Name: マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学ぶマウスにおけるアテローム性動脈硬化症の定量化法。大動脈根部・大動脈弓・腕頭動脈の病変サイズをSudan IV染色で測定し、心血管疾患研究の再現性と精度を向上させる標準化プロトコルを解説する。

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我々は、過去四半世紀にわたってこのプロトコルの開発を助けたゲランKハンソンの実験的な心血管研究ユニットのすべての過去のメンバーに感謝します。特に、アントニーノ・ニコレッティ、新華周、アンナ・カリン・ロバートソン、インガー・ボディンの貢献に感謝しています。この研究は、プロジェクト助成金06816とリンナエウスがスウェーデン研究評議会から349-2007-8703を支援し、スウェーデン心臓肺財団、ストックホルム郡評議会、ナンナ・スヴァルツ財団、ルーとハンス・オスターマンの助成金によって支援されました。カロリンスカ研究所医学研究財団、カロリンスカ研究所の老人病研究財団

<ol><li>Lozano, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+and+regional+mortality+from+235+causes+of+death+for+20+age+groups+in+1990+and+2010%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010.</a> Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).</li>
<li>Gistera, A., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The immunology of atherosclerosis.</a> Nature Reviews Nephrology. 13 (6), 368-380 (2017).</li>
<li>Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+atherosclerosis%2C+and+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease.</a> New England Journal of Medicine. 352 (16), 1685-1695 (2005).</li>
<li>Williams, K. J., Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response-to-retention+hypothesis+of+early+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">The response-to-retention hypothesis of early atherogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 15 (5), 551-561 (1995).</li>
<li>Pentikainen, M. O., Oorni, K., Ala-Korpela, M., Kovanen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+LDL+-+trigger+of+atherosclerosis+and+inflammation+in+the+arterial+intima%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modified LDL - trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima.</a> Journal of Internal Medicine. 247 (3), 359-370 (2000).</li>
<li>Ruuth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+low-density+lipoprotein+particles+to+aggregate+depends+on+particle+lipidome%2C+is+modifiable%2C+and+associates+with+future+cardiovascular+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of low-density lipoprotein particles to aggregate depends on particle lipidome, is modifiable, and associates with future cardiovascular deaths.</a> European Heart Journal. 39 (27), 2562-2573 (2018).</li>
<li>Nakashima, Y., Raines, E. W., Plump, A. S., Breslow, J. L., Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+VCAM-1+and+ICAM-1+at+atherosclerosis-prone+sites+on+the+endothelium+in+the+ApoE-deficient+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Upregulation of VCAM-1 and ICAM-1 at atherosclerosis-prone sites on the endothelium in the ApoE-deficient mouse.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 18 (5), 842-851 (1998).</li>
<li>Goldstein, J. L., Ho, Y. K., Basu, S. K., Brown, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+site+on+macrophages+that+mediates+uptake+and+degradation+of+acetylated+low+density+lipoprotein%2C+producing+massive+cholesterol+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 333-337 (1979).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., Brandon, C., Mitchell, D., Holmes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+susceptibility+to+atherosclerosis+among+inbred+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Variation in susceptibility to atherosclerosis among inbred strains of mice.</a> Atherosclerosis. 57 (1), 65-73 (1985).</li>
<li>Russell, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+history+of+mouse+inbred+strains%3A+contributions+of+Clarence+Cook+Little%5BTitle%5D)+AND+%22Origins+of+Inbred+Mice%2C+Morse%2C+HC%2C+eds.+%28Academic+Press%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Origins and history of mouse inbred strains: contributions of Clarence Cook Little.</a> Origins of Inbred Mice, Morse, HC, eds. (Academic Press, NY). , 33-43 (1978).</li>
<li>Waterston, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420 (6915), 520-562 (2002).</li>
<li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-driven+immunometabolic+responses+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Lipid-driven immunometabolic responses in atherosclerosis.</a> Current Opinion in Lipidology. 29 (5), 375-380 (2018).</li>
<li>Maganto-Garcia, E., Tarrio, M., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of atherosclerosis.</a> Current Protocols in Immunology. Chapter 15, Unit 15.24.11-23 (2012).</li>
<li>Plump, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+hypercholesterolemia+and+atherosclerosis+in+apolipoprotein+E-deficient+mice+created+by+homologous+recombination+in+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells.</a> Cell. 71 (2), 343-353 (1992).</li>
<li>Zhang, S. H., Reddick, R. L., Piedrahita, J. A., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+hypercholesterolemia+and+arterial+lesions+in+mice+lacking+apolipoprotein+E%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E.</a> Science. 258 (5081), 468-471 (1992).</li>
<li>Ishibashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+in+low+density+lipoprotein+receptor+knockout+mice+and+its+reversal+by+adenovirus-mediated+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery.</a> Journal of Clinical Investigation. 92 (2), 883-893 (1993).</li>
<li>Ishibashi, S., Goldstein, J. L., Brown, M. S., Herz, J., Burns, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+xanthomatosis+and+atherosclerosis+in+cholesterol-fed+low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Massive xanthomatosis and atherosclerosis in cholesterol-fed low density lipoprotein receptor-negative mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 93 (5), 1885-1893 (1994).</li>
<li>Ketelhuth, D. F., Gistera, A., Johansson, D. K., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-based+therapies+for+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">T cell-based therapies for atherosclerosis.</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (33), 5850-5858 (2013).</li>
<li>Skalen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subendothelial+retention+of+atherogenic+lipoproteins+in+early+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis.</a> Nature. 417 (6890), 750-754 (2002).</li>
<li>Boren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+low+density+lipoprotein+receptor-binding+site+in+apolipoprotein+B100+and+the+modulation+of+its+binding+activity+by+the+carboxyl+terminus+in+familial+defective+apo-B100%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Identification of the low density lipoprotein receptor-binding site in apolipoprotein B100 and the modulation of its binding activity by the carboxyl terminus in familial defective apo-B100.</a> Journal of Clinical Investigation. 101 (5), 1084-1093 (1998).</li>
<li>Sanan, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+density+lipoprotein+receptor-negative+mice+expressing+human+apolipoprotein+B-100+develop+complex+atherosclerotic+lesions+on+a+chow+diet%3A+no+accentuation+by+apolipoprotein%28a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Low density lipoprotein receptor-negative mice expressing human apolipoprotein B-100 develop complex atherosclerotic lesions on a chow diet: no accentuation by apolipoprotein(a).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (8), 4544-4549 (1998).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+against+T-cell+epitopes+of+native+ApoB100+reduces+vascular+inflammation+and+disease+in+a+humanized+mouse+model+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccination against T-cell epitopes of native ApoB100 reduces vascular inflammation and disease in a humanized mouse model of atherosclerosis.</a> Journal of Internal Medicine. , (2017).</li>
<li>Johnson, J. L., Jackson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerotic+plaque+rupture+in+the+apolipoprotein+E+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Atherosclerotic plaque rupture in the apolipoprotein E knockout mouse.</a> Atherosclerosis. 154 (2), 399-406 (2001).</li>
<li>Calara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+plaque+rupture+and+secondary+thrombosis+in+apolipoprotein+E-deficient+and+LDL+receptor-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous plaque rupture and secondary thrombosis in apolipoprotein E-deficient and LDL receptor-deficient mice.</a> The Journal of Pathology. 195 (2), 257-263 (2001).</li>
<li>Caligiuri, G., Levy, B., Pernow, J., Thoren, P., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction+mediated+by+endothelin+receptor+signaling+in+hypercholesterolemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction mediated by endothelin receptor signaling in hypercholesterolemic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (12), 6920-6924 (1999).</li>
<li>Daugherty, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendation+on+Design%2C+Execution%2C+and+Reporting+of+Animal+Atherosclerosis+Studies%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (9), e131-e157 (2017).</li>
<li>Paigen, B., Morrow, A., Holmes, P. A., Mitchell, D., Williams, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+atherosclerotic+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of atherosclerotic lesions in mice.</a> Atherosclerosis. 68 (3), 231-240 (1987).</li>
<li>Purcell-Huynh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+expressing+high+levels+of+human+apolipoprotein+B+develop+severe+atherosclerotic+lesions+in+response+to+a+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice expressing high levels of human apolipoprotein B develop severe atherosclerotic lesions in response to a high-fat diet.</a> Journal of Clinical Investigation. 95 (5), 2246-2257 (1995).</li>
<li>Nicoletti, A., Kaveri, S., Caligiuri, G., Bariety, J., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+treatment+reduces+atherosclerosis+in+apo+E+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin treatment reduces atherosclerosis in apo E knockout mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 102 (5), 910-918 (1998).</li>
<li>Gistera, A., Ketelhuth, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Lymphocytes+in+Mouse+Atherosclerotic+Plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Lymphocytes in Mouse Atherosclerotic Plaque.</a> Methods in Molecular Biology. 1339, 149-159 (2015).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+signaling+in+T+cells+promotes+stabilization+of+atherosclerotic+plaques+through+an+interleukin-17-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta signaling in T cells promotes stabilization of atherosclerotic plaques through an interleukin-17-dependent pathway.</a> Science Translational Medicine. 5 (196), 196ra100 (2013).</li>
<li>Gistera, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Density+Lipoprotein-Reactive+T+Cells+Regulate+Plasma+Cholesterol+Levels+and+Development+of+Atherosclerosis+in+Humanized+Hypercholesterolemic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Low-Density Lipoprotein-Reactive T Cells Regulate Plasma Cholesterol Levels and Development of Atherosclerosis in Humanized Hypercholesterolemic Mice.</a> Circulation. 138 (22), 2513-2526 (2018).</li>
<li>Daugherty, A., Whitman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of atherosclerosis in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 209, 293-309 (2003).</li>
<li>Baglione, J., Smith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assay+for+mouse+atherosclerosis+in+the+aortic+root%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative assay for mouse atherosclerosis in the aortic root.</a> Methods in Molecular Biology. 129, 83-95 (2006).</li>
<li>Schiller, N. K., Kubo, N., Boisvert, W. A., Curtiss, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gamma-irradiation+and+bone+marrow+transplantation+on+atherosclerosis+in+LDL+receptor-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Effect of gamma-irradiation and bone marrow transplantation on atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 21 (10), 1674-1680 (2001).</li>
<li>Naghavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+vulnerable+plaque+to+vulnerable+patient%3A+a+call+for+new+definitions+and+risk+assessment+strategies%3A+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I.</a> Circulation. 108 (14), 1664-1672 (2003).</li>
<li>Seijkens, T. T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+CD40-Induced+TRAF6+Signaling+in+Macrophages+Reduces+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Targeting CD40-Induced TRAF6 Signaling in Macrophages Reduces Atherosclerosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 71 (5), 527-542 (2018).</li>
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著者は何も開示していない。

心血管疾患は、世界の主なキラーであり、新しい予防測定が必要です2.疾患のマウスモデルは、病態生理学および実験的治療の研究のための包括的なプラットフォームを提供する13.このアプローチには信頼性の高い病変サイズ定量が不可欠です。しかし、定量方法は実験室によって異なります。標準化と最適化は、1980年代の13、27、33、34以来、継続的なプロセスとなっています。大動脈根は、実験的アテローム性動脈硬化症を定量化する最も人気のあるサイトとして出現した。プラークの断面は、グループ間のプラーク体積の比較を可能にする。エンフェイス製剤は、大間のより大きなセグメントにおける病変定量のために好まれる。en face メソッドは、プラークの量を視覚化し、プラーク領域のカバレッジを定量できますが、プラークの厚さは考慮しません。観察された相違の生物学的関連性は、血管の木の異なる位置で一貫した結果によって実証される。異なる場所でアテローム性動脈硬化症の発症を評価することは、可能なサイト固有の効果に対処します。アテローム性動脈硬化症発症に対する移植血行細胞の効果は、高コレステロール血症Ldlr-/-キメラで評価することができる。しかし、全身照射は、部位特異的な効果を伴うアテローム性動脈硬化プロセスに影響を与える。より顕著なアテローム硬化性病変は大動脈根で発症し、一方、病変の減少は大動脈アーチ35で観察される。
重要なことは、病変サイズだけでなく、実験的アテローム性動脈硬化症の研究で対処する必要があります。病変組成物も重要なパラメータです。いくつかのプラーク特徴は、ヒト36における疾患の症状と関連している。大動脈根の連続断面は、プラーク組成物の慎重な分析のために利用可能ないくつかのセクションを残します。ヒトにおけるプラーク破裂は、少数の平滑筋細胞を有する薄い線維性キャップ、まばらなコラーゲン含有量およびプラーク36における炎症の徴候によって特徴付けられる。プラーク破裂はアテローム性動脈硬化症のマウスモデルではまれな事象であるが、プラーク安定性のマーカーは評価する有益である。翻訳アプローチは、マウスモデルから機械的所見を確認し、ヒト疾患31の重要な特徴を明らかにすることができる。アテローム硬化性プラークの炎症状態は、VCAM-1、MHCクラスII、マクロファージ、およびリンパ球30の免疫組織化学染色によって決定され得る。一部のプロトコルは、アテローム硬化性病変サイズおよび組成物37を測定するために、大動脈アーチまたはブラキオ眼動脈の冠状平面における縦断を使用する。ただし、この代替方法では、分析するセクションが少ないため、アプリケーションが制限されます。
このプロトコルの最初の重要なステップは、大次を効率的に収穫する能力です。顕微鏡下での手と目のコーディネーションは練習を必要とし、微小解剖と大動脈アーチのその後の固定の両方にとって重要です。このプロトコルの次の重要なステップは、大動脈根からのシリアルセクションのコレクションです。マウスごとに 80 個の連続したセクションを収集する必要があり、フォーカスと忍耐の両方が必要です。方法論的な熟練度は、記述されたプロセスを大幅にスピードアップすることができます。それにもかかわらず、アテローム硬化性病変定量は依然として時間のかかる作業である。新しい技術、自動処理、および小動物イメージングは、将来的に実験的アテローム性動脈硬化症の定量化を容易にする可能性があります。アテローム性動脈硬化症の進行は遅く、マウスモデルのほとんどの実験プロトコルは13を完了するのに4ヶ月以上かかります。したがって、大器はスタディエンドポイントで最適化された方法で収集する必要があります。このプロトコルは、効率的に大動脈を収穫するための包括的なガイドを提供し、提案された処理は、大動脈根、大動脈のアーチ、およびブラキオエファリック動脈の病変定量を含む多目的使用のための大動脈を準備する。うまくいけば、プロトコルは、実験の変動性を低減し、結果の信頼性を高め、アテローム性動脈硬化症に対する新しい治療法の道を開く発見につながることを可能にします。

心血管疾患は虚血性心疾患と脳卒中の主な死因で、4人に1人が死亡1人を占めている。ほとんどの症例は、アテローム性動脈硬化症、大および中型動脈2の慢性炎症の徴候を伴う脂質を含むプラークのゆっくりとした蓄積を特徴とする疾患によって引き起こされる。この疾患は通常、プラークの破裂または浸食が虚血組織損傷につながる動脈血栓症を引き起こすまで、数十年にわたって気付かれていないままである。
正常な動脈は、内皮細胞を有する内膜層とまばらに分布した平滑筋細胞、平滑筋細胞および弾性ラメラを有する培温層、および緩い結合組織3を有する周囲のアドベンティタル層からなる。LDLの親密な保持は、アテローム性動脈硬化症の発症を相殺する4.リポタンパク質の蓄積および修飾は、動脈内の凝集および閉じ込めにつながる5.炎症反応は、捕らえられ、修飾されたリポタンパク質6によって誘発される。内皮細胞は、乱流血流を有する動脈の樹木部でVCAM-1などの接着分子を発現し始め、循環単球および他の白血球7の募集につながる。浸潤単球は、マクロファージ発泡細胞への変換を伴う脂質を巻き込むマクロファージに分化する8.
アテローム性動脈硬化症は、1980年代半ば以来、頻度が増加するマウスモデルで研究されています。C57BL/6は、これらの研究のために最も一般的に使用される生まれつきマウス株であり、遺伝子組み換え株9の大部分の遺伝的背景として使用される。この株は1920年代の10で確立され、そのゲノムは200211に出版されました。マウスモデルの実験にはいくつかの利点があります:コロニーは高速に再現し、ハウジングはスペース効率が良く、繁殖は実験の変動を減らします。このモデルはまた、標的遺伝子の欠損やトランスジーンの挿入などの遺伝子操作を可能にします。これは、疾患の新しい病態生理学的理解と新しい治療目標12につながっています。
野生型C57BL/6マウスは、アテローム性動脈硬化症に対して自然に耐性である。彼らはHDLで循環コレステロールのほとんどを有し、および複雑なアテローム硬化性病変は、高脂肪および高コレステロール食13を供給しても形成されない。したがって、C57BL/6バックグラウンド上のアポー-/-のような高コレステロール血症マウスは、アテローム性動脈硬化症14,15の実験モデルとして使用される。ApoEの欠如は、残りのリポタンパク質の肝摂取を損ない、脂質代謝をひどく乱れる。Apoe-/-マウスでは、循環コレステロールは主にVLDL粒子中であり、マウスは通常のチョウ食に複雑なアテローム硬化プラークを発症する。
Ldlr-/-マウスは、家族性高コレステロール血症16を有するヒトに見られるアテローム性動脈硬化症の発症を模倣する。Ldlr-/-マウスは、アテローム性動脈硬化症を発症するために西洋型の食事を必要とする17.西洋の食事は人間の食物摂取を模倣し、通常0.15%のコレステロールが含まれています。LDL受容体はApoB100およびApoEを認識し、エンドサイトアシスを介してLDL粒子の取り込みを仲介する。LDL受容体は循環からのLDLの肝臓クリアランスの基礎であり、血行細胞におけるLDL受容体発現はこのプロセスに影響を与えない。これにより、高コレステロール血症Ldlr-/-レシピエントへのLdlr+/+細胞の骨髄移植の可能性とアテローム性動脈硬化症の発症の評価が可能になります。 骨髄キメラは、一般的に実験的アテローム性動脈硬化症における血統細胞の参加を研究するために使用されている。しかし、骨髄移植はアテローム硬化性プラークの大きさと組成に影響を与え、結果の解釈をあいまいにする可能性がある。
アポー-/-およびLdlr-/-マウスの異なる変異体は、疾患18の特定のプロセスを研究するために開発された。一例は、全長ヒトAPOB100遺伝子19,20を担持するヒトAPOB100-トランスジェニックLdlr-/-(HuBL)マウスである。 これらのマウスは、定期的なチョウダイエットで高コレステロール血症とアテローム性動脈硬化症を発症する。しかし、複雑なアテローム硬化性プラークの開発には少なくとも6ヶ月かかり、より短い実験プロトコルは通常、西洋の食事21を使用する。血漿コレステロールの大部分がLDL粒子中に循環しており、これはHuBLマウスにアポー-/-およびLdlr-/--マウスと比較して、よりヒト様の脂質化リポタンパク質プロファイルを与える。HuBLマウスはまた、自己抗原22としてのヒトapoBの研究を可能にする。
アテローム性動脈硬化症のマウスモデルは、ヒト疾患の共有特徴を有する複雑なアテローム硬化性プラークを発症する。しかし、プラークは、続く心筋梗塞で破裂に対してかなり耐性があります。アテロームローム症は散発的に検出され、23、24、25を評価するために実験的に挑戦的である。プラーク破裂の特別なモデルが開発されているが、実験分野はプラーク安定剤の評価のための信頼性と再現性のモデルを欠いている。
アテローム性動脈硬化症の定量化は、文献内で多くの方法で報告されている。最近の取り組みは、動物実験の実験設計、実行、および報告を標準化しようとしている26.研究者は、彼らの研究室に適応異なる好みや技術を持っています。ほとんどの研究プロジェクトは、プロトコルの変更を必要とする方法でもユニークです。疾患の多因子性のために、最適な制御はプロジェクトによって異なります。局所的な状況や標準化の欠如は、疾患発症の観察された違いを引き起こす可能性があり、研究分野の進歩を妨げている。実験変動の違いはまた、統計的電力計算が局所条件下でのパイロット研究に基づく必要があることを意味します。
アテローム性動脈硬化症の定量化は、血管の木のいくつかの場所で推奨されます。このプロトコルは、他の分析のために胸部大動脈の残りの部分を残すことに加えて、単一のマウスで大動脈根、大動脈アーチ、およびブラキオセファリック動脈から結果を得る方法を説明する。エンフェイス製剤は、大動脈アーチにおける脂質を含むプラークの迅速な定量を可能にする。検体を注意深く表示すれば、上腕動脈の疾患負担も定量化できる。大動脈根の断面に時間がかかるほど、プラーク組成物の詳細な評価に利用できるいくつかのセクションが残ります。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>VWRケミカルズ</td><td>20066.296</td>免疫<td>組織化学のための切片の固定用。</td></tr><tr><td>黒色の電気絶縁テープ(幅50 mm)</td><td>専門小売店</td><td>-</td><td>大動脈弓用のピン留めベッドを作成します。</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5417C</td><td>卓上型微量遠心分離機。</td></tr><tr><td>コルクボード</td><td>専門小売店</td> <td>-</td> <td>大動脈根を凍結マウントする準備で心臓を切断するため。</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 560</td><td>大動脈根の連続凍結切片用。</td></tr><tr><td>脱イオン水</td> <td>-</td><td></td> <td>溶液のすすぎと調製用。</td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>DC480</td><td>5.1メガピクセルCCD、大動脈弓と大動脈基部の高解像度画像用。</td></tr><tr><td>解剖ハサミ(10cm、ストレート)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td>臓器の一般的な解剖用。</td></tr><tr><td>デュモン鉗子#5(11cm、ストレート)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500341</td><td>大動脈の顕微解剖用。</td></tr><tr><td>エタノール 70% (v/v)</td><td>VWR Chemicals</td><td>83801.290</td><td>引火性の高い液体と蒸気は、換気の良い場所に保管し、涼しく保ちます。</td></tr><tr><td>エタノール絶対 &ge;99.8%</td><td>VWRケミカルズ</td><td>20821.310</td><td>引火性の高い液体と蒸気は、換気の良い場所に保管し、涼しく保ちます。</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド4%安定化、緩衝剤(pH 7.0)</td><td>VWR化学薬品</td><td>9713.1000</td>吸入<td>、皮膚との接触、飲み込むと有害です。</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>-</td><td>画像解析ソフトウェア。</td></tr><tr><td>虹彩鉗子(10cm、湾曲、鋸歯状)</td><td>World Precision Instruments</td><td>15915-G</td><td>解剖学的鉗子として使用されます。</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>メルク</td><td>1096341011</td><td>可燃性液体で、深刻な眼の刺激を引き起こし、眠気やめまいを引き起こす可能性があります。.</td></tr><tr><td>カイザー社のグリセロールゼラチン</td><td>メルク</td><td>1092420100</td><td>フェノールを含有する水性封入剤です。遺伝的欠陥を引き起こした疑いがあります。</td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>DM LB2</td><td>オイルレッドO染色顕微鏡写真の切片作成および文書化中の分析用。</td></tr><tr><td>メイヤーのヘマトキシリン</td><td>Histolab</td><td>1820</td><td>クロラール水和物を含まない非毒性の染色液ですが、深刻な眼の炎症を引き起こします。</td></tr><tr><td>マヨハサミ(17cm・ストレート)</td><td>ワールド精密機器</td><td>501751-G</td><td>一般解剖用。</td></tr><tr><td>マイクロカストロビエホニードルホルダー(9cm、ストレート)</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメン</td><td>ツ503376</td>大<td>動脈弓のピン留め用。</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>MCT-175-C</td><td>スナップロックキャップ付きポリプロピレンマイクロチューブ。</td></tr><tr><td>マイクロランス 3本針、23ゲージ</td><td>BD</td><td>300800</td><td>採血用。</td></tr><tr><td>Microlance 3本針、27ゲージ</td><td>BD</td><td>302200</td><td>マウスの灌流用。</td></tr><tr><td>マイクロベット500 & マイクロ;L、K3 EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>20.1341.100</td>採<td>血用。</td></tr><tr><td>マイクロベット500 & マイクロ;L、リチウムヘパリン</td><td>Sarstedt</td><td>20.1345.100</td><td>採血用。</td></tr><tr><td>Minutienの昆虫ピン、0.10のmm</td><td>Fine Science用具</td><td>26002-10</td><td>大動脈弓のピン留めのため。</td></tr><tr><td>オイルレッド O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td>有害物質または混合物として分類されていません。</td></tr><tr><td>最適な切断温度(OCT)クライオマウント</td><td>Histolab</td><td>45830</td><td>組織の埋め込み用。</td></tr><tr><td>パラフィルム M</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td>大動脈弓のピン留めベッドを作成するために使用されるパラフィンワックスフィルム。</td></tr><tr><td>ペトリ皿(100mm×20mm)</td><td>任意の細胞培養サプライヤー</td><td>-</td><td>ピン留めされたアオルタの保存容器として提案。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td> <td>-</td><td>-</td> <td>マウスの灌流には、無菌でRNaseを含まない溶液が必要です。</td></tr><tr><td>定性的な濾紙(グレード1001)</td><td>Munktell</td><td>120006</td><td>オイルレッドOワーキングソリューション(典型的な保持2-3&マイクロ;m)です。</td></tr><tr><td>RNAlater RNA 安定化試薬</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>組織サンプル中のRNAの安定化用</td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>接触するとRNaseを破壊する表面除染液です。</td></tr><tr><td>メスハンドル #3 (13 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td>大動脈根を凍結マウントする準備で心臓を切断します。</td></tr><tr><td>スタンダードメスブレード #10</td><td>ワールド精密機器</td><td>500239</td><td>大動脈根を凍結マウントする準備で心臓を切断します。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>MZ6</td><td>解剖および対面ドキュメンテーション用</td></tr><tr><td>スーダンIV</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S4261</td><td>有害物質または混合物として分類されていません。</td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス顕微鏡スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>大動脈根切片を採取します。</td></tr><tr><td>組織鉗子(15cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501741-G</td><td>一般解剖用。</td></tr><tr><td>Tissue-Tek クライオモールド (10 mm x 10 mm x 5 mm)</td><td>Sakura</td><td>4565</td><td>OCTに大動脈根を埋め込むため。</td></tr><tr><td>バンナスハサミ(8cm、ストレート)</td><td>ワールド精密機器</td><td>503378</td>大<td>動脈の顕微解剖用。</td></tr></tbody></table>

マウスにおけるアテローム性動脈硬化症の定量化

Quantification of Atherosclerosis in Mice

心血管疾患は、世界の主な死因です。ほとんどの場合、根本的な原因は、部分的に慢性炎症性疾患であるアテローム性動脈硬化症です。実験的アテローム性動脈硬化症研究は、疾患プロセスにおけるコレステロールおよび炎症の役割を解明した。これは、アテローム性動脈硬化症の臨床症状を減少させる薬剤で成功した臨床試験につながっています。この疾患のマウスモデルにおける慎重かつ適切に制御された実験は、疾患の病因をさらに解明する可能性があり、これは完全には理解されていない。標準化された病変分析は、実験の変動性を低減し、再現性を高めるために重要です。大動脈根、大動脈アーチ、およびブラキオセファリック動脈における病変サイズの決定は、実験的アテローム性動脈硬化症における一般的なエンドポイントである。このプロトコルは、単一のマウスにおけるこれらすべての部位におけるアテローム性動脈硬化症の評価のための技術的な説明を提供する。このプロトコルは、遺伝子組み換え動物が特徴付けられている場合によくあるように、材料が限られている場合に特に有用である。

アテローム性動脈硬化症のマウスモデルでは、最も顕著な病変は大動脈根および大動脈アーチで発症する傾向がある。このプロトコルは、大動脈根、大動脈アーチ、および単一のマウスにおける上皮動脈動脈におけるアテローム性動脈硬化の定量を記述する。胸部下降大動脈および腹部大動脈の測定可能な病変は、事前疾患を有する動物にのみ存在する。このプロトコルでは、これらの部分はアテローム硬化性の負担のために分析されるのではなく、mRNAレベルまたは他の分析の後続の分析のために保存される。大動脈根のアテローム硬化性病変の連続部分は、通常、y軸上の病変サイズとx-軸28上の大動脈腔までの距離を持つグラフに表示される。真の断面は、病変サイズ定量に不可欠です。斜めのセクションは病変サイズを過大評価することができ、わずか20°の傾きは15)によって絶対病変表面を過大評価することができる。しかし、全血管面積の病変分率を計算すると、断面時に起こりうる角度の違いに対する影響が少なくなります(図4A)。グループ間の差異を検出するための適切な統計的方法は、通常、分散の通常の2ウェイ分析(ANOVA)です。ボンフェローニの後テストは、特定のレベルでの違いを検出するために行われます.フィッシャーの最も有意な差は、ANOVAのフォローアップテストとしても使用できます。これは、タイプ II の統計エラーの可能性を減らしますが、複数の比較を考慮しません。さらに、曲線の下の面積またはマウスあたりの平均病変サイズを計算し、ドットプロットでデータを提示して、グループ内の個々の変動をさらに視覚化することができます(図4B)。
オイルレッドOは、中性脂質を染色する脂溶性の明るい赤色ジアゾ色素です。細胞膜の極性脂質は染色されません。オイルレッドO染色は、新鮮な、凍結、またはホルマリン固定サンプルでは行うことができますが、必要なデパラフィン化プロセスで脂質を除去するため、パラフィン埋め込みサンプルでは行われません。病変脂質蓄積の定量化は、全病変領域のオイルレッドO陽性領域を色閾値化することによって行うことができる(図4C)。ヘマトキシリンは、プラークの形態を視覚化するのに役立つ細胞核の青い染色を生成します。右および左冠動脈は、通常、大動脈27から約250μmの大動脈から発散し、これはしばしば最も顕著な病変サイズと一致する。この領域の断面は、多くの場合、代表的な結果として表示されます (図 4D)。
<img alt="大動脈病変の分析;グラフ、棒グラフ、組織学画像。病変サイズ、オイルレッドO染色の結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:大動脈根のアテローム硬化性病変。(A)28週齢の雄骨髄キメラを8週間食餌食にし、アテローム性動脈硬化症発症に対するSmad7-欠損T細胞の効果を決定するために評価した。 実験的なLdlr-/-キメラはCd4-Cre+Smad7fl/fl骨髄を受け取り、コントロールはCd4-Cre +Smad7fl/+骨髄を受け取った。グラフは、全血管表面の病変分分率として表示される大動脈部位からの8つの連続したセクションからのアテローム硬化性病変領域の定量を示しています(Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 9, ボンフェロニのポストテストで2ウェイANOVA, グラフは平均±SEMを示し、中括弧は歪み比較の有意水準を示します。(B) 組み合わせたドットプロットと棒グラフは、大動脈根切片からの平均アテローム硬化性病変領域を示しています (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- n=6, Cd4-Cre+Smad7fl/fl /Ldlr-/- n = 9, 学生のt-test) (C)病変中のオイルレッドO染色面積の割合 (Cd4-Cre+Smad7fl/+/Ldlr-/- = 4, Cd4-Cre+Smad7fl/fl/Ldlr-/- n = 6, 学生のt-test, ns=非有意) (B-C) ドットは個々のマウスを表し、バーは平均 ±SEM. (D) オイルレッド O 染色を示す代表的な顕微鏡写真 (赤色)大動脈内膜300μmの中性脂質の色(50倍倍)、スケールバー= 500 μm *p ≤ 0.05、 ***p ≤ 0.001。この図は、Gisterå et al.31から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
オイルレッドOは、エンフェイス調製大歯の染色に使用することができますが、このプロトコルは、スーダンIV、別の便利な脂肪溶解性ジアゾ色素を使用しています。スーダンIVは、脂質、トリグリセリド、リポタンパク質を染色することにより、オレンジ赤色のアテローム硬化性プラークを明確に可視化します。エンフェイス大動脈アーチの代表的な画像の暗い背景を削除すると、視覚的な表示を強化することができます(図5A)。通常、病変サイズは通常グループ内に分布し、グループ間で学生のt-testを用いて統計的テストを行うことができます。個々のマウスと平均の両方を示すドットプロットは、グループ間で比較され、結果を表示するための有益な方法です(図5B-C)。グループ内の変動は通常、血管の木の位置間で異なるので、通常は別々の電力計算が必要です。メソッドの熟練度とプロトコルの標準化によって、不必要な変動を回避できます。統計的に有意な結果を得ることは重要ですが、観察された差の生物学的関連性も常に考慮する必要があります。
<img alt="大動脈弓病変解析 動脈画像、HuBLおよびBT1xHuBLモデルにおける病変データ比較、グラフ" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59828/59828fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図5:大動脈アーチおよび上皮動脈におけるアテローム硬化性病変。(A)代表的なエンは、20週齢のマウスが10週間西洋食を与え、一緒に可視化した20週齢のマウスからスーダンIV(オレンジ色)で染色された脂質を含むプラークを有する大動脈アーチの顕微鏡写真を用いた。スケールバー= 2 mm.ヒトAPOB100-トランスジェニックLdlr-/-(HuBL)マウスを対照として使用し、実験群はLDL反応性T細胞(BT1)を有するTCRトランスジェニックマウスから成り立った。 (B) 大動脈アーチのアテローム硬化性病変 (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12;学生のt -テスト)。(C)ブラキオセファリック動脈におけるアテローム硬化性病変(HuBL n=8、BT1xHuBL n=9、学生のt-test)。 (B-C)ドットは個々のマウスを表し、バーは平均±SEM.*p ≤ 0.05を示す。この図は、Gisterå et al.32から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/59828fig5large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図 1: 大動脈根のシリアルセクションのスライドの代替編成。大動脈根からのセクションのコレクションのための簡素化された体系的なスライド組織。このコレクションにより、脂質および免疫組織化学または免疫蛍光染色のためのオイルレッドO染色が可能になります。コラーゲンのピクロシリウス赤染色専用スライドは省略されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59828/2019-JoVE-Figure-S1.eps">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

アテローム性動脈硬化症のマウスモデルは、分子レベルで病原性経路を調査するのに有用なツールであるが、病変発症の標準化された定量化を必要とする。このプロトコルは、大動脈根、大動脈アーチ、および高潔な動脈を含む主要な動脈血管の病変サイズを決定するために最適化された方法を記述する。

Cardiovascular disease is the main cause of death in the world. The underlying cause in most cases is atherosclerosis, which is in part a chronic ...

心血管疾患は、世界的に死の主な原因です。マウスモデルは、この疾患を研究するための有用なツールであり、我々のプロトコルは、マウスのアテローム性動脈硬化症を定量化するために使用することができます。このプロトコルを使用して、病変サイズは3つの血管の位置で測定することができる。大動脈根、大動脈弓および虚頭筋動脈。マウスのアテローム性動脈硬化症の定量化は、面倒な作業になることがあります。私たちは、プロセスをスピードアップできることを望む詳細な手順を提供しました。これらの手順の一部は、書面で説明するのが難しいです。このビデオが、堅牢なアテローム硬化性病変サイズ分析を得るのに役立つことを願っています。標準的なプロトコルに従ってマウスの心臓を収穫した後、心臓をコルクのベッドの上に置き、腹側を解剖顕微鏡の下に置き、針を使って頂点を通してコルクに心臓を固定します。心臓の基部を解剖学的鉗子で保持し、矢状平面で20度の角度で保持されたメスを使用し、横被面で20度を使用して、心臓の3分の2の頭頂部を切り取ります。最適な切断温度化合物、またはOCTに大動脈根と心臓の基部を埋め込み、軽く化合物で大動脈根を埋め、任意の気泡を除去するために鉗子で心臓を絞ります。底面に垂直な大動脈根でOCTで満たされたクリオマールの底に標本を移し、ドライアイス上の化合物を凍結します。その後、組織サンプルを氷解するまでマイナス80度の冷凍袋に保管します。顔の分析のためにピン留めベッドを準備するには、パラフィンワックスフィルムのセグメントを8回折り畳んで平らな25×25mmの表面を作り、フィルムの周りに黒い電気絶縁テープを包んで大タオルの暗い背景を作ります。ピン留めベッドの裏側にラベルを置き、リードペンシルを使用してマウスの識別番号を記録します。大動脈弓をピン留めベッドに移し、組織にPBSの滴を加える。ステレオ顕微鏡を使用して、残りの回来期脂肪組織から大動脈を洗浄し、ヴァンナハサミとデュモン鉗子を使用して、大動脈を操作または損傷することなく、周囲の脂肪組織をすべて穏やかに剥がします。次に、大動脈腔内にバンナハサミを導入して、内膜を露出させます。上向きアーチの外側の湾曲を遠位方向に切断し、腕頭筋動脈を含む枝を切り開き続け、下降胸部の後部を温断します。内膜面を表示するには、曲率を小さい方の曲率で切り開き、大間を折りたたみます。マイクロカストロビエホ針ホルダーを使用して、標本を伸ばさずにニーン昆虫ピンの鈍い端でピン留めベッドにオープンアーチを固定し、組織が所定の位置に保持されると、標本からピンをそっと曲げます。その後、4°CでPBSのペトリ皿にピン留めされたアーチのフェイスダウンを保存します。スーダンIV染色の場合、7分間、70%エタノールのペトリ皿で、アーチを下に向けてペトリ皿で洗い、その前に7分間スーダンIVの作業溶液の皿に標本を移す。インキュベーションの最後に、サンプルを80%エタノールで2回の3分間の洗剤で洗い、通常のインティマル表面を脱染色し、続いてPBSで最後のすすいでから元のペトリ皿に戻します。その後、10倍の拡大でデジタルカメラに接続されたステレオ顕微鏡の下で顕微鏡を取得し、PBSに沈んだピン止めアーチの画像を取得し、小さな金属重量を使用してペトリ皿の底にピン留めベッドを保持します。埋め込まれた大動脈根のクライオセクションを得るためには、クライオスタット温度をマイナス20°C、セクションの厚さを10マイクロメートルに設定します。心室組織を外側に向けた標本ホルダーに大動脈根を含むOCTブロックを取り付けます。必要に応じて、追加の OCT で位置を固定します。大動脈根はナイフ刃に対して垂直に配置されます。通常の顕微鏡スライド上の心臓筋組織を含む初期制御切片を収集し、軽い顕微鏡下で200マイクロメートルごとに組織を通して進行を確認する。最初の大動脈カスプが現れたとき、断面平面を他の2つのカスプに揃え、点ゼロから切り取られた10マイクロメートルのセクションごとにカウントするために、試料を点ゼロカスプに向けて傾けます。計画されたスライドに従って90マイクロメートル以降から分析のためのセクションの収集を開始し、ポイントゼロから800マイクロメートルに達するまで。大動脈根の全血管面積の病変分率を計算すると、断面化中の角度差の可能性に対するデータの感度が低下します。さらに、マウス当たりの曲線下の面積またはアテロート病変サイズを計算し、データをドットプロットで提示して、グループ内の個々の変動をさらに視覚化することも例示できる。病変脂質蓄積は、全病変領域の赤O正の領域の色閾値をオイルで定量することができる。右および左の冠状動脈は、通常、大動脈から大動脈から250マイクロメートル程度の大動脈から発散し、しばしば最も顕著な病変サイズと一致する。顔大動脈アーチの代表的な画像の暗い背景を削除すると、視覚的な表示を強化することができます。病変サイズは通常グループ内に分布し、グループ間でスチューデントのt検定を使用した統計分析が可能です。実験サンプルを処理するための十分なスキルを習得するまで、いくつかのテスト資料を使用して練習することをお勧めします。病変サイズがグループ間で異なる場合は、病変組成分析が通常追求する次のステップであるため、メカニズムを決定する必要があります。

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