Name: 自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぶペプチド膜前駆体を用いた自律性小胞成長のベシキュロ合成法。ガラスビーズ薄膜再水和法でペプチドベースの小胞を形成し、転写翻訳系を組み込むことで膜タンパク質を産生する技術です。

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DFG TRR 235(生命の出現、プロジェクトP15)、欧州研究評議会(交付契約第694410 AEDNA)、およびTUM国際科学技術研究科(プロジェクトNo.9.05)を通じた財政支援に感謝します。.私たちは、サンプルの準備で彼女の助けをE.ファルゲンハウアーに感謝します。我々は、TX-TLシステムと有用な議論に対する彼らの助けに対して、A.デュビンとM.シュワルツ・シリングに感謝します。我々は、有益な議論のためにN.B.オランダに感謝します。

1. エラスチン様ポリペプチドの発現
<ol><li>1日目:ペプチド発現のためのスターター培養と供給の準備
	<ol>
<li>LB培地のフラスコ(4 x 2.5L)及び3LのLB培養フラスコを調修及びオートクレーブ。LB培地の1Lの場合は、1Lの超純水に25gのLB粉末を加えます。</li>
		<li>LB培地の100 mL、無菌濾過(0.22μmフィルター)クロラムフェニコール溶液(EtOHでは25mg/mL)、50μLの滅菌フィルター(0.22μmフィルター)カルベニシリン溶液(50%EtOHおよび50%のEtOHおよび50%の水)でスターター培養を行います。</li>
		<li>ポリペプチド配列MGHGVGVP((GEGVP) 4(GVGVP)4(GFGVP)4(GFGVP)4(GVGVP)3を含む大腸菌株BL21(DE3)pLysSを含む予備の細菌ストックから小さな筋を追加します。(GFGVP)4GWP(EFと略記)を予め温めた100 mLスターター培養物にし、振盪インキュベーターで250rpmで16時間37°Cでインキュベートする(大腸菌株およびベクターは要求あり)。</li>
		<li>発現培養フラスコとLB培養を一晩37°Cで予め温め、翌日に備える。</li>
	</ol></li>
	<li>2日目:タンパク質発現
	<ol>
<li>各発現培養フラスコにLB培地の750mL、無菌濾過(0.22μmフィルター)クロラムフェニコールストック(EtOHでは25mg/mL)、無菌フィルター(0.22μmフィルター)カルベニシリンストック(100mg/mL)の375μLを50%、50%の水当性を添加する。</li>
		<li>抗生物質を分配するために攪拌した後、600nm(OD 600)での光学密度測定のための基準サンプルとして培媒の2mLを取る。</li>
		<li>発現フラスコに開始培養の7.5 mLを追加し、250rpmで37°Cで1時間インキュベートします。</li>
		<li>このステップの後、各フラスコのOD600は20分ごとにチェックされます。</li>
		<li>光学密度が約0.8°Cに達すると、温度を16°Cに下げ、1M無菌濾過β-イソプロピルチオガラクシド(IPTG)の750μLを各発現フラスコに超純水に添加してペプチド発現を誘導する。</li>
		<li>誘導細菌で発現フラスコを16°Cで250rpmで16°Cでインキュベートする。</li>
	</ol></li>
	<li>3日目:発現ポリペプチドの抽出
	<ol>
<li>収穫後の細胞ペレットの質量の決定を可能にするために遠心フラスコを予計する。</li>
		<li>4,000 x gおよび4°Cで予冷した遠心分離機を用いて20分間遠心分離によって発現フラスコからすべての細菌を収穫する。</li>
		<li>上清を注ぎ、無菌のペーパータオルに遠心ボトルをブロットします。</li>
		<li>遠心フラスコの重量を量り、セルペレット質量を計算します。</li>
		<li>元の細胞培養物の750 mLからペレットダウンした細胞を、ピペッティングによりリン酸緩衝生理食べ物(PBS、pH 7.4)の15mLで、遠心分離機を4°Cで20分間4,000xgで再中断する。上清を注ぎ、無菌のペーパータオルに遠心ボトルをブロットします。</li>
		<li>リゾザイム(1mg/mL)、1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)、1mMベンザミジン、および0.5UのDNase Iを用いて、PBS(pH 7.4)を用いた細胞ペレット1グラム当たり2mLの緩衝液ステップに対する細胞ペレットを再ステージングする。</li>
		<li>10s超音波処理と20sの一時停止ステップを交互に8 Wで8 Wで氷上でさらなるライシスのために細胞を超音波処理し、その後、サンプルが氷上で冷却されるべき9分間の休止が続きます。もう一度9分の超音波処理ステップを繰り返します。</li>
		<li>核酸沈殿のための元の細胞培養の1L当たり10%(w/v)ポリエチレンアイミン(PEI)の2mLを添加する。</li>
		<li>サンプルを2mL遠心チューブに分配し、60°Cで10分間インキュベートし、その後4°Cで10分間インキュベーションを行います。</li>
		<li>溶液を4°Cで10分間16,000xgで遠心分離し、ELPを含む上清を回収する。 </li>
	</ol></li>
	<li>逆温度サイクリングによるタンパク質精製:
	<ol>
<li>上清を2のpHに調整し、ペプチドの親水性部分を疎水性に切り替え、凝集を誘導する。pHを調整するために、リン酸と水酸化ナトリウムが使用される。pHストライプは、pHレベルを決定するのに十分です。</li>
		<li>試料の精製の収率を向上させるには、試料を60°Cに加熱し、塩化ナトリウムを2Mまで添加する。</li>
		<li>続いて、室温(RT)で10分間16,000xgで試料を遠心分離する。 </li>
		<li>上清を破棄し、PBSでペレットを再溶解します(ただし、前のステップと比較して初期体積の半分しか使用されています)。</li>
		<li>リン酸と水酸化ナトリウムでpHを7に調整します。pHストライプは、pHを決定するのに十分に正確です。</li>
		<li>その後、サンプルを16,000 x gで4°Cで10分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を収集し、ステップ1.4.4の最後の繰り返しでは、PBSの代わりに水のみが追加される場合を除き、合計1.4.1~1.4.6を合計3倍まで繰り返します。</li>
		<li>吸収分光計でペプチドの濃度を測定します。280 nm で 5500/M/cm の消滅係数を使用します。</li>
		<li>ELPの濃度を700 μMに調整します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. ガラスビーズ法を用いたベシクル製造
<ol><li>遠心真空濃縮器を使用してELP溶液を1.1mMに濃縮します。</li>
	<li>濃縮ELP溶液の200 μLを2:1クロロホルム/メタノール混合物の1,250 μLと混合し、その後に渦を混ぜます。</li>
	<li>球状ガラスビーズ(サイズ212~300μm)を10mLの丸底フラスコに1.5g加えます。</li>
	<li>ELPとクロロホルム/メタノール混合物を含む溶液を丸底フラスコに加え、穏やかな振盪で混ぜます。</li>
	<li>フラスコをロータリーエバポレータに接続します。速度を 150 rpm に調整し、液体が室温で蒸発するまで約 4 分間-0.2 x 105 Pa (-200 mbar) に圧力を調整します。</li>
	<li>丸い底のフラスコを少なくとも1時間デシケータに入れ、残りのクロロホルムとメタノールが蒸発することを確認します。ガラスビーズの損失を避けるために、緩く取り付けられたアルミ箔は、丸い底のフラスコ開口部の周りにラップする必要があります。</li>
	<li>単一の実験では、ペプチド覆われたガラスビーズの100mgをPBSなどの膨潤溶液の60 μLと混合する。このサンプルを25°Cで5分間インキュベートします。</li>
	<li>ガラスビーズを堆積させるために、テーブルトップ遠心分離機でサンプルを素早く遠心分離します。</li>
	<li>小胞を含む上清を収集するためにピペットを使用してください。</li>
</ol>3. 大胞内のRNAアプタマーdBroccoliの転写
<ol><li>RNaseの除染液を含むワイプでラボベンチを清掃し、RNaseフリーの作業環境を作成します。</li>
	<li>T7プロモーターとdブロッコリー配列を含むssDNA(5μM)を混合する(GAGACGCGCGGGTCCCTGAGACGGGGTCGGGTCCATTCTTCTTGTGTGTGGTGGTGGTGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTGGTGGTGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCGCGCTTC)を含む、核不全水水で満たします。RNAPol反応バッファー[40 mMトリス-HCl(pH=7.9)、6 mMMgCl 2、1 mMジチオスレイトール(DTT)、および2mMスペルミジン)、転写反応のためのDNAテンプレートを調製する。</li>
	<li>溶液を90°Cで5分間インキュベートし、その後30分間20°Cまでゆっくりと温度を下げます。</li>
	<li>1 mM(5Z)-5-(3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン)-2,3-ジメチル-3,5-ジヒドロ-4H-イミダゾール-4-1(DFHBI)溶液をDMSOの5mLで1.26mgのDFHBIを溶解することにした。</li>
	<li>RNAPol反応バッファー[40 mMトリス-HCl(pH=7.9)、6mM MgCl 2、1mMジチオスレイトール(DTT)、および2mMスペルミジンを125mM KClと混合して転写反応を調製する。 15 mM MgCl2,4 mM rNTP, 10 μM DFHBI, 200 nM DNA テンプレート, 0.5 U/μL RNase抑制剤のマウス、および水。</li>
	<li>反応が始まる直前に、4 U/μL T7ポリメラーゼを加えます。</li>
	<li>この反応ミックスをステップ2.7の膨潤液として使用し、実験期間中37°Cでインキュベートし、通常は1時間である。</li>
</ol>4. 転写翻訳(TX-TL)反応
注:転写翻訳反応には、反応バッファーおよびDNAと同様に粗細胞抽出物が必要である。粗細胞抽出物は、Sun et al.18に記載されているように調製される。TX-TL反応の場合は、粗大腸菌抽出物の33%(v/v)、42%(v/v)反応バッファー、25%(v/v)フェノールクロロホルム精製DNAプラス添加剤を使用します。最終濃度は約9mg/mLタンパク質、50mM HEPES(pH=8)、1.5mM ATP、1.5mM GTP、0.9mM CTP、0.9mM UTP、0.2 mg/mL tRNA、26mMコエンザイムA、0.33mM NADM、0.75mM,30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, 13.3 mM マルトース, T7 RNA ポリメラーゼの 1 U, および 50 nM プラスミド DNA を超純水中.
<ol><li>
DNAテンプレートのフェノールクロロホルム精製
	<ol>
<li>LB培地5mL、無菌濾過(0.22μmフィルター)カルベニシリン溶液(50%EtOHで100mg/mL、50%超純水)で6つの一晩培養を行います。</li>
		<li>pET20b(+)発現ベクターを含むDH5α大腸菌を含むあらかじめ作られた細菌ストックから小さなストリークを各予め温めた5 mLの一晩培養に加え、250rpmで16時間37°Cでインキュベートします。どのペプチド(EF)またはタンパク質(YPetまたはmVenus)が発現されるかに応じて、特異的なエンコードプラスミドが使用される。</li>
		<li>ユーザーマニュアルに記載されているミニプレップキットでプラスミドを抽出するか、Zhang et al.24によって提供されるプロトコルに従います。</li>
		<li>精製前プラスミドDNAの100 μL(濃度は200~600ng/μLの範囲)を調製し、微小遠心管内のロチフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコールの100μL(pH =7.5~8.0)と混合して、より良い相分離を可能にします。</li>
		<li>RTでチューブを6倍までゆっくりと反転させ、遠心分離機をRTで16,000 x gで5分間反転させます。</li>
		<li>チューブの上相に200μLのクロロホルムを追加し、チューブを6倍まで反転させます。</li>
		<li>RTで5分間16,000 x gでサンプルを遠心分離します。</li>
		<li>上清を別のチューブにピプテし、エタノール沈殿用に酢酸ナトリウムの10 μLを加えます。</li>
		<li>-80 °Cコールドエタノールの1 mLを追加し、1時間-80°Cでサンプルを保存します。</li>
		<li>4°Cで15分間16,000 x gでサンプルを遠心分離します。</li>
		<li>上清をデカントし、-20 °Cコールド70%(v/v)エタノールの1 mLを追加します。</li>
		<li>4 °Cで5分間16,000 x gの遠心分離機。</li>
		<li>ピペッティングで液体を取り除きます。DNAペレットの邪魔にならないように注意してください。</li>
		<li>残りのエタノールを蒸発させるために約15分間RTでサンプルを保存します。</li>
		<li>サンプルに超純水を加え、サンプル濃度を約300nMに調整し、260nmで吸収して測定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
TX-TL反応の調製
	<ol>
<li>調製した粗細胞抽出物と氷上の反応バッファーを解凍する。</li>
		<li>60 μL反応ミックスの場合、プラスミドDNA(フェノールクロロホルム精製)を反応バッファーの37.5 μLに加え[50 mM HEPES(pH=8)]、1.5mM ATP、1.5mM GTP、0.9mM CTP、0.9 mM UTP、0.2 mM/ML tRNA、m3,0.75 mM cAMP, 68 mM フォリン酸, 1 mM スペルミジン, 30 mM PEP, 1 mM DTT, 2% PEG-8000, および 13.3 mM マルトース), 続いて粗細胞抽出物の 28.7 μL を添加.58.8 μLに超純水で最終容積に充填します。</li>
		<li>反応が始まる直前に、T7 RNAポリメラーゼ溶液の1.2 μLを加え、上下にピペッティングしてサンプルを混合します。</li>
		<li>この反応ミックスをステップ2.7の腫脹溶液として使用し、実験の持続時間(通常は4〜8時間)の29°Cでインキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 銅触媒アジドアルキネ・ホイスゲン・サイクロ添加によるフラオロフォアとのエラスチン様ポリペプチドの結合
<ol><li>DMSOに20mM NHS-アジドブチル酸N-ヒドロキシスチニミドエステル溶液を調製する。</li>
	<li>PBS(8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.42 g/L Na2HPO 4、0.27 g/L K2HPO4、pH= 7.2)およびNHS-アジド(1.2 mM)と12hでインキュベートするELP溶液(600 μM)を混合し、12 hでインキュベートします。</li>
	<li>10 kDa透析カセットにサンプルをロードし、塩と残留NHS-azideを除去するために、超純水の1Lで12時間4°Cで保存します。</li>
	<li>活性ELP(500 μM)をアルキン結合色素(500μM)、Cy5-アルキン、またはCy3-アルキンと混合します。</li>
	<li>このサンプルを1mM TBTA(トリス(ベンジルトリアゾリルメチル)アミン)、10mM TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)-塩酸リン)と10mM CuSO4と混合し、12時間4°Cでインキュベートします。</li>
	<li>10 kDa透析カセットにサンプルをロードし、1Lの超純水で12時間4°Cに保存し、塩と残留アルキン結合染料を除去します。</li>
	<li>これらの色素修飾ELPは、Cy3標識ELPとCy5標識ELPの1:1混合物で使用され、第2部のペプチドに類似したElPを標識する。</li>
</ol>

<ol><li>Chen, I. A., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+growth+of+fatty+acid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the growth of fatty acid vesicles.</a> Biophysical Journal. 87 (2), 988-998 (2004).</li>
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著者は、競合する金銭的利益を宣言しません。

フィルムの水分補給は、小さなユニラメラ小胞の作成のための一般的な手順です。故障の主な原因は、手順で使用される材料の誤った取り扱いです。

当初、ELPは大腸菌細胞によって産生される。ELP精製後の収率は、重要なステップの間にプロトコルがどの程度慎重に行われるかに応じて大きく異なる場合があります。これらは逆温度サイクリング(ITC)ステップと降水後のELPの再サスペンションです。精製のために、我々は、pHを酸性に変え、親水性ブロック内のグルタミン酸側鎖のプロトネーションにつながるリン酸の添加を通じてペプチドの疎水性崩壊を引き起こした。このステップの後、両方のブロックはRTで疎水性である。イオン強度を一定に保つために塩分が既に溶液中にある酸を用いることを好ましいが、塩酸などの他の酸も使用できる。ELP産生の収率を高めるために、塩は遷移温度Ttを減少させ、ELPをより疎水性にするので、コーセレーションプロセスを強化す...

合成生細胞系の作成は、通常、2つの異なる方向からアプローチされます。トップダウン法では、細菌のゲノムは必須成分に還元され、最終的には最小限の細胞につながります。ボトムアップアプローチでは、人工細胞は分子成分または細胞サブシステムからde novoを組み立てられ、一貫した細胞様システムに機能的に統合される必要があります。
de novoアプローチでは、必要な生化学成分の区分化は、通常、リン脂質または脂肪酸1、2、3、4から作られた膜を使用して達成される。これは、「現代」細胞膜は主にリン脂質から成り、脂肪酸はプレバイオティクス膜エンクロージャ5、6のもっともらしい候補と考えられているからである。新しい膜の形成、または膜の成長を促進するために、両友病のビルディングブロックは、対応する同化プロセス4を使用して膜区画内の生産を通じて、外側7から、または理想的には提供されなければならない。 、8.
脂質合成は比較的複雑な代謝過程であるが、ペプチドは無細胞遺伝子発現反応9、10を用いて非常に容易に産生することができる。したがって、親質ペプチドによって形成されたペプチド膜は、11を成長させることができる人工細胞模倣のためのエンクロージャとして脂質膜に対する興味深い代替手段を表す。
親水性エラスチン様二重合体(ELP)は、このような膜12のビルディングブロックとして機能することができるペプチドの魅力的なクラスである。ELPの基本アミノ酸配列モチーフは(GaGVP)nであり、「a」はプロリンを除く任意のアミノ酸であり、「n」は繰り返されるモチーフの数13、14、15、16、17である。.ELPは、主にフェニルアラニンを含む疎水性ブロックと、グルタミン酸11からなる親水性ブロックを用いて作成されている。pHおよび塩濃度などの溶液パラメータに応じて、ELPは温度Ttでいわゆる逆温度遷移を示し、ペプチドは親水性から疎水性への完全に可逆的な相転移を受ける状態。ペプチドの合成は、細菌細胞抽出物「TX-TL」を用いて小胞内で容易に実施することができる。結合転写および翻訳反応に必要なすべてのコンポーネント。
TX-TLシステムは、ガラスビーズからの脱水水分補給を固体サポートとして利用してELP小胞にELPをコードするDNAテンプレートを併用して一緒にカプセル化しました。小胞の形成は、ビーズ表面11からの乾燥ペプチドの水分補給を通じて起こる。小胞形成のための他の方法22は、潜在的に低い多分散性およびより大きな小胞サイズ(例えば、電気形成、エマルジョン相移動、またはマイクロ流体ベースの方法)を示す。封入法の生存率を試験するために、フッ素性アプタマーdBroccoli23の転写を代わりに11を用いることができ、これはTX-TL系を用いた遺伝子発現よりも複雑ではない。
ベシキュロにおける膜ビルディングブロックの発現とその後の膜への組み込みにより、小胞は11に成長し始める。ELPの膜組み込みは、FRETアッセイを介して実証することができる。この目的のために、初期小胞集団の形成に使用されるELPは、FRET対を構成する等しい分株で蛍光色素と結合される。ベシキュロにおける非標識ELPの発現および膜への組み込み時に、膜内の標識されたELPが希釈され、その結果、FRET信号は11減少する。共役のための汎用性と一般的な方法として、銅触媒アジドアルキネシクロ添加が使用される。トリス(ベンジルトリアゾリルメチル)-アミンなどの安定化リガンドを使用すると、反応は、共振反応に適した反応剤11の加水分解なしで生理学的pHで水溶液中で行うことができる。ペプチドを含む。
以下のプロトコルは、ELPベースのペプチドソームを成長するための製剤の詳細な説明を提示する。ガラスビーズ法を用いたペプチドおよび小胞形成の発現について説明する。さらに、ELP小胞内のタンパク質発現に対するフッ素性dBroccoliアプタマーおよび転写転写転写反応の転写を実施する方法について説明する。最後に、提供されるのは、蛍風素を有するELPの結合のための手順であり、これはFRETアッセイ11を介して小胞の成長を証明するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals</td><td>3012-032</td><td></td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock GelTM tube</td><td>VWR</td><td>733-2478</td><td></td></tr><tr><td>アルキン結合 Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777331</td><td></td></tr><tr><td>アルキン結合 Cy5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777358</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>ベンザミジン</td><td>カールロス</td><td>CN38.2</td><td></td></tr><tr><td>BL21 ロゼッタ 2 大腸菌株</td><td>ノバゲン</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>ブラッドフォード BSA タンパク質アッセイキット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>カール・ロス</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Carl Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carl Roth</td><td>4432.1</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Carl Roth</td><td>P024.1</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Lucerna Technologies</td><td>410</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>カール・ロス</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Carl Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>フォリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ、酸洗浄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (&beta;-イソプロピルチオガラクトシド)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>K-グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Carl Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Carl Roth</td><td>82.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Mg-グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>マイクロバイオスピンクロマトグラフィーカラム</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NHS-アジドリンカー(y-アジド酪酸オキシスクシンイミドエステル)</td><td>Baseclick</td><td>BCL-033-5</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Carl Roth</td><td>263.2</td><td></td></tr><tr><td>pH stripes</td><td>Carl Roth</td><td>549.2</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Carl Roth</td><td>6367.2</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline</td><td>VWR</td><td>76180-684</td><td></td></tr><tr><td>リン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>RNAPol 反応バッファー</td><td>NEB</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>RNase inhibitor murine</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Wipes</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9788</td><td></td></tr><tr><td>rNTP</td><td>NEB</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol</td><td>Carlroth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>RTS Amino Acid Sampler</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (キット)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Carl Roth</td><td>8655.1</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ろ過 (0.22 &micro;m filter)</td><td>Carl Roth</td><td>XH76.1</td><td></td></tr><tr><td>T7 polymerase</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>TBTA (tris(benzyltriazolylmethyl)amine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (from E. coli)</td><td>Roche Appliedサイエンス</td><td>MRE600</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td></td></tr></tbody></table>

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

生化学反応の区分化は、合成細胞の中心的な側面である。この目的のために、ペプチドベースの反応コンパートメントは、リポソームまたは脂肪酸ベースの小胞に対する魅力的な代替手段として機能する。外部または小胞内では、ペプチドを容易に発現し、膜前駆体の合成を簡素化することができる。ここで提供されるのは、ガラスビーズからの脱水水分補給を利用した両生血球エラスチン様ポリペプチド(ELP)に基づいて、直径約200nmの小胞を作成するためのプロトコルである。また、逆温度サイクリングによる細菌ELP発現および精製のためのプロトコル、ならびに蛍光色素によるその共生機能化についても提示する。さらに、本報告では、生化学反応の非複雑な例として、ELP小胞内のRNAアプタマーdBroccoliの転写を可能にするプロトコルについて説明する。最後に、蛍光タンパク質および膜ペプチドのベシキュロ発現を可能にするプロトコルが提供され、後者の合成は小胞の増殖をもたらす。

ベシクル生産 図1は、異なる膨潤溶液およびガラスビーズ法で調製された小胞の透過電子顕微鏡(TEM)画像を示す(Vogele etal.11も参照)。図1Aの試料については、小胞の形成を証明し、その大きさを決定するために、腫脹溶液としてPBSのみを使用した。TX-TLを膨潤液(図1B)として用いた場合、小胞も形成した。動的光散乱(DLS)測定は、ガラスビーズ法が小胞形成に影響を及ぼすことを示すために行われた。図2は、PBS(青色)にガラスビーズを含まずに調製したEF試料の測定強度自己相関曲線と、膨潤液(赤色)としてPBSを用いたガラスビーズ法で調製したEF試料を示す。サイズは、クミュラントフィット25から計算され、ガラスビーズ法なしで小胞を調製した場合、25%の多分散性...

ここに提示されるペプチドベースの小さなユニラメラ小胞の作成のためのプロトコルは、成長することができる。膜ペプチドのベシキュロ産生を容易にするために、これらの小胞は転写翻訳システムおよびペプチドコードプラスミドが装備されている。

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

私たちのプロトコルでは、小さなガラスビーズからのフィルム再水和を使用して、ペプチドで作られた反応コンパートメントを形成します。実験では、プロトコルのシンプルさと堅牢性の恩恵を受けます。この技術の主な利点は、使用された粗細胞抽出物のような敏感なサンプルを組み込む能力である。有機溶媒との接触は、サンプルに大きな影響を与えます。この手順を開始するには、遠心真空濃縮器を使用してELP溶液を1.1ミリモルに濃縮します。この濃縮液の200マイクロリットルを2~1クロロホルムとメタノール混合物の1,250マイクロリットルと混合します。溶液を完全に混合するボルテックス。次に、10ミリリットルの丸い底フラスコに球状ガラスビーズ1.5グラムを加えます。丸底フラスコにELPとクロロホルムメタノール溶液を加え、軽く振って混ぜます。フラスコをロータリーエバポレーターに接続します。速度を150 RPMに調整し、液体が室温で蒸発するまで約4分間、圧力を20,000パスカルに調整します。沸騰遅滞の可能性があるため、ロータリーエバポレーターを使用する際には注意が必要です。この後、丸底フラスコの開口部を中心にアルミ箔を緩く包み、ガラスビーズの損失を防ぎ、フラスコを少なくとも1時間デシケータに入れ、残りのクロロホルムとメタノールが蒸発することを保証する。単一の実験の場合、100ミリグラムのペプチドをガラスビーズと60マイクロリットルの膨潤液と混合する。このサンプルを摂氏25度で5分間インキュベートします。テーブルトップ遠心分離機を使用してサンプルを素早く遠心分離し、ガラスビーズを堆積させます。その後、小胞を含む上清を収集するためにピペットを使用しています。まず、予精製プラスミドDNAの100マイクロリットルを、ロティフェノール、クロロホルム、またはイソアミルアルコールの100マイクロ遠心チューブに混合して、より良い相分離を可能にします。チューブを6回まで静かに反転させ、遠心分離機を16,000 gで5分間室温にします。その後、上相に200マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを6回まで反転させます。試料を16,000倍gで遠心分離し、室温を5分間処理する。この後、上清を別のチューブにピペットし、エタノール沈殿のために3モル酢酸ナトリウムの10マイクロリットルを加える。冷たいエタノールを摂氏80度で1ミリリットル加え、サンプルを摂氏80度で1時間保存します。次に、サンプルを16,000回gで遠心し、摂氏4度で15分間遠心します。上清をデカントし、摂氏20度で冷たい70%エタノールの1ミリリットルを追加します。16,000倍gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。その後、ピペット処理により液体を除去し、DNAペレットを乱さないよう注意する。残りのエタノールを蒸発させるために、サンプルを室温で約15分間保存します。この後、サンプルに超純水を加えて、サンプル濃度を約300ナノモルに調整し、260ナノメートルで吸収して測定します。転写翻訳反応を調製するために、調製した粗細胞抽出および反応バッファーを氷上に従ってください。60マイクロリットルの反応ミックスの場合、反応バッファーの37.5マイクロリットルにプラズマDNAを追加し、粗細胞抽出物の28.7マイクロリットルを追加し、58.8マイクロリットルの最終体積に超純水で満たします。反応が始まる直前に、T7RNAポリメラーゼ溶液を1.2マイクロリットル加え、ピペットを上下に加え、混合します。実験期間中、サンプルと腫脹溶液を摂氏29度(通常は4~8時間)でインキュベートします。小胞の透過電子顕微鏡画像は、TX/TLやPBSなどの様々な膨潤液を使用して小胞を形成できることを示しています。どちらのソリューションでも、サイズ決定は簡単なステップです。動的光散乱は、ガラスビーズ法なしで調製された小胞が直径134ナノメートルをもたらし、ガラスビーズを使用すると25%の多分散性を有し、直径は168ナノメートルをもたらし、多分散性を有する21%の蛍光強度を有し、ELP小胞の内部で発現される2つの蛍光タンパク質の蛍光強度を測定し、その後、フルエンスプレートを使用して測定される。小胞形成後、小胞と外液の内容物は同じであり、したがって、抗生物質カナマイシンが外液に添加され、タンパク質発現を抑制することに注意することが重要である。コントロールとして、カナマイシンも膨潤液に添加され、その場合には小胞内部のタンパク質発現が抑制される。これは、カナマイシンが膜を通して拡散せず、常に内部発現を常に抑制することを示している。FRETアッセイは、膜へのELPの組み込みを実証するために行われます。膜Elpsの発現時に、膜内に追加のペプチドが組み込まれ、FRETペア間の平均距離が増加し、ドナーシグナルの増加をもたらす。提示された技術は、単純な反応容器を生成したり、ペプチドベースの膜を有する人工細胞を作成するために使用することができる。必要に応じて、内部のコンテンツを選択できます。これらのペプチド小胞を使用することで、我々は今、それらの中でより複雑な合成反応を楽しみにすることができます。

in-vesiculo-synthesis-peptide-membrane-precursors-for-autonomous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このプロトコルの詳細、大きな一枚膜脂質小胞へのペプチド移行の定量的測定のための方法。また、このメソッドは、膜の転座の割合に関する情報を提供し、効率的かつ自発的に脂質二重層を横切るペプチドを同定するために使用することができます。...

大型単層小胞へのペプチドの転座の測定

ローカライズされたカルシウム イオン勾配を使用して小胞の非接触マイクロマニピュレーション用手法を提案します。巨大な脂質ベシクルの近くのカルシウム...

ローカライズされたカルシウム イオン勾配に対応した膜小胞の膜を改造

膜タンパク質を再構成し、酵素やその他の水溶性成分をサブマイクロメートルおよびマイクロメートルサイズの脂質小胞にカプセル化するためのプロトコルを提示します。...

ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築

我々はシルバーシード媒介成長法を用いて星状の金nanostarsを合成した。...

シルバーシード媒介成長法によるゴールドNanostarの合成

ここでは、文化、人間の神経前駆細胞への自己組織化3次元足場の使用を説明します。我々は、フローサイトメトリーで、その後、例えば、分析する足場から細胞を解放するためにプロトコルを提示する。このプロトコルは、詳細な機構的な研究を行うために他の細胞型に適応される可能性があります。...

3次元自己組織化ペプチドハイドロゲル中のヒト神経前駆細胞の栽培

次のプロトコルは、チオール -...

ステップ成長PEG-ペプチドハイドロゲルからβ細胞のスフェロイドの発生と復旧

液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。...

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

ここでは私たちはドナーとアクセプターフルオロフォアサイト間のプロテアーゼ切断部位を導入する改良された発光共鳴エネルギー移動（LRET）方法を記載している。この修​​飾は、タンパク質精製せずに膜タンパク質の研究を可能にする、目的の膜タンパク質から生じる特定のLRET信号を得ることを可能にする。...

発光共鳴エネルギーは、哺乳動物細胞で発現膜タンパク質の立体構造変化を研究するために転送

電界紡糸ナノ繊維は、重量比は、優れた機械的完全性に大きな表面積を有し、細胞の成長と増殖を支えます。これらのナノファイバーは、生物医学的用途の広い範囲を持っています。ここでは、エレクトロスピニング法を用いて、ケラチン/ PCLナノ繊維を製造し、組織工学の可能な用途のために繊維を特徴付けます。...

医工学のためのケラチンベースのナノファイバーの合成

ヘパリンとプロタミンから製造された自己組織化高分子電解質複合体(PEC)をアルギン酸ビーズ上に堆積させ、骨形成成長因子の放出を閉じ込めて調節しました。この送達戦略により、脊椎固定術の用途でBMP-2の投与量を20倍に減らすことができます。この記事では、PECの利点と製造について説明します。...

ヘパリン結合ドメイン骨形成成長因子の送達のための高分子電解質複合体

学ぶペプチド膜前駆体を用いた自律性小胞成長のベシキュロ合成法。ガラスビーズ薄膜再水和法でペプチドベースの小胞を形成し、転写翻訳系を組み込むことで膜タンパク質を産生する技術です。

自律性小胞成長のためのペプチド膜前駆体のベシキュロ合成

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