Name: 実験研究のための海洋ペラジック・チュニケート・ドリオレッタ・ゲゲンバウリ(ウルジャニン1884)の栽培 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ海洋ゾウプラクトンDolioletta gegenbauriの実験室培養法。懸濁状態を維持する独自技術で、複雑な生活環を管理し、海洋生態系研究のモデル生物として活用できます。

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G.Aを含め、長年にわたりこのプロジェクトに蓄積された知識を提供してくださった多くの方々に感謝しています。もともとこれらのプロトコルを開発したパフェンホーファーとD.デイベル。M.ケスターとL.ランボリーはまた、これらの手順の開発に大きく貢献しています。 N.B.ロペス・フィゲロアとロドリゲス・サンティアゴは、表1に提供されるドリオリッドの豊富さの推定値を生成しました。この研究は、米国国立科学財団賞OCE 082599、MEFへの1031263、MEFとOCE 14595010の共同プロジェクト、およびMEFとDMGへの米国海洋大気庁賞NA16SEC4810007によって一部支持されました。私たちは、R/Vサバンナの勤勉で専門的な乗組員に感謝しています。リー・アン・デレオがフィギュアを用意し、チャールズ・Y・ロバートソンが原稿を校正し、ジェームズ(ジミー)ウィリアムズがプランクトンホイールを製作

1. D.ゲゲンバウリの養殖施設の整備
注:必要なすべての材料と機器は、材料の表に記載されています。
<ol><li>1M水酸化ナトリウム(NaOH)、0.06 Mペルマンガン酸カリウム(KMnO4)溶液を調出します。この溶液を調剤するには、NaOHの400gを10L脱イオン水に溶解する。NaOH溶液にKMnO4の100gを追加し、よく混ぜます。</li>
	<li>NaHSO3の100gを10L脱イオン水に溶解し、よく混ぜ合わせ、0.1Mの二硫酸ナトリウム(NaHSO3)溶液を調作します。 注意:これらの試薬は、吸入した場合に呼吸器系の問題を引き起こす可能性のある刺激物です。ヒュームフードなどの換気の良い場所に置きます。皮膚との接触を避けてください。取り扱い時は、保護手袋、防護服、目の保護、フェイスプロテクションを着用してください。</li>
	<li>実験室でドリオリッド培養を確立し、飼育する前に、培養瓶をきれいにし、殺菌する。<ol>
<li>脱イオン水で少なくとも3回、1.9Lおよび3.8L培養瓶をすすいでください。次のクリーニング手順にキャップが含まれていないため、スクリューキャップを乾燥させてください。</li>
		<li>NaOH/KMnO4溶液に浸漬することにより、1.9Lおよび3.8Lガラス培養瓶を洗浄し、殺菌します。瓶を一晩浸します。</li>
		<li>NaOH/KMnO4溶液から瓶を取り出し、瓶を二硫酸ナトリウム(NaHSO 3)溶液に浸します。瓶を一晩浸します。</li>
		<li>NaHSO3溶液から瓶を取り出し、脱イオン水で十分に洗い流します。瓶を乾かします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プランクトンホイール(図2)を温度制御空間(環境室)に置きます。温度を20°Cに平衡化する。カスタムプランクトンホイールの詳細については、補足図1を参照してください。</li>
</ol>2. 植物プランクトン文化
<ol><li>海洋藻類と微生物叢(NCMA)またはD.ゲゲンバウリの食品として使用される他のソースのための国立センターから藻類培養物を取得します。アイソクリシスガルバナ(CCMP 1323)、ロドモナスsp(CCMP 740)、および小さな珪藻土、タラシオシラ・ワイスフロギ(CCMP 1051)を含む2つのフラグレート種の混合物は、NCMAから得られ、以前の実験室で使用されてきました後部ドリオリッドに対する研究は成功17.</li>
	<li>NCMAが推奨するように、L1およびL1-Si成長培媒22を調製する。</li>
	<li>サプライヤーの指示に従って、新しい藻類培養を開始します。</li>
	<li>ストック培養を維持するために、厳格なアックス培養技術を用いて、2週間ごとに無菌55mLガラス培養管で25mLの新鮮な成長培養剤の0.5mLを25mLに移す。 注:定期的に移動せずに生きている藻類の文化を保存することは不可能です。培養物が長期間使用されず、非使用期間中培養を維持できない場合は、これらの一般的な藻類培養物を元のソース(NCMAなど)から再取得することをお勧めします。</li>
	<li>200mLの成長培養剤を含むクリーンな500mLプラスチック組織培養フラスコにドリオリッドを供給するための植物プランクトンの量を大量に調製する。<ol>
<li>アックス株(4mL)から成長培地の200mL(1:50希釈)に植物プランクトンを接種する。</li>
		<li>12:12 h光で20°Cでインキュベート:65-85 μE/m2の涼しい白色光照明の下で暗いサイクル。イルミネーションを最大化するために、培養フラスコを平らに置きます。毎日穏やかに文化を渦巻く。</li>
		<li>粒子カウンターまたは顕微鏡を使用して培養物の増殖を監視する細胞の濃度を決定します。 注:接種から7~10日後、フラグレート培養物には~10 5-106細胞/mLが含まれ、珪藻土培養には~104-105細胞/mLが含まれます。これらの濃度は、ドリオリッド培養を維持するのに十分である。</li>
		<li>すべての文化活動をサポートするのに十分な藻類バイオマスを提供するために、少なくとも2週間ごとに新しい供給ストックを開始します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 野生のドリオリッドと海水の培養
注: 収集と栽培のアプローチの概要を図 3に概説します。特殊なコレクション プランクトン ネットとタラエンドの説明を図 4に記載しています。
<ol><li>プランクトンネットまたはその場所イメージングシステム23を使用してそれらを検出することにより、ドリオリッドを見つけます。 注:ドリオリッドは表面水域にほとんど存在せず、リモートセンシング技術では検出できないため、ドリオリッドに有利な条件の前提条件の知識に導かれる(「議論」を参照)、ドリオリッドの存在を決定する必要があります。サンプリングの前に。</li>
	<li>D.ゲゲンバウリ培養を始める準備として、生きたドリオリッドを採取する前に、粒子が豊富な海水を採取してください。<ol>
<li>CTDロゼットまたは同等の装置に取り付けられたニスキンボトルを展開し、ドリオリッドが位置する場所から水を収集し、その場で蛍光体で推定されるクロロフィルの濃度の最も高い推定値を含む深さから水を収集します。 注:クロロフィル濃度は、粒子濃度の指標として使用されます。南大西洋ビッグト(SAB)中大陸棚では、最大の地下クロロフィルは通常底部に近いですが、他の場所ではそうではありません。</li>
	</ol></li>
	<li>ドリオリッドが見つかったら、特殊なプランクトンネットとタラエンドを使用して、損傷を受けていないドリオリッド動物園を回収します。網を展開する前に、タラの端に海水を充填します。<ol>
<li>漂流船から、下がり、水柱を通してネットを上げ、15-25°の斜め牽引角を維持し、垂直展開と検索速度は15 m/min以下です。</li>
	</ol></li>
	<li>ネットがオンボードされたら、タラエンドの内容物を3ガロン(〜20L)のプラスチックバケツにそれぞれ3、5ガロン(〜20L)のプラスチックバケツに分けて、現場から採取した表面海水を約10Lに分けます。 注:新しいプラスチックバケツは、ドリオリッドコレクションを生きる前に海水日数を加えることによって条件付けされるべきです。プラスチックからの化学物質の浸出を減らすことを目的とする。海水が利用できない場合は、精製(例えば、ミリQ)または有毒な汚染物質を含まない水道水を使用して、バケツを条件付けします。</li>
	<li>他のプランクトンからドリオリッド動物園を分離します。<ol>
<li>小さなバッチ(〜2L)で、ネットトウコンテンツ(現在20Lプラスチックバケツ)から2Lガラスビーカーに混合プランクトンを転送します。</li>
		<li>ワイドボアガラスピペット(8mm ID x 38cmの長さ)を使用して、慎重にサイフォンを使用し、積極的にサイフォンと積極的に泳ぐドリオリッド動物園をビーカーから、ドリオリッドがいたところからニスキンボトルを使用して収集された粒子が豊富な海水を含むクリーンなガラス培養瓶に移します。位置。</li>
		<li>海水の表面の下にドリオリッド動物園をそっと放出します。 注:ゴノズーイド、アソシゲーン開発ゴノゾードを含むホロズーイド、および付属のトロフォズーイドを含む看護師の段階を収集します(図1)。</li>
	</ol></li>
	<li>ドリリオリッドを添加した後、ロドモナスsp.培養物を~5 x 10 3~104細胞/mLの最終濃度に加え(〜5×104~1x10 5細胞/mLを3.8L瓶に含有する培養物の〜50 mL)。これは、ドリオリッドが積極的に給餌しているかどうかを判断する。ドリリッドがロドモナスspを摂取すると、消化管が赤色に表示されます。餌を与えているように見えない動物園を削除します。</li>
	<li>ドリリッドが空気水界面に閉じ込められるのを防ぐには、濾過されていない粒子が豊富な海水で瓶を完全に充填し、瓶の開口部(幅89mm)の上にプラスチックラップを置くことによって、培養瓶のヘッドスペースを避けてください。<ol>
<li>動物にダメージを与える気泡の作成は避けてください。慎重に瓶にキャップをねじ込み、気泡が存在するかどうかを確認するために瓶を穏やかに反転します。気泡が存在する場合は、それらを削除します。</li>
		<li>瓶が充填された後、瓶の外側から余分な水を拭きます。</li>
	</ol></li>
	<li>各瓶をプランクトンホイール(図2)に取り付け、ゴムチューブで覆われた垂直金属棒の上に瓶を置き、ステンレススチール製ホースクランプの間に取り付けます。<ol>
<li>瓶の背面がゴムチューブに対してクッションされていることを確認します。ネジを調整して、瓶の周りのホースクランプを締めます。</li>
		<li>瓶がしっかりと固定されたら動かないようにしてください。ドリオリッドをサスペンションに保つために、瓶を0.3 rpmで回転させます。 注意:瓶が割れるのを防ぐために、瓶を締め過ぎないようにすることが重要です。</li>
	</ol></li>
	<li>船上では、実験室の培養施設に移すことができるまで、薄暗い光の中でプランクトンホイール上の培養船を20°Cに維持します。</li>
	<li>研究室に戻ると、ドリオリッドを含む瓶を調製培養施設に移します。プランクトンホイールに瓶を取り付け(ステップ3.8を参照)、瓶が0.3 rpmで回転し続けることを可能にします。 注:本研究におけるドリオリッドのすべての飼育は、20°Cで行われた。</li>
</ol>4. D. ゲゲンバウリ文化の維持
<ol><li>船から実験室まで、動物が3日間実験室の条件に元の瓶に順応することを可能にする。<ol>
<li>順応期間中は、広いボアガラスピペットを使用して、毎日3日間、採取場所から濾過されていない粒子が豊富な海水と水の10%を交換します。</li>
		<li>瓶の中にいくつかのコペポッドを保管しますが、他のすべての動物プランクトン、大きなfecalペレット、およびドリアリドの濾過装置(粘液ネット)を詰まらせる可能性のある大きな凝集粒子を除去します。培養が初期の看護師で構成されている場合は、瓶の中に大きなゴノズーイド(≥6 mm)を1つ保管してください。 注:どのコペポッド種が培養に含まれるかは重要ではありませんが、この実験では、ドリオリッドが捕獲された場所から存在する最も豊富な種が使用されました。</li>
	</ol></li>
	<li>順応期間に続いて、ドリオリッド動物園とコペポッドを元の瓶から、80%のガラス繊維フィルター(GF/F)濾過海水と20%の海水を含むクリーンな栽培瓶に移します。0.7 μm のフィルターペーパーの公称細孔サイズでGF/Fを通して海水を濾過することにより、濾過海水を準備します。</li>
	<li>3日ごとにGF/F濾過海水と水の10%を交換し、凝集体と大腿骨ペレットを除去することにより、新しい培養を維持します。毎週、ステップ4.2で説明されているように、動物を新しい瓶に移します。</li>
	<li>40~ 95 μg C/L の培養瓶内の植物プランクトン濃度を維持することにより、ドリオリッドを養殖する。 注:これらの濃度は、D.ゲゲンバウリ17の開花条件をサポートすることが知られている環境条件を模倣します。藻類種の混合物は、各瓶のライフステージと動物園の数によって異なります。初期の段階では、クリプトモナド藻類(アイソクリシスガルバナおよびロドモナスsp.)の1:1混合物(炭素含有量による)のみを追加します。より大きな獲物種は、小さな看護師の摂食装置を容易に詰まらせ、トロフォズーイドを開発することができます。大きな看護師、恐怖症、ゴノズーイドを供給する際に、同じ炭素含有量で、藻類混合物に珪藻土タラシオシラワイスフロギーを追加します。<ol>
<li>藻類濃度を事前および供給後に監視し、培養物に添加する藻類の頻度と量の決定を導きます。培養瓶内の藻類濃度は比較的希薄であるため、粒子カウンターを使用して藻類濃度を決定します。</li>
	</ol></li>
	<li>残りのドリオリッドが成長するのに十分な食物を持っているように、40 - 95 μgC/Lの藻類濃度を維持するのに十分な動物園を削除します。 注:実験室の条件下で正常に維持するために最も困難なライフステージは、発達幼虫とウーゾード(早期看護師)です。培養のこの段階では、幼虫とウーズーイド(3.8L瓶あたり〜20)を発達させる瓶内のいくつかのコペポッドに加えて、1つの大きなゴノズーイド(≥6 mm)を保ちます。</li>
	<li>少なくとも4人の看護師を新しい培養瓶に移すと、少なくとも8個のトロフォズーイドが看護師のカドフォアに見える(図1B)。 注:トロフォズーイドは20°Cで1-2日ごとに数が倍増します。トロフォズーイドは肉眼で見えるほどの大きさです。<ol>
<li>看護師が20トロフォズーイドを開発したら、看護師の2人を削除します。</li>
		<li>看護師がカドフォアに30のトロフォズーイドを発症したとき、1人の看護師を取り除きます。残りの看護師がカドフォアでハロゾイドを開発できるようにします。</li>
		<li>看護師が最大30のフォロズイドを解放したら、看護師を削除します。</li>
	</ol></li>
	<li>フォロズイドのサイズが3mmに達したら、瓶の中の動物の数を減らす。<ol>
<li>フォロズイドが大きくなり(> 5 mm)、ゴノズーイドクラスターを開発した場合、4つのフォロズイドを除くすべてを取り除きます。</li>
		<li>gonozooid クラスターの数が大きくなり、餌を与え始めるとき、培養を 2 つのハロゾーイドに減らします。</li>
		<li>フォロズイドが最大30のゴノズーイドを放出したら、フォロズイドを取り除きます。</li>
	</ol></li>
	<li>ゴノズーイドの数を30匹から瓶につき2匹に減らす。受精卵を瓶に放出します。<ol>
<li>ウーズーイドが発達したら、瓶の中に単一のgonozooidを残して1つのgonozooidを取り除きます。 注:廃棄された看護師、フォロズーイド、およびゴノズーイドは、追加の培養物を播種し、さらなる実験を行うために使用することができます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者は宣言するものが何もありません。

ドリオリッドを培養する能力は、過去数十年にわたって確立され、いくつかの分野での研究を支援するために使用されています。私たちの研究室での実験的研究は、摂食と成長に焦点を当てた少なくとも15の科学的研究の出版をサポートしています18,26, 生殖18,28, 食事6, 29, 生理学30, 生態学31, および生態モデリング27.
これらの繊細な動物の文化は現在、労働集約的で時間がかかりますが、ドリオリッドの栽培は可能であり、より広範なコミュニティによって引き受ければ、この生態学的理解の進歩を促進...

海洋で最大の動物バイオマスを占める動物プランクトンは、海洋食物網の重要な構成要素であり、海洋生物地球化学サイクル1、2において重要な役割を果たしている。動物プランクトンは、生物の巨大な多様性で構成されているが、ゼラチン状と非ゼラチン性の2つのカテゴリーに大きく区別することができる:少数の中間タキサ3、4とゼラチン状。非ゼラチン性動物プランクトンと比較して、ゼラチン状の動物プランクトンは、その複雑な生命史5のために研究することは特に困難であり、その繊細な組織は捕獲および取り扱いの間に容易に損傷を受ける。ゼラチン性動物プランクトン種は、したがって、実験室で培養することが悪名高く、一般的に非ゼラチン種6と比較して研究が少ない。
ゼラチン状の動物プランクトン群の中で、世界の海洋における生態学的重要性の1つがタリア人である。サリアセアンは、サルピダ、ピロソミダ、およびドリオリダ7の命令を含むペラジックチュニケートのクラスです。ドリオリダは、総称してドリオリッドと呼ばれ、亜熱帯海洋の生産的な神経領域で高い豊富に達することができる小さなバレル状の自由水泳ペラジック生物です。ドリオリッドは、すべての動物プランクトングループの中で最も豊富なの一つである4、8.懸濁フィーダーとして、ドリオリッドは、フィルター電流を作成し、粘液ネット9上でそれらを捕捉することにより、水柱から食品粒子を収集します。分類的には、ドリオリッドは、フィルムウロホボルデータ10に分類される。タリアテスの祖先、および海洋ペラジック系の主要な構成要素としての生態学的意義に加えて、タリアセアンは植民地時代の生命史10、11および進化の起源を理解する上で重要である。コードの5,7,10,12,13,14.
ドリオリッドの人生の歴史は複雑であり、彼らのライフサイクルを通じてそれらを培養し、維持することの難しさに貢献しています。ドリウリッドのライフサイクルと解剖学のレビューは、Godeauxら15で見つけることができます.性的および無性の生命史段階の間の義務的な交互を伴うドリオリッドのライフサイクルは、図1に示される。卵子と精子は、ライフサイクルの唯一の孤独な段階であるヘルマフロジティック・ゴノズーイドによって産生される。Gonozooidsは水柱に精子を放出し、卵子は内部受精し、幼虫に成長するために放出される。幼虫の孵化と変態は、1〜2ミリメートルに達することができるウーズイドに変身し、環境条件と栄養を仮定すると、oozooidは20°Cで1〜2日以内に早期看護師となり、ライフサイクルの植民地段階を開始します。ウーズーイドは、腹部のストロンに芽を性的に産生する。これらの芽は、ストロンを残し、彼らは3つのペアの行に並んで後部カドフォアに移行します。中央の二重行はホロズーイドになり、外側の2つの二重列はトロフォズーイドになります。後者は、看護師とフォロズイド16、17の両方に食べ物を提供します。トロフォズーイドは、彼女がすべての内臓を失うように栄養を看護師に供給します。トロフォズイドの豊富さが増加するにつれて、看護師のサイズは実験室で15ミリメートルに達することができます。ハロズイドが成長するにつれて、彼らはますますプランクトンの獲物を摂取し、個人17として放出される前に約1.5ミリメートルの大きさに達する。単一の看護師は、その寿命18の間に>100のフォロズーイドを解放するかもしれません。ハロゾードがカドフォアから放出された後、彼らは成長し続け、ライフサイクルの第二の植民地段階です。彼らはサイズが〜5ミリメートルに達すると、各フォロズーイドは、彼らの腹部のペダンクル上のゴノズーイドのクラスターを開発します。これらのゴノズーイドは、長さが約1mmに達すると粒子を摂取することができます。gonozooidsが2〜3ミリメートルの大きさに達した後、彼らはフォロズイドから解放され、ライフサイクルの唯一の孤独な段階になります。彼らはサイズが〜6ミリメートルに達すると、gonozooidは性的に成熟した17になります。ゴノズーイドは9mm以上の長さに達することができます。ゴノズーイドは、ヘルマフロジティックであり、精子は卵子の受精が内部的に起こる間断続的に放出される16、17である。ゴノズーイドの大きさが≥6mmの場合、それは6個まで受精卵を放出する。培養を成功させるには、これらのユニークなライフヒストリーステージのそれぞれに固有のニーズをサポートする必要があります。
ドリオリッドを含むタリアセアンの生態学的、進化的意義により、この生物の固有の生物学、生理学、生態学、進化史の理解を進めるための栽培方法論が必要である19.ドリオリッドは、発生生物学および機能的ゲノミクスにおける実験モデル生物としてかなりの期待を持っている。しかし、信頼性の高い栽培方法の欠如は、実験室モデルとしての有用性を阻害する。少数の研究室が培養ドリオリッドに基づいて結果を発表しているが、我々の知識栽培アプローチと詳細なプロトコルは以前に発表されていない。長年の経験と試行錯誤の栽培の試みに基づいて、この研究の目的は、経験を見直し、ドリオリッドの収集と栽培のためのプロトコルを共有することであった, 特に種ドリオレッタゲゲンバウリ.

<table><tbody><tr><td>藻類培養チューブ(55mL滅菌使い捨てガラス培養チューブ)</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>藻類培養用</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>藻類培養用の滅菌装置および海水用</td></tr><tr><td>ビーカー(2Lガラス)</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>希釈プランクトンネット牽引内容物の選別用</td></tr><tr><td>バケツ(5ガロン、~20L)</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>プラントンネット牽引の内容物を希釈するために - 最初にカー</td></tr><tr><td>ボーイ(20 L)</td>を使用する前に海水を調整する必要があります&nbsp;<td>Any</td><td>NA</td><td>海水保存用</td></tr><tr><td>ドリオリッドガラス培養ジャー(1.9L狭口ガラスジャーキャップ付)</td><td>Qorpak</td><td>GLC-01882</td><td>培養用容器</td></tr><tr><td>ドリオリッドガラス培養ジャー(3.8L狭口ガラスジャーキャップ付)</td><td>Qorpak</td><td>GLC-01858</td><td>培養用容器</td></tr><tr><td>環境チャンバー(温度制御環境チャンバー)</td><td>Any</td><td>NA</td><td>プランクトンホイールと培養メンテナンスに対応するため</td></tr><tr><td>47mmフィルター用ろ過装置</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>培養用海水ろ過用</td></tr><tr><td>ガラスマイクロファイバーフィルター、47mm</td><td>Whatman</td><td>1825-047</td><td>培養用海水ろ過用</td></tr><tr><td>ガラスピペット(ホウケイ酸ガラスピペット(ガラス管)、OD10mm、内径8mm、壁厚1mm)</td><td>サイエンスカンパニー</td><td>NC-10894</td><td>カスタムカット&エッジ磨かれた</td></tr><tr><td>ホースクランプ、ステンレス鋼、#104 (178 mm)</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>プランクトンホイール</td></tr><tr><td>Isochrysis galbana株</td>に培養瓶を保持するため <td>CCMP1323 国立海洋藻類・微生物叢センター(NCMA)</td><td>株 CCMP1323</td><td>ドリオリド培養物の給餌用</td></tr><tr><td>L1 メディアキット、50 L</td><td>国立海洋藻類・微生物叢センター(NCMA)</td><td>MKL150L</td><td>藻類の培養用</td></tr><tr><td>ランプ(調整可能なアーム付き蛍光灯テーブルランプ)</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>瓶やビーカーのドリオリッドを照らすため</td></tr><tr><td>照明付き温度制御インキュベーター</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>藻類培養用</td></tr><tr><td>マイクロピペットと滅菌チップ(0-20 &micro;L、20-200 &micro;l, 200-1000&nbsp;&マイクロ;l)</td><td>藻</td><td></td><td>類培養プラン</td></tr><tr><td>クトンネット(202&マイクロ;m 0.5 m、長さ5:1)とタラエンドリングと&nbsp;4 L水族館タラ端</td><td>Sea-Gear Corporation</td><td>90-50x5-200-4A / BB</td><td>生きているdoliolidsを収集するため(図4を参照)</td></tr><tr><td>プランクトンホイール</td><td>NA</td><td></td><td>NAカスタムビルド(図2を参照)</td></tr><tr><td>プラスチックラップ</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>ドリオリッド培養瓶の蓋の内側を覆うために</td></tr><tr><td>過マンガン酸カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P279-500</td>瓶<td>やガラス製品を</td></tr><tr><td>洗浄するための試薬Rhodomonas&nbsp;sp. strain CCMP740</td><td>National Center for Marine Algae and Microbiota (NCMA)</td><td>strain CCMP740</td><td>ドリオリド培養物の給餌用</td></tr><tr><td>ゴムチューブ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>プランクトンホイールに培養瓶を保持するため(タイゴンチューブから作ることができます)</td></tr><tr><td>亜硫酸水素ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S654-500</td><td>瓶やガラス器具の洗浄用試薬</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td> フィ<td>ッシャー科学的な</td><td>BP359-212</td><td>洗浄瓶やガラス器具用の試薬</td></tr><tr><td>滅菌血清ピペット (1 mL、5 mL、10 mL、25 mL)</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>藻類培養用</td></tr><tr><td>Thalassiosira weissflogii株 CCMP1051</td><td>国立海洋藻類微生物叢センター(NCMA)</td><td>株 CCMP1051</td><td>ドリオリド培養の給餌用</td></tr><tr><td>組織培養フラスコ(250 mL)</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>藻類培養用</td></tr></tbody></table>

実験研究のための海洋ペラジック・チュニケート・ドリオレッタ・ゲゲンバウリ(ウルジャニン1884)の栽培

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

ゼラチン状の動物プランクトンは、海洋生態系において重要な役割を果たしています。しかし、一般的に、生理学、成長、性感、栄養相互作用を調べることは、主に培養能力を含む方法論的な課題に起因する。これは特にドリオリッド、ドリオレッタゲゲンバウリに当てはまります。D. ゲゲンバウリは、一般的に世界中の生産的な亜熱帯大陸棚システムで発生し、多くの場合、毎日の一次生産の大部分を消費することができるブルーム濃度で発生します。本研究では、実験室ベースの研究を行う目的で、D.ゲゲンバウリを収集、飼育、維持するための栽培アプローチについて述べた。D.ゲゲンバウリおよび他のドリオリッド種は、漂流船から斜めに牽引された円錐形202μmメッシュプランクトンネットを使用して生きて捕獲することができる。水温が21°Cを下回り、未熟なゴノズーイド、成熟したハロゾイド、および大きな看護師から始まる培養物は、最も確実に確立されます。培養は、ゆっくりと回転するプランクトンホイール上の丸みを帯びた培養船で維持され、何世代にもわたって天然海水で培養藻類の食事に維持することができます。D.ゲゲンバウリの実験室培養を確立する能力に加えて、我々は、採取条件、藻類濃度、温度、および自然条件付き海水への暴露がすべて文化にとって重要であることを実証する。D.ゲゲンバウリの確立、成長、生存、および再生。

ドリオリッドを収集および培養するための記載された手順に従って、図3に概説されたD.ゲゲンバウリは、その複雑な生涯の歴史を通じてD.ゲゲンバウリの培養を維持することができる(図1)。何世代にもわたってそれを維持する。D.ゲゲンバウリの栽培はここで説明するが、これらの手順は、他のドリオリッド種の栽培にも関連する必要がある。
健康で損傷のないドリオリッド動物園を捕獲するには、特殊なネットと牽引手順を適用する必要があります(図4)。硬い構造を持たない繊細な動物として、身体的損傷を引き起こす可能性のある手順を最小限に抑えるために注意が必要です。これらの要因には、乱流、圧力、およびネット、空気、気泡などのサーフェスとの相互作用が含まれます。しかし、その繊細な性質にもかかわらず、損傷を受けていないドリオリッド動物園は、開口部直径と長さ比1:5の円錐状プランクトンネッ...

ドリオレッタゲゲンバウリ種を含むドリオリッドは、世界中の生産的な亜大陸棚システムに見られる生態学的意義の小さなゼラチン状の海洋動物プランクトンです。これらの繊細な生物を培養することの難しさは、彼らの調査を制限します。本研究では、ドリオリッド・ドリオレッタ・ゲゲンバウリを収集、飼育、維持するための栽培アプローチについて述べた。

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

可分化モデル生物の利用可能性は、多くの研究分野における進歩の基本となってきた。このプロトコルは、私たちの知る限り、ドリオリッドを培養するために利用可能な唯一のアプローチです。信頼できるドリオライドの文化技術は、海洋の最も生産的な地域のいくつかにとって重要であり、脊椎動物の最も初期の進化の祖先を表す生物を研究するためのユニークな実験モデルを提供します。この技術は、藻類の食品粒子と生物が自然界で経験する容器の壁に接触することなく、水柱に浮遊し続けるのでユニークです。この培養方法は、他の小さなゼラチン系および甲殻類またはプランクトン種の培養に適用することができる。Doliolidsは複雑なライフサイクルを持っているので、各ライフステージのニーズを理解し、認識することが重要です。ライフサイクルを学び、それらを認識して処理する方法を学ぶには、多くの練習が必要です。私たちの経験では、この培養技術を学ぶ唯一の方法は、それを見てそれを行うです。エリン・アルネソン、ニコラス・カスタリン、ナタリア・ロペス、ローレン・ランボイエ、ブリアナ・ピアース、アーヤ・ロドリゲス=サンティアゴ、テレル・スカボローを含む他のいくつかのプロジェクト参加者も、このビデオに短時間登場しました。実験室でドリオリッド培養を確立し、飼育する前に、1.9リットルおよび3.8リットルのガラス培養瓶を過マンガン酸ナトリウム溶液に浸して洗浄し、殺菌する。瓶を一晩浸します。その後、亜硫酸ナトリウム溶液に瓶を移します。瓶を一晩浸します。次に、脱イオン水で瓶を十分に洗い流します。瓶を乾かします。ストックカルチャを維持するには、厳格な無数の培養技術を使用します。2週間ごとに、古い老化培養の0.5ミリリットルを無菌55ミリリットルガラス培養チューブ中の新鮮な成長培地の25ミリリットルに移す。ドリオリッドに供給するための植物プランクトンの大量を調製するには、植物プランクトンの4ミリリットルを無分離株から200ミリリットルの成長培地を含む500ミリリットルのプラスチック組織培養フラスコに移し、1〜50希釈で接種する。1平方メートルあたり65〜85マイクロEinsteinのクールな白色光照明の下で12〜12時間の明暗サイクルで20°Cの環境インキュベーターまたはウォークイン環境室で培養します。培養フラスコを平らにして、照明を最大限に引き出します。毎日、穏やかに文化を渦巻く。海に向かおう。大陸棚にドリオリッドを配置するには、水温、塩分、クロロフィルA蛍光をプロファイリングすることによって、ドリオリッドの存在に資する水の状態を特定するための海洋機器CTDを展開します。専用プランクトンネットで探索的ネットトウを行うことで、水の状態を確認します。あるいは、ドリオリッドを検出するためにin situプロファイリングイメージングシステムを使

cultivation-marine-pelagic-tunicate-dolioletta-gegenbauri-uljanin

Research

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Environment

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