Name: 行動実験に用いたジャンプクモのカラーパターンの操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶジャンプクモの色彩パターン操作法。エナメル塗料とメイクアップを用いて小型節足動物の体色を精密に変更し、性選択や捕食回避などの行動実験を可能にする革新的な手法を解説します。

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この作品は、国立科学財団 (IOS-1557867 LAT)、フロリダ自然史博物館、およびフロリダ大学の昆虫学と Nematology 部門からの資金援助によって支えられました。この記事の出版料は、フロリダ大学オープンアクセス出版基金によって部分的に資金を供給されました.

1. 機器の準備
<ol><li>適切な塗料を選択。<ol>
<li>アプリケーションを成功させるには、速乾性のある塗料を使用し、薄い質感でも簡単に操作できるようにします。使用されている製品には、水で薄くすることができる非防水アイライナー、エナメルシンナーで薄くすることができるエナメル塗料 (材料のテーブル) が含まれます。</li>
		<li>クモを塗るとき、ほとんどの種の甲羅は、柔らかい腹部がしばしば伸びて、40を供給すると収縮しながら、硬化した外骨格を有することを考慮してください。<ol>
<li>エナメル塗料は、塗装面にしっかりと硬化したコーティングを生成します。したがって、キューティクルの硬い部分 (例えば、甲羅、脚、pedipalps) にそれらを適用します。このようなエナメルコーティングは、腹部が餌で形を変えるのでクモの皮をむくので、クモの abdomens にはあまり効果がありません。</li>
			<li>対照的に、アイライナーは硬化したコーティングを生成せず、むしろ着色されたボディスケールに浸透する。そのため、ハードとソフトの両方のボディパーツ (スパイダー abdomens を含む) で使用します。 注: 次のステップでは、クモの顔と pedipalps を塗ることから成る最も繊細なテクニックが提示されます。エナメル塗料が使用されており、エナメル塗料の色の多様性により最も汎用性方法です。</li>
		</ol>
</li>
		<li>可能であれば、生きている動物に塗料をテストする前に、最初のスペクトルに不要な UV ピークがないことを確認するために、UV-VIS 反射率分光光度計を使用して、塗料のスペクトル特性 (単に紙または別の表面に適用) を測定する人間には見えませんが、研究された種に見える可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>より容易にドキュメンテーションのための操作および増加の再現性 (材料のテーブル) の結果の写真を取るためにカメラおよびコンピュータに接続される解剖顕微鏡を使用しなさい。<ol>
<li>カメラ入力を処理する顕微鏡、コンピュータ、およびソフトウェアをオンにします。</li>
		<li>最終的な画像が撮影される、関連するズームを選択します。</li>
		<li>昆虫の取り付けピンまたは小さな釘 (頭を外側に向ける) を、非硬化モデリング粘土 (約ブドウの大きさ) のボールに刺します。(ペイントされるライブスパイダーは、以下のステップ3.1 でこのピンのヘッドに一時的に取り付けられます)。モデリング粘土とピンを顕微鏡の下に置き、ピンの頭 (クモが取り付けられる場所) におおよそ焦点を合わせるように目的を調整します。</li>
		<li>目的が画家の目にとって正しい距離にあること、およびカメラが塗装中に視界を妨げていないことを確認してください (カメラが oculars の1つに取り付けられ、奥行き知覚を妨げる場合など)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>きれいなプラスチックスナップキャップバイアルにクモを転送します (約 12 dram, 任意のウェビングや死んだ獲物なしで).</li>
	<li>取り付けと塗装装置を準備します。<ol>
<li>余分な薄い虫の取り付けピンを、(ステップ1.2.3 で使用されている) 非硬化モデリング粘土のボールに置き、顕微鏡の左側に (右利きの人のために) 置きます。このピンは、塗装中にスパイダーの脚と pedipalps の位置を調整するために使用されます (必要に応じて)。</li>
		<li>(ペーパータオルなど) の吸収性の紙の小片、白いプリンタ紙、適用する塗料 (ここでは、エナメル塗料) を取得し、シンナーの別の容器 (各色に加えて透明で清潔なものに1つずつ)、各色のための個々のマイクロブラシ(材料の表を参照してください)、および1マイクロブラシはきれいなシンナーでのみ使用され、すべては顕微鏡の右 (右利きの人のために) で組織的な方法で配置されています。</li>
		<li>爪楊枝を使用して、開いたプラスチック皿 (小さなペトリ皿やバイアルキャップなど) にペンキの滴を加え、小さな注射器などで塗料を薄くします。マイクロブラシで白いプリンタ紙にそれをテストすることにより、右の一貫性に爪楊枝で2を混ぜます (塗料が完全に均質化し、あまりにも鼻水はありません)。 注: 特定のケースでは、塗料がすぐに乾く場合は、アプリケーションに必要なより少し液体でそれを準備し、ブラシが後で使用するまでシンナーの鍋に浸してみましょう (ステップ 4)。</li>
		<li>水ベースの接着剤 (材料の表を参照) のエンドウ豆サイズのドロップを、プリンタ用紙の角に置きます。 注: これは準備の最後の段階でなければならず、次のステップは、接着剤が乾燥しないように、この後すぐに起こる必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. クモの麻酔
<ol><li>バイアル内のクモとひらがを防ぐために、開口部の上に手を通して、ゆっくりと、クモの第3の足が180度まで伸びるまで co2 ガスを加える。</li>
	<li>種の平均サイズと個々のクモに応じて、約20秒から1.5 分までの CO2への暴露時間を使用します。我々は、 pyrrithrixにおける麻酔の適切なレベルの信頼できる指標となるように、第3の足のペアの延長を発見したが、これは種によって異なる可能性がある。これらの技術を初めて異なる種で使用する場合は、最初にいくつかの標本で麻酔をテストし、その応答を評価します。</li>
	<li>必要なレベルの麻酔を達成するために、できるだけ少ない CO2を与えてください。ここで説明した麻酔の短い期間は、死亡率を産生しませんでした (そして、非麻酔されたクモからの顕著な行動の違いはありません), 実験ですべての動物に同じレベルの麻酔を与えます (シャムコントロールを含む).</li>
	<li>クモを麻酔下に維持するために CO2を加えた後に、バイアルを閉じたままにします。したがって、スパイダーがどのくらいの期間、CO2にさらされるかを計算するときに、この時間が含まれます。</li>
	<li>スパイダーは、色の操作を開始するためにバイアルから除去された後、約1〜2分間完全に麻酔をかけたままになります。したがって、次の手順 (セクション 3-6) を速やかに実行してください。この限られた時間枠のために、生きているクモを塗る前に、(練習のために) 死んだ標本を使って以下の塗装方法を試みてください。</li>
</ol>3. クモを顕微鏡下に取り付ける
<ol><li>顕微鏡の視野に用意されたモデリング粘土の取り付けピンまたは釘の頭の上に非常に少量の接着剤を加えます。 注: 場所にクモを維持することができます接着剤の最小量を使用して、私) クモがピンヘッドの外にスライドしないことを確認する (あまりにも多くの接着剤が使用されている場合)、および ii) クモは目覚めた後、自分自身を解放するために管理します。</li>
	<li>麻酔をかけたクモをその腹側を上にしてテーブルの上にそっとスライドさせます。 注: スパイダーの abdomens は柔らかいため、スパイダーをテーブルにタップまたはドロップしないようにして、けがの原因となる可能性があるので注意してください。</li>
	<li>クモが適用された小さな圧力の下でわずかにバウンスし、足を伸ばすようにクモの胸骨 (クモの足が体に付着する中央の領域) 上のピンヘッド (接着剤で) をそっと押します。加えられた圧力の余分制御のために、モデリング粘土を両手で持ち、両手をテーブルにしっかりとねらう。</li>
	<li>ペイントする領域が上向きで焦点を合わせているように、顕微鏡下でモデリング粘土の位置を変更します。</li>
</ol>4. クモの絵を描く
<ol><li>クモにペイントブラシに触れる前に、塗料の一貫性を評価します。<ol>
<li>塗料の一貫性を再試験 (シンナーで維持されている場合は、吸収紙を使用してブラシを拭き取る)、必要に応じて再度調整し、常に最初にブラシヘアに含まれる塗料の量を制御するために、プリンタの用紙にペイントを適用してみてください。</li>
		<li>右手で顕微鏡を見ながら、ブラシの先端を視界に入れ、ブラシの毛があまりにも多くのペンキを含んでいないこと (2 度目) を確認し、その場合はその一部をプリンタの紙の上に拭きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クモの塗料の一貫性をテストします。<ol>
<li>ペイントする必要があります最大の領域にブラシでクモをタッチします。これは、塗料の一貫性と量が右であるかどうか (すなわち、塗料がわずかに、ゆっくりと徐々にクモの毛/スケールにしみ込む) かどうかを画家に通知します。<ol>
<li>ペイントが適用されない場合は、ブラシをペイントに浸し、ステップ4.1 に戻って手順を繰り返します。</li>
			<li>塗料が塗料で覆われるべきではない領域に急速にしみ込むと、こぼれが最小限であり、個体がまだ実験に参加できると仮定する場合は、吸収紙の上にブラシを拭き、ステップ4.1 に戻って繰り返します プロシージャ。 注: このタイプの液体こぼれは固定できません。漏出が chelicerae または眼、またはその他の個人にとって有毒である可能性のあるその他の部分に到達した場合、それが目覚めてクモを実験から排除する前に、それを euthanize するためにすぐに冷凍庫にクモを置くことを検討してください。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ4.1 と4.2 の次の色を必要とするすべての領域をペイントします。<ol>
<li>スパイダーの顔をペイントする場合は、左手で余分な細いピンを使用して、前脚と pedipalps を押さえます (ペイントの邪魔にならないようにします)。これは、クモの付属器の損傷を避けるために顕微鏡を通して見ながら行うのが最善です。また、クモの顔を塗る場合、そして、ペイントするために使用されるブラシに応じて、目の間の中央部分をペイントしようとする前に、顔の両側を塗ることを検討してください-両方の塗装領域は、クモの顔に平行にブラシを保持することによって接合することができます毛管作用を誘導する。 注: クモの顔を塗るときは、最初に利き手に最も近い側をペイントしてから、顕微鏡の下にある粘土の球を回転させて反対側をペイントし、続いて真ん中を描くのが最も簡単です。</li>
		<li>Pedipalps や脚をペイントするときは、塗料が硬化している場合 (エナメル塗料など)、関節に触れないように注意し、男性の精子送達器官 (pedipalps の遠位セグメントの下側) には塗料を塗布しないようにしてください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. クモの絵を撮る
<ol><li>目的をカメラモードに切り替えます。</li>
	<li>コンピュータソフトウェアを使用して写真を撮影し、選択したズームが顕微鏡で選ばれたものであることを確認し、スケールバーを追加することができます。</li>
</ol>6. ピンまたは釘からクモを離す
<ol><li>クモが動き出すと、クモの前脚がクモのバイアルに触れているようにピンを持ちます。</li>
	<li>クモがそれ自体を解放してみましょう、と必要であれば、クモが乾燥接着剤から離れて自分自身を引っ張るのを助けるために、慎重にピンを傾けます。<ol>
<li>絵が完成する前にクモが目覚めた場合, クモは再び麻酔される前に回復するために、少なくとも15分を許可します.これが行われる場合、すべてのグループが同じ麻酔レベル (該当する場合は、偽治療された個体を含む) を得ることを確認します。 注意: クモは、操作後急速に正常な行動を再開するように見えます (< 15 分) しかし、我々は行動試験でスパイダーを使用する前に12時間の標準化休息時間をお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. クモの行動の分析
<ol><li>Unmanipulated、シャム処理、および操作された被験者の行動を比較して、アプリケーションの潜在的な毒性 (特定の塗料の種類、色、応用領域、および研究種によって異なる場合があります) を評価します。比較対象となる行動には、活動率、実行された活動の種類、特定の活動の実行における成功 (例えば、獲物の捕獲) などがあります。<ol>
<li>制御しながら個々の色を変更するために (例えば、非可視領域上の塗料アプリケーションを受信したり、同じ領域に適用される中間色の塗料を持っている) 実験計画の一部として、偽処理されたクモを使用しますその他の要因 (例えば、処理時間、臭気、表面の質感など)。 注: 脚または pedipalps を塗装する場合、これが感覚毛 (スパイダーレッグおよび pedipalps で流行している、Foelix 201040を参照) と干渉する可能性があることを考慮し、これらの場合には、偽治療の男性には中性色の塗料を塗布する必要があります。コントロールと同じ領域。</li>
		<li>新しいメソッドを開発するときは、ペイントされたスパイダーと unmanipulated スパイダーを比較して、カラー操作の個人がまだ正常に動作するかどうかを評価します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 塗装された被写体に対する色操作の反射率特性の測定
<ol><li>一度安楽死 (クモが実験に関与した後、またはこの目的のために具体的に安楽死された後、下記の注を参照)、標準的なポータブル UV VIS 分光光度計 (材料の表) を使用して色操作のスペクトル特性を測定)、特に直径1mm より大きい領域については。</li>
	<li>小さいエリアでは、より簡単でより正確な測定のために特注の microspectrophotometer (UV-VIS 分光光度計) を使用して、顕微鏡の光学系は UV 光をカットしますが、測定はヒト可視波長 (テイラー et al. 201141参照)。</li>
	<li>色操作された領域が非常に小さく、UV 反射率データが必要な場合は、市販の UV VIS microspectrophotometers を使用しますが、それらはより高価です (テイラー et al. 201442を参照)。 注: UV VIS 分光光度計の光源には、UV 光が含まれており、動物の目 (私たちを含む) に危険なことがありますので、スペクトルの測定は、動物を安楽死させ、単に麻酔をしないで行う必要があります。エナメルで塗られたクモの場合、これは、塗料が磨耗しないので、クモが実験に使用した後に行うことができます (以下の代表的な結果を参照)。数日または数週間後にフェードすることがある水性塗料の場合、スパイダーのセットは、それらの対が実験に関与するときに測定のために犠牲にすることができる (実際の色操作を反映するデータをキャプチャするために実験)。塗料のスペクトル特性を報告することは、色操作を複製したいと思うかもしれませんが、同じ特定の塗料製品へのアクセス権を持っていない他の研究者による複製を可能にします。</li>
</ol>

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</ol>

作者は何も開示することはありません。

ここでは、節足動物の小さな身体部分の色が、化粧やエナメル塗料などの着色剤を使用して効果的に操作できることを示しています。
こうした繊細な操作を実現するための最初の重要なステップは、通常は手に持たせることができない小動物を固定化できることです。ここでは、クモの顔を飛び越えるなどの敏感な領域をペイントすることができるように、我々は CO2で個人を麻酔し、ピンの頭の上にそれらを取り付けました。これにより、クモが目を覚ましていた場合 (顕微鏡からの光が塗装プロセス中に顔に輝いている場合)、スパイダーが直面する可能性のあるよりも少ないストレスでクモの眼に近い作業が可能になります。
この方法はまた、良質のマイクロブラシ、および、最も批判的に、適切な着色物質を得る必要があります。こぼれのないペンキを塗ることの最も困難なステップが、よい適用範囲と右の一貫性を得ることである。したがって、着色物質は、容易にシンナーで希釈される必要があり、かつ容易に肥厚するために乾燥する。異なるタイプの塗料を使用することができます。ここでは、結果は水溶性 (非防水) アイライナーとエナメル塗料で示されています。非防水アイライナーは、水と混ぜると簡単に液化できるという利点があります。しかし、これは色素沈着の希釈によってトレードオフになります (これは望ましいかもしれません (例えば図 3を参照)。エナメル塗料は、完全なカバレッジを提供しながら、エナメルシンナーを追加することによって容易に制御することができる一貫性を持っています。しかし、この特性は、塗装された身体部分の毛髪またはスケール構造を維持する可能性と共にトレードオフします。また、エナメル塗料は長続きします。これの欠点は、エナメル塗料やシンナーは、アプリケーション中に、乾燥する前に強い臭気を放出することです。着色物質に関するもう一つの難しさは、右のスペクトル特性を持つ、右の色合いを見つけることであるかもしれません。これは、アイライナーは、多くの場合、赤よりもピンクのように、黒のアイライナーと並行して使用するために赤いアイライナーを取得するのは難しいです。また、(顕微鏡下でのみ表示されることがあります) グリッターを含まないメイクアップパウダー (または顔料) を得ることも困難です。多くのメイクアップ製品は、実験人には見えないが、研究された動物に目立つかもしれない UV 光を反映しています。
体の部分に着色剤を直接塗ることによって節足動物の色彩を操ることは、他の方法と比較すると、利点と不便さを伴います。その主な制限は、1つは絶対にいくつかの微妙な毒性効果の可能性を閉じることはできません。.しかし、すべての治療カテゴリにペイントを適用することによって1つの治療グループに対してバイアスを導入しないことを保証することができ、また、ペイントアプリケーションが関心のある動作を妨げるかどうかをテストすることができます。ここで提示された方法では、我々は、ペイントアプリケーションがマイナスの効果 (表 1および表 2) に無視できるようになったことを示唆するのに十分な証拠を集めました。この方法の主な利点は、色の小さなパッチをターゲットにすることができ、その色は「取り除かれた」 (図2参照)、鈍く (図3)、またはより明るい (図4)、体の着色の残りの部分から分離して、個人の環境。これは、照明条件を操作することで構成される最も一般的な代替方法とは対照的で、それによって、個人およびその周辺全体の視覚的な外観が変更されます。実際、照明条件を特に操作しない場合でも、照明環境が適切な39でない場合、色を操作し、この操作の効果が限定的であるかどうかを確認することができます。したがって、実験が行われる光環境 (つまり、放射照度) を測定して考慮し、自然光の状態に厳密に一致させることが重要です (たとえば、完全なスペクトルの電球を使用して、捕獲時の自然光)。全体的に、マイクロブラシと顕微鏡を使用して、このプロトコルは、無脊椎動物に以前使用されている他のほとんどの直接着色法よりも小さな色のパッチのより正確な操作を可能にします。ほとんどの以前の研究は、ジャンプクモの顔に比べて比較的大きい色のパッチを持つ動物を使用しています (例えば、蝶の翼の色29、34、35、大人の体の操作hemipterans (「真のバグ」)30、36およびバッタ31、または比較的大きな狼クモ32、33、37の脚。ここで提示される方法は、その小さなサイズのために understudied された分類群上の色のパッチの驚くべき多様性を研究する機会を開きます。
同様の技術は、固定化または麻酔することができる他の節足動物に適用することができ、塗料が個人の運動性または健康に影響を与えない領域 (すなわち、関節などの領域を除く、必要とされる毛髪または arolia のような構造適切な移動、口パーツ、または呼吸構造などのオリフィスの場合)。これらのテクニックは、広く利用できる染料、塗料、化粧のより大きなパレットを含むように拡張することもできます。
最後に、これらの繊細な技術は、小さな生物の色を操作するだけでなく、比較的大きな生物のパターン (縞模様など) を操作するのにも使用できます。これは、性的選択、コミュニケーション、aposematic の獲物の信号、動物が色を使用する他の文脈の独自の研究に私たちの方法を適応させることができる多種多様な研究者にとって有益であるべきです。

動物はしばしば、性的遭遇、アゴニスト性の出会い、または捕食を抑止するために、精巧な色彩パターンを持っています。これらの形質は、信号機の個々の品質などの受信機に対する情報を仲間1として伝達し、競合2としての戦闘能力、または獲物項目3としての嗜好性とすることができる。色とりどりの特性の適応的な目的を理解するために、研究者たちは、種々の方法で色彩を操作することを含む実験を計画した。一部の研究者は、モデル4、5、6、7、8、写真9、またはビデオ10、11などの色のデコイの刺激を使用している、 12は、行動実験で受信機に提示される。その他、特に無脊椎動物を使用する場合、ライブ個人の色の外観に影響を与える照明環境を操作している13、14、15、16、17. すべてのこれらの操作, 独創的ながら, 潜在的に重要な自然の行動を削除し、興味のある形質よりもはるかに多くに影響を与える欠点を持っています。.鳥などの大きな脊椎動物では、研究者は非常に多くの場合、生きている動物に直接色を操作します (ヒルとマグロウで見直され、200618)。個々の羽またはくちばしは、マーカー2、19、20、21、22、23、24で直接着色されており、lighteners25、26、27、またはマニキュア28を含む様々な塗料によく使用される過酸化水素を含む染料。無脊椎動物において、生きた動物に直接カラーパターンを操作するような研究は比較的稀であるが、依然として色の機能と進化についての計り知れない洞察を提供している29,30,31 、32、33、34、35、36、37、38、39。節足動物の研究でさえ、比較的 understudied に非常に小さな種の色のパターンを残して、より容易に処理し、塗装することができるより大きな分類群に偏っているように見える。
ここでは、非常に小さな動物の分類群のために開発された繊細な色操作技術について説明します。具体的には、この方法は、メイトの選択と性の共食いの文脈でこのような色とりどりの形質の重要性を調査するために、顕微鏡下で男性跳躍クモの顔の色を操作することを含む。この例では、モデル種としてHabronattus pyrrithrix (米国フェニックス、アリゾナ州から収集) を使用しました (図 1)。私たちは、他の38、39、これらの技術のいくつかを使用して実験的な作業の結果を発表しましたが、ここでは、他の人がアクセスできるようにする方法で、以前に行われたものよりも詳細にメソッドを説明しますそれらを複製または他の非常に小さな分類群で使用するためにそれらを適応しようとしています。このようなプロトコルは、最も象徴的な鳥のようにカラフルにすることができるが、それは通常 understudied である動物に実験の機会を開く必要があります。

<table><tbody><tr><td>CO2タンク</td><td>エアガス (ラドナー、ペンシルバニア州)</td> <td>#CD 50</td><td>クモを麻酔する</td></tr><tr><td>エナメル塗料シンナー</td><td>テスター (バーノンヒルズ、イリノイ州)</td><td>75611792569</td><td>薄いエナメル</td></tr><tr><td>塗料 フラットエナメル塗料</td><td>テスター (バーノンヒルズ、イリノイ州)</td><td>赤:075611115009、黒:075611114903、白:075611116808</td>エ<td>ナメル塗料シンナーで薄くすることができます</td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ツァイス(イエナ、ドイツ)</td><td>ステミ508</td><td>精密で小さな領域をペイントする</td></tr><tr><td>光顕微鏡カメラ</td><td>ツァイス(イェーナ、ドイツ)</td><td>Axiocam 105色</td>は<td>、ドキュメンテーションのための操作の前後の写真を撮る</td></tr>ために <tr><td>光顕微鏡カメラソフトウェア</td><td>ツァイス(イェーナ、ドイツ)</td><td>ゼン2ブルーエディション</td>は<td>、操作の前後に撮影した写真を処理するために</td></tr>リ<tr><td>キッドライナーアイライナー、シェード "倒錯」</td><td>Urban Decay (Costa Mesa, CA)</td><td>(販売終了)</td><td>水で薄くできる非防水アイライナー; アイライナー 2</td></tr><tr><td>MegaLiner リキッドアイライナー, ブラック</td><td>WetnWild (Los Angeles, CA)</td><td>SKU# 871A</td><td>非防水アイライナー 水で薄くできる; アイライナー 1</td></tr><tr><td>マイクロブラシ</td><td>MicroMark (Berkeley Heights, NJ)</td><td>#84648</td><td>to allow precise painting of small areas</td></tr><tr><td>Non-hardening modelling粘土</td><td>ヴァンアーケン国際Claytoon(ノースチャールストン、サウスカロライナ州)</td><td>18165</td>は<td>、小さな釘や昆虫のピンを貼り付け、柔軟にそれらの角度を調整するために</td></tr>小さな<tr><td>釘や昆虫の取り付けピン</td><td>BioQuip(ランチョドミンゲス、カリフォルニア州)</td><td>#1208B7</td> だけでなく、<td>クモを遠ざけるために接着する</td></tr><tr>スナップキャップ昆虫収集バイアル<td>BioQuip(ランチョドミンゲス、カリフォルニア州)</td><td>#8912</td>の<td>蓋のような小さなプラスチック容器</td>をペイントするエリアの前の付属物は、<td>塗料とシンナーを右の一貫性に混合する</td></tr><tr><td>小さなシリンジ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1482910F</td><td>エナメルシンナーSpectralon</td></tr><tr><td>ホワイトスタンダード</td><td>Labsphere Inc.(ノースサットン、ニューハンプシャー州)</td><td>WS-1-SL</td><td>の蓋を転写します色のスペクトル特性を測定するには</td></tr><tr><td>UV-VIS分光光度計</td><td>オーシャンオプティクス(ダニーデン、フロリダ州)</td><td>USB 2000(分光光度計)とPX-2(光源)色の</td><td>スペクトル特性を測定するために</td></tr>水<tr><td>溶性学校の接着剤</td><td>エルマーズ(ノースカロライナ州ハイポイント)</td><td>#E304</td><td>クモを釘/ピン</td></tr><tr><td>ウッドつまようじ</td><td>に取り付けるためにアップ、ターゲットコーポレーション(ミネソタ州ミネアポリス)</td><td>#253-05-0125</td><td>エナメル塗料の滴を転写する</td></tr></tbody></table>

行動実験に用いたジャンプクモのカラーパターンの操作

Manipulation of Color Patterns in Jumping Spiders for Use in Behavioral Experiments

行動生態学の分野では、多くの実験が、性的選択と捕食の文脈における色彩的形質の進化目的を調査するように設計されている。方法は様々であるが、主に多様な着色剤を有する個体の色パターンを改変することからなる。このような技術は、多くの脊椎動物の分類群、特に鳥類で使用されてきたが、小さな生物において色を効果的に操作する難しさのため、無脊椎動物のために未発達のままである。代わりに、無脊椎動物の外観を操作するために、科学者は通常、特定の波長をフィルタリングするために照明環境を変更しました。しかし、そのような方法は、対象となる表現型の形質だけでなく、個体およびその周囲の全体の外観にも影響を及ぼす。ここでは、以前にカラフルな鳥に使用されていた技術をスケールダウン、我々は同様に象徴的しかし understudied 種を使用して、小さな節足動物の色を操作する方法を提示します: カラフルなジャンプクモ。

色操作の有効性
これらの技術を使用して、色を完全に隠蔽したり、強度を低減または強化するなど、さまざまな度合いのカラー操作が効果的です。これは、写真とスペクトル反射率の測定値の両方から明らかです (図2、図3、 図 4)。ここでは、自然な赤い顔の男性と比較して、カラー操作された男性Habronattus pyrrithrixを示します。スペクトル特性は、直径1mm と小さい色の領域を正確に測定できる UV VIS 分光光度計 (材料表を参照) を使用して測定しました。測定は、拡散反射率白色規格 (材料表参照) に対して相対的に行った。
まれに (彼らの顔に黒いアイライナー 1 (材料のテーブルを参照) で塗装された108の男性のうち 5) は、水溶性のアイライナーは、週または2週間後にクモの顔をオフに着用し始めました。これは、アイライナーの他のブランド (アイライナー2、材料のテーブルを参照) のために観察されませんでした。どちらの場合も、スパイダーのケージは週に3〜5回、水で噴霧されました。メンテナンスの異なる条件は、水性塗料の摩耗に影響を与える可能性があります。エナメルのペンキはまだ6か月後に生きているそれらのためのすべての操作された男性 (n = 221) のために無傷であった。
色操作の潜在的な毒性
自分の視界を妨げないようにクモの目にペンキをつけたり、chelicerae、口の部分や他のオリフィス、そして可能性のある摂取と中毒を防ぐために他の柔らかい体の部分に塗料を入れることを避けるべきです。また、可動性や感覚系を制限しないように、感覚の毛 (脚や pedipalps など) を含む関節や部品の塗装にも注意する必要があります。しかし、これらの身体領域の色の操作が必要な場合、または微妙な負の影響の可能性について疑問がある場合は、すべての治療カテゴリの個体に塗料を適用するのが最善です。こうすることで、1つの治療法に偏っているような方法で、個人の感覚系を操作することを避けることができます。例えば、図 4に示す操作をした男性を用いた実験では、求愛中に男性が表示する赤い斑点の数を増減させることを目的とした。いくつかの男性は彼らの自然な赤い顔が灰色のエナメル塗料で隠されている (赤の量を減少させる) ので、赤の顔を維持したい他の男性は、灰色面と同じ製品で、自然に赤い顔の上に赤く塗った男性。同様に、特定の男性の pedipalp に赤色のパッチを追加して表示される赤色のパッチの量を増やす場合は、他の男性の pedipalp を覆うためにグレーのペイントを使用して、すべての男性がこの敏感な領域に描画されるようにしました (図 4を参照)。.望ましいことですが、この戦略は必ずしも実現可能とは限りません。例えば、別の実験では、赤い着色は男性の基礎キューティクルと同じ分光特性を与える黒いアイライナーを使用して、他の男性の色は無傷で自然なままにして除去しました (図 2)。この場合、自然に見える男性のために、同じ量のアイライナーが、甲羅の上の領域 (女性にははっきりと見えない領域) のすぐ後ろのエリアに適用され、潜在的な臭気または全体の毒性を制御します。製品。ただし、ペイントが適用される場所は、スパイダーに異なる影響を与える可能性があります。したがって、塗料が適用された方法や場所の微妙な違いを評価するには、クモの完全性、我々の仮説に関連した文脈での両方のタイプの男性の行動 (メイトの選択と性的な共食いに対する相対的な)を比較した。雄は雌の存在下で2人ずつ入れられ、それらの遅延がアクティブになること、求愛の遅れ、および一般的な線形混合効果モデルとの求愛に費やした合計時間を比較しました (R パッケージに lmer 機能を使用して lme443R バージョン 3.5.244では、ランダム効果として女性のアイデンティティを持ち、p 値を得るために最大尤度基準を使用しています)。この場合、すべての比較は、治療の間に差異がないことを明らかにし (表1参照)、そのため、我々は1つまたは他の治療カテゴリを支持するバイアスを導入しなかったと結論付けられた。
いずれの場合も、非常に類似した治療カテゴリ (図 4) を有するか、または偽処置個体のみ (図 2および図 3) の場合、研究者は、それらのモデル種が使用する塗料によってどのように影響を受けるかを評価し、彼らはまだ同じような、生態学的に関連する方法で動作します。例えば、治療された個人と unmanipulated の間の活動率を比較することによって、可能な限り毒性の可能性のある影響を評価するためのデータを記録することができます。図 4のようなエナメル塗料で塗装された私たちのクモは、そうでなければ同一の文脈で男性を unmanipulated と比較しました。具体的には、雄は単独で女性ケージに導入され、バイアルを離れるための遅延は、求愛および求愛率 (交尾前、および攻撃または抜き取っされる前) に遅れて比較された。違いは見つかりませんでした (上記と同様の線形混合効果モデルを使用した場合)、私たちは、私たちの塗装された男性が自然に振る舞ったと結論しました (表 2)。
最後に、実験の中のクモ (通常は女性) が抜き取っに着色された男性は、否定的な影響に苦しむようには見えないことに注意することが重要です。クモは外部で獲物を消化し、通常はキューティクルの塗られた部分を後ろに残します。しかし、色操作動物が消費される他のシステムにこの方法を適応させる場合、毒性の潜在的なリスクを評価すべきである。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59824/59824fig1.jpg"> 図 1.成人男性Habronattus pyrrithrixは、彼らの色のある身体領域がどのように小さいかを示す。ライル・バスが撮影。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59824/59824fig1large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59824/59824fig2.jpg"> 図 2.Habronattus pyrrithrixで赤い顔の色を隠すために使用される実験的なカラー操作。(A) 色操作前の無傷の赤い顔の着色。(B) 黒色アイライナー1で天然赤着色を隠蔽した後の同雄の顔面着色。(C) 天然の赤顔に対する代表的な反射率スペクトル、天然の下地黒色表皮、黒いアイライナー2で塗られた赤い顔。テイラーとマグロウ 201339から変更。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59824/59824fig2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59824/59824fig3.jpg"> 図 3.男性Habronattus pyrrithrixの赤い顔のパッチのサイズと赤みを軽減するために使用される実験的なカラー操作。(A) 色操作前の無傷の赤い顔の着色。(B) 顔の前部に希釈した黒色のアイライナー (アーバンディケイ) を塗布した後の同じオスの顔の色、および顔面のパッチの縁に沿って非希釈された黒色のアイライナーが赤色の領域のサイズを小さくする。(C) 偽処置コントロールの男性 (n = 21) および色操作された男性 (n = 21) の平均スペクトル曲線は、母集団平均 (n = 57) および以前の研究41からの 10 drabbest 雄と比較した。●フィギュアはテイラー et al. 201438から再現。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59824/59824fig3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59824/59824fig4v2.jpg"> 図 4.男性の赤い顔のパッチの色を変更するために使用される実験的な色の操作 Habronattus pyrrithrixHabronattus pyrrithrixの男性は (A) 赤、(B) 赤と灰色、(C) 灰色のエナメルが彼らの自然な赤い顔と自然にクリーム色の pedipalps の上に塗られた。(D) 男性の unmanipulated (n = 9) と、顔が赤エナメルで覆われた雄 (n = 9) の平均スペクトル曲線。スパイダーの顔の上に明るい赤を適用することによって、我々は効果的にその赤い顔の着色を強化しました。エナメル塗料は、基礎となるスケールを完全に覆うので、灰色のエナメルの場合と同様に、色を完全に変更することもできます。(E) この実験では、赤と灰色のエナメル塗料は、総輝度 (これらのクモに見える波長の範囲にわたる総反射率) のために一致するように選択された。D と E における Y 軸のスケールの違いは、紙 (E) のカラーサンプルを測定するための技術 (サンプルと測定された領域のサイズ) と、スパイダー (D) の顔の色の直接測定の異なる手法によるものです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59824/59824fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>N</td>
			<td>従属変数</td>
			<td>P</td>
			<td>T</td>
			<td>赤ら顔</td>
			<td>± SE</td>
			<td>ブラックフェース</td>
			<td>± SE</td>
			<td>nFID</td>
		</tr>
<tr>
<td>202b
</td>
			<td>男性は皿を残すために遅延</td>
			<td>0.35</td>
			<td>-0.93</td>
			<td>140.0</td>
			<td>23.9</td>
			<td>109.8</td>
			<td>23.9</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>179c
</td>
			<td>男性が法廷に遅れる</td>
			<td>0.74</td>
			<td>0.33</td>
			<td>983.4</td>
			<td>127.1</td>
			<td>1031.0</td>
			<td>126.5</td>
			<td>95</td>
		</tr>
<tr>
<td>204a
</td>
			<td>男性の求愛努力</td>
			<td>0.52</td>
			<td>0.63</td>
			<td>181.2</td>
			<td>24.4</td>
			<td>203.0</td>
			<td>24.4</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>204a
</td>
			<td>任意の攻撃の前に男性の求愛努力</td>
			<td>0.41</td>
			<td>0.68</td>
			<td>89.0</td>
			<td>15.7</td>
			<td>97.5</td>
			<td>15.7</td>
			<td>102</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1.黒のアイライナー対シャム処理で塗られたときの動作に対する男性の顔色操作の効果 (図 2)。各モデルの構造と、各治療グループの平均推定値 (± SE) が表示されます。N = 雄の数、p および t = p 値および男性治療のための t 値、nFID = ランダム効果女性同一性のレベル数。ある104男性テストのうち、102は正常に記録され、204の独特な男性観察につながる。b2 男性は、ペトリ皿を抜き取っ前に雌によって事前にされた。歳の男性は女性に求愛する前に女性に抜き取っれていた。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>N</td>
			<td>従属変数</td>
			<td>P</td>
			<td>T</td>
			<td>Unmanipulated</td>
			<td>± SE</td>
			<td>塗装</td>
			<td>± SE</td>
		</tr>
<tr>
<td>32a
</td>
			<td>男性は皿を残すために遅延</td>
			<td>0.87</td>
			<td>-0.17</td>
			<td>380.8</td>
			<td>143.1</td>
			<td>345.4</td>
			<td>152.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>31b
</td>
			<td>男性が法廷に遅れる</td>
			<td>0.93</td>
			<td>-0.09</td>
			<td>502.6</td>
			<td>105.8</td>
			<td>488.1</td>
			<td>116.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>31b
</td>
			<td>男性の求愛努力</td>
			<td>0.74</td>
			<td>-0.33</td>
			<td>2324.3</td>
			<td>455.0</td>
			<td>2102.1</td>
			<td>484.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>31b
</td>
			<td>任意の攻撃の前に男性の求愛努力</td>
			<td>0.68</td>
			<td>0.42</td>
			<td>1495.1</td>
			<td>450.8</td>
			<td>1770.1</td>
			<td>479.9</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2.赤または灰色のエナメル塗料 (n = 15、図 4) と unmanipulated 雄 (n = 17) で塗られた場合の、男性の顔色操作が動作に及ぼす影響。各モデルの構造と、各治療グループの平均推定値 (± SE) が表示されます。N = 男性の数、p および t = p 値および雄の治療のための t 値。unmanipulated の男性17人を、我々の実験におけるすべての塗装された雄のサブセットと比較した (n = 221)。具体的には、それらを15人のペイントされた男性 (5 赤 (図 2a)、5つの赤と灰色 (図 2b)、および5つの灰色 (図 2c)) と比較し、同一の文脈 (女性の存在下) および同じ特定の期間においてテストした。Unmanipulated の男性は、彼らの自然繁殖期の終わりに対応する (8 月と9月 2018)、実験の終わりに向かってテストされ、男性は一般的に少ない活性であるため、これは重要です。これらの変数をすべて同等に保つことで、他のバイアスを発生させずに塗装処理を比較することができます。b一人の男性 (すべてグレー) は、女性に求愛する前に抜き取った。

このプロトコルの目的は、性的選択、性的な共食い、捕食、aposematism、または動物着色の他の分野に関連する質問を研究するために、ペイントでジャンプクモや他の非常に小さな節足動物の色パターンを操作することです。

In the field of behavioral ecology, many experiments are designed to investigate the evolutionary purposes of colorful traits in the context of sexual ...

色がどのように進化するのかを理解するには、動物の色パターンを操作する実験が必要です。小さな動物は、その色を操作することが困難であるため、しばしば研究されています。カラーパッチを直接操作する主な利点は、この方法が動物の他の部分の外観に影響を与えたり、自然な照明環境を変更しないことです。私たちは、研究がジャンプクモにエナメル塗料やメイクアップを適用する方法を示しています。これらの同じ方法は、他の小さな、カラフルで、研究された節足動物の様々な上でも動作します。私はマイクロブラシに完璧な塗料の一貫性と量を得るために急がないように、死んだ標本をペイントしようとする最初の試みを助言します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、適切なペイントの一貫性、ペイントの適用方法、ブラシの角度などを説明するのが難しいため、不可欠です。まず、解剖顕微鏡をカメラとコンピュータに接続して、結果をより簡単に撮影します。3 つのデバイスをすべてオンにして、カメラ入力を処理するソフトウェアを起動します。次に、最終的な画像が撮影される適切なズームを選択します。昆虫の取り付けピンまたは小さな釘を、ブドウとほぼ同じ大きさの非硬化モデリング粘土のボールに貼り付けます。モデリング粘土とピンの設定を顕微鏡の下に置き、スパイダーが取り付けられるピンの頭に大まかに焦点を合わせるように目標を調整します。次に、余分な薄い昆虫取り付けピンを非硬化モデリング粘土の新しいボールに入れ、これを顕微鏡の横に置きます。顕微鏡の横に整理された方法で次の材料を設定します。小さな吸収性紙、ホワイトプリンタ紙、適用される塗料、適用される各色に対して薄い塗料の別々の容器、透明で清潔に保たれている塗料の別々の容器、各色に対する個々のマイクロブラシ、およびきれいなシンナーでのみ使用される1つのマイクロブラシ。爪楊枝を使用して、開いたプラスチック皿に塗料を一滴追加します。塗料を薄く追加し、塗料が完全に均質化されているが、あまりにも鼻水ではない右の一貫性に2つを混合するために爪楊枝を使用しています。マイクロブラシを使用して、白いプリンタの用紙に混合塗料をテストします。次に、エンドウ豆サイズの水ベースの接着剤をプリンタ用紙の隅に置きます。まず、あらかじめ用意して顕微鏡の下に置いた取り付けピンまたは釘の頭に非常に少量の接着剤を追加します。麻酔付きのクモを腹側を上にしてテーブルの上に静かにスライドさせ、クモをテーブルにタップまたはドロップしないようにします。モデリング粘土を両手で持ち、両手がしっかりとテーブルにしっかりと向かっていることを確認します。その後、クモの胸骨に接着剤でピンヘッドを軽く押し、クモがわずかに跳ね返り、小さな圧力の下で足を伸ばします。取り付けセットアップを顕微鏡の下に配置し直し、塗装する領域が上向きと焦点を合わせるようにします。まず、ペイントの一貫性をテストし、必要に応じて再調整します。ブラシヘアに含まれる塗料品質を制御するために、常に最初にプリンタの用紙に塗料を適用してみてください。クモに触れる前に、塗料が正しい一貫性を持ち、マイクロブラシに適切な量の塗料しか存在しないようにすることが重要です。顕微鏡を見ながら、支配的な手を使ってブラシの先端を視界に入れ、ブラシの毛にあまり塗料が含まれていないことを確認します。ブラシにペイントが多すぎる場合は、その一部をプリンタの用紙に拭き取ります。その後、上にペイントする必要がある最大の領域にクモにブラシをタッチします。これは、塗料の一貫性と量が正しいかどうかを明らかにします, これは、塗料がわずかにゆっくりとクモの髪やスケールに浸漬するときです.ペイントが適用されていない場合は、ブラシをペイントに浸し、プリンタの用紙に塗料をテストしてからこのプロセスを繰り返します。塗料が急速に浸り、塗料で覆われてはならない領域にこぼれた場合は、プリンタ用紙に塗料をテストすることによって、ブラシを吸収性の紙に拭き取り、最初からプロセスを繰り返します。クモの顔をペイントする場合は、前足とペディパルプを押さえるために、非支配的な手に余分な薄いピンを使用してください。ブラシやペイントによっては、目の間の中央領域をペイントしようとする前に、目の両側にペイントすることを検討してください。ペディパルプや脚をペイントするときは、硬化塗料で結合に触れないようにし、ペディパルプの遠位セグメントの下側にある男性の精子送達器官に塗料を適用しないようにしてください。クモの顔の片側を塗装した後、顔の反対側が同じ支配的な手で塗ることができるように、顕微鏡の下でクモを回転させることが役立ちます。クモが麻酔から目を覚ます前に、塗装は慎重かつ迅速に行う必要があります。最後に、顕微鏡でズームアウトして全体的な色の操作を検査し、写真を撮る準備をします。まず、目的をカメラモードに切り替えます。コンピュータソフトウェアを使用して、選択したズームが顕微鏡で選択されたズームであることを確認しながら写真を撮り、スケールバーを追加します。クモが動き始めたら、クモの前足がクモのバイアルに触れ合うようにピンを持ちます。必要に応じて、スパイダーが乾燥した接着剤から自分自身を引き離し、クモが自分自身を解放するのを助けるためにピンを静かに傾斜させます。この研究では、ハブロナトゥス・ピリトリクスの男性の小さな顔が色で操作されています。ここで示す手法を使用すると、色の操作のさまざまな程度が有効です。完全に色を隠すか、その強度を減らすか、または高めることを含む。ここに示す男性の目的は、求愛中に男性が表示する赤い斑点の数を増減することです。男性の中には、自然な赤い顔を灰色のエナメル塗料で隠している人もいれば、赤いエナメル塗料で自然な赤を塗って色を維持している男性もいます。同様に、いくつかのクモは、表示される赤い色のパッチの量を増やすためにペディパルプに赤いパッチを追加しているので、灰色の塗料は、すべての男性が敏感な領域に適用されるように、他の男性のペディパルプをカバーするために使用されます。しかし、まったく同じ領域に異なる群からクモを塗り、塗料の悪影響を制御することは、必ずしも実現可能ではない。別の研究では、男性の下にあるキューティクルと同じスペクトル特性を持つ黒いアイライナーを使用して赤い着色が除去され、他の男性の色はそのまま自然なままです。自然に見える男性の場合、同じ量のアイライナーがカラパスの上の領域、ちょうど前中央分離帯の目のすぐ後ろに適用され、潜在的な臭いや製品の全体的な毒性を制御します。両方のタイプの男性の行動は、塗料の毒性または意図しない影響を示唆する可能性のある微妙な違いを評価するために、特定の文脈で比較されます。顔がアイライナーで塗られたシャム治療された男性と男性は、女性の前で2つずつ置かれて、特定の男性の行動が観察される。この場合、すべての比較は治療間の違いを明らかにしません。したがって、いずれの治療カテゴリーにも偏りが導入されていないということを結論付けることができる。同様に、女性のケージにひときと紹介すると、灰色または赤のエナメル塗料で塗られた男性と操作されていない男性は、行動に違いはありません。したがって、塗装された男性は自然に作用したと結論付けることができます。クモをいかなる方法でもハンディキャップしないようにするには、口の部分や精子の送達器官に塗料を加えることを完全に避ける事が重要です。また、クモの目や関節に塗料を追加したり、残したりしてはいけません。色で操作されたクモや他の節足動物は、行動実験で、求愛から男性、男性の相互作用、捕食者を避けるために至るまで、様々な文脈における色の役割を理解するために使用することができます。動物の着色の分野は、主に鳥などのより大きな脊椎動物の作業によって駆動されます。スケールダウンされた色の操作技術を使用すると、小さな動物の色についてより多くの質問をすることができます。

manipulation-color-patterns-jumping-spiders-for-use-behavioral

Research

JoVE Journal

Environment

環境

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