケールバー= 200 μm. (B) 7日目の造来カクテルによる刺激時のCD45およびCD34発現の代表的なフローサイトメトリープロット。(C)11日目造血前駆細胞から生成された顆粒球/マクロファージコロニーの代表的な位相対照画像。スケール バー = 500μm ( D) 10,000 セルあたりの CFU の数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/59823fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Video" src="/files/ftp_upload/59823/59823vid1.jpg"> 補足ビデオ 1: EHT ビデオ.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59823/EHT_video.avi">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

ヒト多能性幹細胞から血液細胞を作製しています。この技術の主な利点は、我々は、ヘモ原性内皮細胞の一貫した、正確な収量を得るということです.当社のプラットフォームは、疾患モニタリングおよび治療薬化合物のスクリーニングに幅広いアプリケーションを提供することを期待しています。この技術は、血液学および免疫学の研究に特に有益である。この方法は、ヒト血液細胞の遺伝子介入または遺伝子編集に適用することができる。これは、ヘモ原性内皮細胞のベクターの容易な誘導を可能にする。最も重要なポイントは、PSCコロニーを入力するためのLM511-E8コーティングです。コーティングをスキップしたり、別のマトリックスに置き換えたりすることはお勧めしません。細胞を解離バッファでリンスする方法や、LM511-E8でプレートをコーティングする方法を示すため、視覚的なデモンストレーションは重要です。ヒト多能性幹細胞またはhPSCを、mTeSR1培地中のLM511-E8コーティングされた6ウェルプレート上で70〜80%の合流まで成長させます。ヘモ原性誘導の4日前に、培地を吸引し、PBSで2回洗浄する。解離液で細胞をリンスし、摂氏37度で15分間インキュベートする。PSC維持培地中の細胞を再懸濁し、1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに懸濁液を移す。細胞をGの200倍で3分間遠心分離する。上清を吸引し、PSCめっき培地中の細胞を再懸濁した。原稿の指示に従ってPSC懸濁液を微細加工されたプラスチック容器にプレートし、一晩インキュベートします。ヘモジェニック誘導の3日前に、PSCスフェロイドを15ミリリットルの円錐管にそっとピペットし、室温で2分間放置して重力で沈殿させる。上清を吸引し、スフェロイドめっき培地中のスフェロイドを再懸濁する。サスペンションをLM511-E8コーティングされた10センチメートルの培養皿に1平方センチメートル当たり4回転楕円体の密度で分配し、3日間インキュベートします。3日後、培地を吸引し、分化培地をゼロ日に添加し、細胞を低酸素インキュベーターで2日間培養した。次いで、培地を1日ゼロ吸引し、2日目の分化培地を加え、さらに2日間培養する。2日後、培地を吸引し、PBSで細胞を2回洗浄する。解離液で細胞をリンスし、5%の二酸化炭素で摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を1ミリモルEDTAで穏やかに再懸濁して解体する。懸濁液を50ミリリットル円錐形チューブに移し、200倍Gで細胞を3分間遠心分離する。上清を吸引し、300マイクロリットルの磁気分離バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。100マイクロリットルのCD34陽性マイクロビーズを細胞に加え、ピペットで軽く混ぜます。室温で30分間インキュベートし、40マイクロメートルの細胞ストレーナーを使用して懸濁液をひずみ、磁気セパレータを使用してCD34陽性細胞を分離します。24ウェル培養プレートの各ウェルに1ミリリットルフィブロネクチンコーティング溶液あたり5マイクログラムの0.5ミリリットルを分配し、室温で30分間プレートをインキュベートします。一方、200倍Gで並べ替えられたCD34陽性細胞を3分間遠心し、1ミリリットルのEHT培地でペレットを再懸濁した。セルカウンターで生存細胞密度を決定し、EHT培地を添加して細胞密度を1ミリリットル当たり200,000個の細胞に調整します。フィブロネクチン被覆ウェルからコーティング液を吸引し廃棄し、各ウェルに0.5ミリリットルのCD34陽性細胞懸濁液を分配する。細胞を低酸素インキュベーターに1週間インキュベートします。浮遊細胞を集めるために、培養培地を15ミリリットル円錐管に移し、遠心分離機を200回Gで3分間移動させる。その後、上清を吸引します。接着性細胞を回収するには、0.5ミリリットルのPBSで2回洗浄し、解離バッファーで洗い流します。余剰液を吸引し、5分間摂氏37度でプレートをインキュベートする。Facsバッファーの1ミリリットルで細胞を再懸濁し、浮遊細胞と付着細胞を混合する。混合細胞をGの200倍の3分間遠心分離し、その後上清を吸引し、50マイクロリットルのFacsバッファーで細胞を再懸濁する。50マイクロリットルのFacsバッファーで抗CD34抗体と抗CD45抗体を希釈し、細胞に加え、暗闇の中で室温で1時間培養します。次いで、細胞をPBSで2回洗浄し、各洗浄後3分間G200倍で遠心分離する。上清を吸引し、1ミリリットルダッピーあたり0.5マイクログラムのFacsバッファーの0.5ミリリットルで細胞を再懸濁します。フローサイトメトリーによりCD34およびCD45発現を測定する。造血細胞を収集するには、培養液を15ミリリットル円錐管に移す。残りの細胞をPBSで2回やさしくすすいで回収します。細胞を200倍Gで3分間遠心分離し、上清を吸引し、1ミリリットルのEHT培地で再懸濁する。細胞を数えた後、メチルセルロース間隔培地の3ミリリットルに10,000細胞を加え、抗生物質を補い、16ゲージの注射器を使用して5回混合します。メディアのサスペンション全体を6ウェルプレートの各ウェルに分配します。細胞を湿らせた状態に保つには、プレート上の空の井戸に水またはPBSを加えます。コロニーが動きに敏感であるように皿を邪魔しないように、2週間細胞をインキュベートします。2週間後、顕微鏡下でコロニーを数えます。細胞は、造血カクテルを刺激すると、内皮細胞から造血細胞に形態的に変化する。造血細胞コロニーが培養物に出現する。造血前駆細胞はCD34およびCD45を発現するので、フローサイトメトリーはCD34およびCD45の発現を解析することによって造血細胞コロニーの存在を確認するために使用される。コロニー形成ユニットアッセイは、CD34陽性およびCD45陽性造血前駆細胞からの顆粒球またはマクロファージコロニーの生成を実証した。コロニー数は、10,000細胞当たり38コロニー形成単位であると推定した。最も重要なステップはPSCスフェロイドを集計することです。表面メトリックがこのプロトコルの効率において最も決定的な要因であることがわかった。この手順は、天然細胞およびマクロファージなどの細胞の既製化を続けることができる。このプラットフォームにより、研究者は人造血の開発における重要な決定要因を探求することができます。

hemogenic-endothelium-differentiation-from-human-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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学ぶフィーダー・ゼノフリー条件下でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を分化させる方法。LM511-E8コーティングと流式細胞計測を用いて、CD34陽性・CD45陽性造血前駆細胞を効率的に産生する技術です。

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

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