Name: 葉反射率とクロロフィル蛍光解析の同時測定による光合成挙動の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶ 葉反射率とクロロフィル蛍光の同時測定法。Arabidopsisを用いて光合成挙動をリアルタイムで評価し、新規反射率パラメータの確立と植物生理応答の理解を深める手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

議論の活性化、ワークスペースの支援、実験の道具など、彦坂幸樹先生(東北大学)に感謝申し上げます。この作品は、KAKENHI[助成番号18K05592,18J40098]と内藤財団の一部で支援されました。

1. アラビドプシス植物の栽培
<ol><li>アラビドプシスタリアナ種子をマイクロチューブで殺菌した脱イオン水中に浸し、暗闇の中で4°Cで2日間インキュベートする。</li>
	<li>マイクロピペットを使用して、約4つの浸漬された冷たい処理された種子を土壌表面に置きます。16 h 光 (120 μmol フォトン m-2 s-1)と 8 h 暗い期間をそれぞれ 22 °C および 20 °C で成長室に植えたポットをインキュベートします。</li>
	<li>発芽後に他の苗を薄くすることによって、ポットごとに1つの植物を成長させる。少なくとも5つのポットを準備します。さらに4週間成長室で植物をインキュベートします。実験には3つの植物が使われる。</li>
	<li>光合成測定には、最も若い完全に開いた成熟した葉を使用します。</li>
</ol>2. サンプルステージ、光合成機器、光源の設定
注: このプロトコルでは、葉と検出プローブの固定にカスタム構築されたサンプルステージが使用されました (図1)。
<ol><li>カスタムメイドのサンプルステージに直径1cmの穴を持つ10 cm2鋼板を取り付けます。この版の穴のサイズは異なった葉のサンプルか植物の種を収容するために変えることができる。ステージには、検出プローブを固定するためのクリップと、プローブとリーフサンプル間の距離を調整するアジャスターがあります。</li>
	<li>クロロフィル蛍光および葉葉反射率を測定するための薄繊維プローブを調製します。これらの薄い繊維の調査は同じ葉の位置からの信号を測定するために密接に置かれる。 注:PAMクロロフィルフルオロメーターとスペクトル放射計は、それぞれ蛍光と葉の反射率のクロロフィルの信号検出に適合しました。両方の器械はそれぞれ1 mmおよび2 mmの直径の薄い繊維の調査を使用する。</li>
	<li>これら2つのプローブをしっかりと合わせ、プラスチックテープで包みます。</li>
	<li>同軸レンズホルダー(図1参照)を使用して、テープで留めたプローブをサンプルステージにクリップし、リーフサーフェスに垂直に配置します。 注:スペクトル放射計の光ファイバケーブルの視野はα = 25°です。この方法では、繊維プローブの先端と葉面との間の距離が1cmより短くなる。従って、測定葉面積は繊維のそれとほぼ同じである。</li>
	<li>ガラス繊維製のバイフォーク光ガイドをハロゲン光源に取り付け、約45°の角度で両方向からサンプルステージを照射します。 注:天然太陽光の波長分布に近いハロゲンランプは、光合成を誘導する放電光として使用されます。ハロゲン光源は、葉の表面温度(λ = 400〜800nm)の上昇を防ぐために、近赤外線から長い波長を除去する内蔵のコールドフィルタを使用して調整されました。</li>
	<li>光源を調整して、シャドウを投影せずにサンプルステージを均一に照らします。</li>
</ol>3. 葉の反射率とクロロフィル蛍光の同時測定の設定
注:すべてのステップは、アクチニックライト以外の光の検出を避けるために暗い部屋で実行されます。弱緑色の光(例えば、緑色のセロファン化光)は、実際の測定の前にオフにする必要があります。
<ol><li>リーフサンプルとサンプルステージ上のプローブ間の距離を測定する。<ol>
<li>暗闇の中でサンプルステージのリーフホルダーにテストリーフを置きます。ステージ上の鋼板に葉を押します(図1の黒い正方形)。</li>
		<li>PAMをオンにし、測定光で葉のサンプルを照射します。クロロフィル蛍光強度の値は、PAM制御ソフトウェアを使用して確認されます(材料の表を参照)。</li>
		<li>アジャスターを動かして蛍光強度が約100を測定します。プローブとリーフの間の距離を測定します。アジャスターを修正し、アジャスターの距離の値を記録します。</li>
		<li>測定ライトをオフにします。テストリーフを取り外します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
活性光の照度強度の測定 注:光依存性光合成挙動を観察するために、様々な強度の作動光を使用して葉のサンプルを照射します。<ol>
<li>サンプルリーフが配置される位置に光量子計を設定します。</li>
		<li>ハロゲン光源から光を照射し、強度を測定します。</li>
		<li>光源ダイヤルの位置が 30、60、120、240、および 480 μmol フォトン m-2 s-1の強度を生成する位置を決定します。 注:アラビドプシス植物は、120 μmol光子m-2 s-1の下で栽培されています。したがって、光光の照度強度は、小さく、大きな強度の範囲を提供するために選択されます。</li>
		<li>ダイヤル上の各照度強度をマークします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>反射規格を測定します。 注: 各照度強度で葉の反射率を計算するには、反射基準が必要です。<ol>
<li>葉のサンプルの位置に反射率標準として白いプレートを配置します。</li>
		<li>スペクトル放射計をオンにします。反射率信号は、スペクトル放射計制御ソフトウェアによって示されます。現時点では、照射光がないため、スペクトルデータはありません。</li>
		<li>ハロゲンランプをオンにして、480 μmolフォトンm-2 s-1、このテストで最も高い照射強度を照射します。</li>
		<li>飽和を避けるために、放射計の検出強度を調整します。</li>
		<li>30、60、120、240、および480 μmolフォトン m-2 s-1の照明下で 1 nm 間隔で 450 ~ 850 nm の間のスペクトル反射率を記録します。 注: ベースライン電気信号(暗電流)は、スペクトル測定のたびに補正され、減算されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 葉の反射率とクロロフィルの蛍光の同時測定と光合成パラメータの計算
<ol><li>葉のサンプル位置にプラントを設定します。<ol>
<li>成長室から成長室と同じ温度と湿度を持つ制御された暗い部屋にアラビドプシス植物を転送します。</li>
		<li>PSII反応中心から電子を放散し、非光化学的消光を緩和するために、22°Cで暗闇の中で1時間植物をインキュベートします。</li>
		<li>暗く適合した植物全体をサンプルステージの下のラボジャックに置きます(図1)。</li>
		<li>リーフのリーフをリーフ ホルダーに固定して、リーフ サーフェスが検出プローブに垂直になるようにします。</li>
	</ol></li>
	<li>PSIIの最大量子収率の測定。<ol>
<li>PAM をオンにして、カーブの記録を開始します。この値は0と呼ばれています。</li>
		<li>測定ライトをオンにし、カーブが応答するのを約 30 s 待ちます。この値はF0と呼ばれています。</li>
		<li>PAM から 0.8 s に対して 4000 μmol フォトン m-2 s-1の飽和パルスを与えます。</li>
		<li>蛍光強度を高めるカーブのスパイクの最高値を取得します。この値はFMと呼ばれています。</li>
		<li>次の式を使用して、暗闇(FV/FM)におけるPSIIの最大量子収率を計算する。 FV/FM = (FM – F0) / FM 
</li>
	</ol></li>
	<li>安定した状態での光合成挙動の測定。<ol>
<li>FMを記録した後、測定灯を点灯した外部光源としてハロゲンランプをオンにします(4.2.4参照)。まず、最も弱い光(30 μmol光子m-2 s-1)で葉のサンプルを照射します。</li>
		<li>スペクトル放射計を同時にオンにして、葉の反射率を監視します。</li>
		<li>光の条件下で光合成反応が安定した状態に達するまで20分以上待ちます。定常状態の蛍光強度をFsと呼ばれる。</li>
		<li>アチニン光で照度中に1分間隔で飽和パルスを供給します。パルス光の下で達成される最大蛍光値は、FM'と呼ばれる。</li>
		<li>アクチニックライトをオンにした後、20分でF M'のデータを記録します。</li>
		<li>暗電流減算で、最適化された積分時間で10回のスキャンを平均してリーフ反射率データを取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>定常状態での光合成パラメータの計算。<ol>
<li>次の式を用いて、電光下の飽和パルスを照射して推定できるPSII光化学(ΦPSII)の量子収率を算出する。 ΦPSII = (FM'- FS) / FM′</li>
		<li>PSII反応中心からの線形電子フラックス(LEF)を以下の4と推定する。 LEF=作動光の照度×Φ PSII×0.5×0.84</li>
		<li>次の式を使用して、放熱を表すことができるNPQを計算します。 NPQ = (FM - FMの ) / FM′ 注:光エネルギーは、主に光合成反応によって消費されます。しかし、植物が光合成によって消費されるエネルギーよりも多くの光エネルギーを吸収する場合、放熱のメカニズムは余分なエネルギーを避けるために誘導されます。</li>
		<li>同じ光条件下で放射計で取得したスペクトルデータを用いて、葉の反射率を次のように算出する。 反射率 =R葉/R規格
</li>
		<li>PRI を 531 nm および 570 nm から次のように計算します。これら2つの波長は、反射率から抽出される。 PRI = (R531-R570)/ (R531+R570) 注: R は反射率です。</li>
	</ol></li>
	<li>非光化学消光の緩和運動学の測定。<ol>
<li>Fsおよびリーフ反射率を取得した後、アクチニックライトをオフにします。</li>
		<li>光を消した後、PAMによるクロロフィル蛍光を10分間監視します。</li>
		<li>暗いリラクゼーションの間に1分の間隔で飽和パルスを提供します。暗闇下の飽和パルスによって誘導される最大蛍光値をF M''と呼ばれる。1 回のテストで 10 個のFM'' を取得します。</li>
		<li>アクチニックライトをオフにした後、2分10分でF M''のデータを保存します。 </li>
		<li>次の照射強度に設定されたアチニックライトを回すと、60 μ mol フォトン m-2 s-1になります。</li>
		<li>20分間の光の適応と1分間隔でパルス飽和光で10分間の暗いリラクゼーションを繰り返します。120、240、および 480 μ mol フォトン m-2 s-1で照射を使用して、すべてのステップと測定を繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>リラクゼーション運動学からの非光化学消光のパラメータの計算。 注:NPQの光依存性誘導は、光源13をオフにすることによって緩和される。緩和タイムスケールを調整することで、各NPQ関数を分別することが可能です。<ol>
<li>2分の暗い適応後にF M''を使用してqE(エネルギー依存性クエンチング)分率を推定します。 qE = (FM2m'- FM') / FM′ 注: qE 分数は 1 ~ 2 分以内に急速に反転します。この画分は、主にPsbSプロトン化およびキサントフィル変換の一部を含み、これは、甲状腺膜13全体の光誘発ΔpHに依存する。どちらもグラデーションの内訳で元に戻せそうです。</li>
		<li>10分の暗い適応の後にF M'''を使用してqZ(ゼアキサンチン依存性クエンチン)分率を計算します。 qZ = (FM10m'-FM') / FM′ 注:アクチニン光オフ後約10分でのNPQのリラクゼーション運動学は、キサントフィルサイクル14を反映する。キサントフィル変換のほとんどは、VDE(ビオラキサンチン脱エポキシダーゼ)酵素反応を必要とするため、約10分(qZ)の長いタイムスケールで逆転する。分画はまた、甲状腺膜全体のΔpHの分解によって緩和される。</li>
		<li>qI(光抑制状態)を以下のように算出する。 qI = (FM–FM10m'') / FM′ 注:NPQ画分の中で最も遅い回復は、PSII(D1売上高を示す)の光損傷であると考えられている。この光抑制状態(qI)のこの割合は、10分15によって回復しない。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Xue, J., Su, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+remote+sensing+vegetation+indices%3A+A+review+of+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sensors%22%5BJournal%5D)">Significant remote sensing vegetation indices: A review of developments and applications.</a> Journal of Sensors. 1353691, (2017).</li>
<li>Cotrozzi, L., Townsend, P. A., Pellegrini, E., Nali, C., Couture, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflectance+spectroscopy%3A+a+novel+approach+to+better+understand+and+monitor+the+impact+of+air+pollution+on+Mediterranean+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Reflectance spectroscopy: a novel approach to better understand and monitor the impact of air pollution on Mediterranean plants.</a> Environmental Science and Pollution Research. 25 (9), 8249-8267 (2018).</li>
<li>Han, L., Yang, G., Yang, H., Xu, B., Li, Z., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+Field-Based+Maize+Phenotyping+of+Plant-Height+Growth+and+Canopy+Spectral+Dynamics+Using+a+UAV+Remote-Sensing+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Clustering Field-Based Maize Phenotyping of Plant-Height Growth and Canopy Spectral Dynamics Using a UAV Remote-Sensing Approach.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1638(2018).</li>
<li>Baker, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+Fluorescence%3A+A+Probe+of+Photosynthesis+In%5BTitle%5D)+AND+%22Vivo.+Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll Fluorescence: A Probe of Photosynthesis In.</a> Vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).</li>
<li>Cruz, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Environmental+Photosynthetic+Imaging+Reveals+Emergent+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Dynamic Environmental Photosynthetic Imaging Reveals Emergent Phenotypes.</a> Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).</li>
<li>Ruban, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+efficiency+of+photoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantifying the efficiency of photoprotection.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1730), 20160393(2017).</li>
<li>Gamon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+sensing+of+the+xanthophyll+cycle+and+chlorophyll+fluorescence+in+sunflower+leaves+and+canopies%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Remote sensing of the xanthophyll cycle and chlorophyll fluorescence in sunflower leaves and canopies.</a> Oecologia. 85 (1), 1-7 (1990).</li>
<li>Gamon, J. A., Peñuelas, J., Field, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+narrow-waveband+spectral+index+that+tracks+diurnal+changes+in+photosynthetic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Remote+Sensing+of+Environment%22%5BJournal%5D)">A narrow-waveband spectral index that tracks diurnal changes in photosynthetic efficiency.</a> Remote Sensing of Environment. 41 (1), 35-44 (1992).</li>
<li>Rahimzadeh-Bajgiran, P., Munehiro, M., Omasa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+the+photochemical+reflectance+index+%28PRI%29+and+chlorophyll+fluorescence+parameters+and+plant+pigment+indices+at+different+leaf+growth+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynthesis+Research%22%5BJournal%5D)">Relationships between the photochemical reflectance index (PRI) and chlorophyll fluorescence parameters and plant pigment indices at different leaf growth stages.</a> Photosynthesis Research. 113 (1-3), 261-271 (2012).</li>
<li>Niyogi, K. K., Grossman, A. R., Björkman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mutants+define+a+central+role+for+the+xanthophyll+cycle+in+the+regulation+of+photosynthetic+energy+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mutants define a central role for the xanthophyll cycle in the regulation of photosynthetic energy conversion.</a> Plant Cell. 10 (7), 1121-1134 (1998).</li>
<li>Kohzuma, K., Hikosaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+validation+of+photochemical+reflectance+index+%28PRI%29+as+a+photosynthetic+parameter+using+Arabidopsis+thaliana+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Physiological validation of photochemical reflectance index (PRI) as a photosynthetic parameter using Arabidopsis thaliana mutants.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 498, 52-57 (2018).</li>
<li>Hikosaka, K., Noda, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+leaf+CO2+assimilation+and+Photosystem+II+photochemistry+from+chlorophyll+fluorescence+and+the+photochemical+reflectance+index%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+and+Environment%22%5BJournal%5D)">Modeling leaf CO2 assimilation and Photosystem II photochemistry from chlorophyll fluorescence and the photochemical reflectance index.</a> Plant, Cell and Environment. 42 (2), 730-739 (2019).</li>
<li>Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin-like%2F%CE%B2-propeller+protein+maintains+the+efficiency+of+light+harvesting+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), E2733-E2740 (2013).</li>
<li>Nilkens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+slowly+inducible+zeaxanthin-dependent+component+of+non-photochemical+quenching+of+chlorophyll+fluorescence+generated+under+steady-state+conditions+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).</li>
<li>Davis, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+to+photosynthesis+by+proton+motive+force-induced+photosystem+II+photodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Limitations to photosynthesis by proton motive force-induced photosystem II photodamage.</a> Elife. 5, 16921(2016).</li>
<li>Wong, C. Y. S., Gamon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photochemical+reflectance+index+provides+an+optical+indicator+of+spring+photosynthetic+activation+in+evergreen+conifers%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The photochemical reflectance index provides an optical indicator of spring photosynthetic activation in evergreen conifers.</a> New Phytologist. 206 (1), 196-208 (2015).</li>
<li>Miyake, C., Amako, K., Shiraishi, N., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acclimation+of+Tobacco+Leaves+to+High+Light+Intensity+Drives+the+Plastoquinone+Oxidation+System%E2%80%94Relationship+Among+the+Fraction+of+Open+PSII+Centers%2C+Non-Photochemical+Quenching+of+Chl+Fluorescence+and+the+Maximum+Quantum+Yield+of+PSII+in+the+Dark%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acclimation of Tobacco Leaves to High Light Intensity Drives the Plastoquinone Oxidation System—Relationship Among the Fraction of Open PSII Centers, Non-Photochemical Quenching of Chl Fluorescence and the Maximum Quantum Yield of PSII in the Dark.</a> Plant and Cell Physiology. 50 (4), 730-743 (2009).</li>
<li>Munekage, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+electron+flow+around+photosystem+I+is+essential+for+photosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclic electron flow around photosystem I is essential for photosynthesis.</a> Nature. 429 (6991), 579-582 (2004).</li>
<li>Tubuxin, B., Rahimzadeh-Bajgiran, P., Ginnan, Y., Hosoi, F., Omasa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+chlorophyll+content+and+photochemical+yield+of+photosystem+II+%28%CE%A6PSII%29+using+solar-induced+chlorophyll+fluorescence+measurements+at+different+growing+stages+of+attached+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Estimating chlorophyll content and photochemical yield of photosystem II (ΦPSII) using solar-induced chlorophyll fluorescence measurements at different growing stages of attached leaves.</a> Journal of Experimental Botany. 66 (18), 5595-5603 (2015).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

本研究では、クロロフィル蛍光と葉葉反射率を同時に測定することにより、PRIがキサントフィル色素を表すことを示す追加の証拠を得た。
太陽光に似た波長を持つハロゲン光は、光合成を活性化する光源として用いられる。当初は葉面の熱損傷を避けるために白色LED光源を使用していましたが、これはゆっくりとした暗いリラクゼーション運動と非常に高いqI(光抑制クエンチング)を生成し、おそらくPSIIを損傷する。そのため、ハロゲンランプにコールドフィルターを内蔵し、熱生産を低減しました。この光源は、暗い回復またはqIで異常を引き起こさなかった。
この方法で最も重要な変数は、葉、光源、検出プローブの位置関係です。クロロフィル蛍光と葉の反射率を様々な斜めの角度から、真上から葉に照射する光で測定した試験を行いました。ただし、検出信号の強度は角度によって異なります。この変動を避けるために、プローブは葉のサンプルの上に垂直に固定されました(図1)。光源は、左右両側から葉面を照射した分岐繊維を用いて送...

葉の反射率は、植物1、2の光合成または形質を反映する植生指数をリモートで感知するために使用されます。赤外線反射信号に基づく正規化された差植生指数(NDVI)は、クロロフィル関連特性の検出に関する最も広く知られている植生指標の1つであり、生態・農業科学において木や作物3の環境応答の指標.フィールドスタディでは、多くのパラメータ(例えば、クロロフィル指数(CI)、水指数(WI)など)が開発され、使用されているが、これらのパラメータが直接(または間接的に)検出されるものの詳細な検証は、変異体を使用して行われている。
クロロフィル蛍光のパルス振幅変調(PAM)分析は、光系II(PSII)4に関与する光合成反応およびプロセスを測定する有効な方法である。クロロフィル蛍光は、カメラで検出し、光合成変異体5をスクリーニングするために使用することができる。しかし、クロロフィル蛍光のカメラ検出には、暗い処理や光飽和パルスなどの複雑なプロトコルが必要であり、現場での研究では実装が困難です。
葉吸収太陽光エネルギーは、主に光合成反応によって消費されます。対照的に、余分な光エネルギーの吸収は活性酸素種を生成し、光合成分子に損傷を与える可能性があります。余分な光エネルギーは、非光化学消光(NPQ)メカニズム6を通じて熱として放散されなければならない。葉反射パラメータの光依存性変化を反映する光化学反射率指数(PRI)は、531および570nm(基準波長)7、8の狭帯域反射率に由来する。クロロフィル蛍光分析9においてNPQと相関することが報告されている。しかし、NPQはキサントフィルサイクル、状態の伝統、および光阻害を含む複合パラメータであるため、PRIパラメータが何を測定するかを理解するために詳細な検証が必要です。我々は、キサントフィル色素(アンテラキサンチンとゼアキサンチンに対するビオラキサンチン)の脱エポキシ化を伴う放熱システムであるキサントフィルサイクルと、PRIとこれらの変換との相関関係からNPQの主成分に焦点を当ててきた。顔料は、以前の研究8で報告されています.
多くの光合成関連変異体がアラビドプシスで単離され同定されている。npq1変異体は、ビオラキサンチン脱エポキシダーゼ(VDE)に変異を持ち込むためゼアキサンチンを蓄積しない。PRIがキサントフィル色素の変化のみを検出するかどうかを確認するために、NPq1と野生型の同じ葉領域でPRIとクロロフィル蛍光を同時に測定し、抽出する暗いリラクゼーションの様々な時間スケールでNPQを解剖した。キサントフィル関連成分11.これらの同時測定は、植生指数の割り当てに有益な手法を提供します。さらに、PRIは一次生産性(GPP)と相関するため、PRIを1つのコンポーネントに正確に割り当てる能力は、エコロジー12において重要な用途を有する。

<table><tbody><tr><td>ハロゲン光源</td><td>OptoSigma</td><td>SHLA-150</td><td></td></tr><tr><td>光量子計</td><td>LI-COR</td><td>LI-1000</td><td></td></tr><tr><td>PAM クロロフィル蛍光光度計</td><td>Walz</td><td>JUNIOR-PAM</td><td></td></tr><tr><td>PAM制御ソフト</td><td>Walz</td><td>WinControl-3.27</td><td></td></tr><tr><td>反射率標準器</td><td>Labsphere, Inc.</td><td>SRT-99-050</td><td></td></tr><tr><td>分光放射計</td><td>ADS Inc.</td><td>Field Spec3</td><td></td></tr><tr><td>分光放射計制御ソフトウェア</td><td>株式会社ADS</td><td>RS3</td><td></td></tr></tbody></table>

葉反射率とクロロフィル蛍光解析の同時測定による光合成挙動の評価

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

クロロフィル蛍光解析は、無傷の植物における光合成挙動の測定に広く用いられており、光合成を効率的に測定する多くのパラメータの開発に成功しています。葉反射解析は、光化学反射率指数(PRI)を含む、生態学と農業におけるいくつかの植生指数を提供し、光合成時の熱エネルギー放散の指標として使用できます。非光化学クエンチング(NPQ)。ただし、NPQ は複合パラメータであるため、PRI パラメータの性質を理解するには、その検証が必要です。PRIパラメータの評価のための生理学的証拠を得るために、キサントフィルサイクル欠陥変異体(npq1)および野生型アラビドプシス植物におけるクロロフィル蛍光と葉反射率を同時に測定した。さらに、キサントフィルサイクルを反映する可能性が高いqZパラメータは、光をオフにした後にNPQの緩和運動をモニタリングすることによりクロロフィル蛍光分析の結果から抽出した。これらの同時測定は、パルス振幅変調(PAM)クロロフィルフルオロメーターとスペクトル放射計を用いて行った。両方の計測器からのファイバープローブを互いに近くに配置し、同じ葉の位置からの信号を検出しました。外部光源を用いて光合成を活性化し、PAM装置から測定灯と飽和光を供給した。この実験システムにより、無傷の植物における光依存性PRIをモニタリングすることができ、PRIにおける光依存性変化が野生型とnpq1変異体の間で大きく異なることを明らかにした。さらに、PRIはqZと強く相関し、qZはキサントフィルサイクルを反映することを意味する。これらの測定を組み合わせることで、葉葉反射率とクロロフィル蛍光の同時測定がパラメータ評価の有効なアプローチであることを実証しました。

図1は、クロロフィル蛍光と葉葉反射率を同時に測定するための実験設定の概略図を示す。PAMとスペクトル放射計のファイバープローブは、カスタムメイドのサンプルステージ上のリーフホルダーのリーフ表面に垂直に設定され、ハロゲンランプは、鋳造することなく左右方向からの光照射に使用されました。影。PAMおよび葉反射信号は、別々のシステムのソフトウェアを使用して検出されました。この実験システムを用いて、アラビドプシス野生型(Col)とnpq1変異体(ゼアキサンチン欠乏)植物を比較した(図2)。葉反射率から算出したΔPRIは、PAM(図2A)で推定されたPSIIからの光依存性線形電子流に対してプロットした。PRIは、キサントフィルだけでなく、カロテノイド16によっても影響を受けると報告されている。PRIは、各光強度マイナスPRIで、光に依存するPRI変化11</...

PAMとスペクトル放射計を用いて蛍光と葉の反射率を同時測定し、高等植物における光合成応答を研究する新しい技術手法を説明する。アラビドプシスの同じ葉の領域。

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...

すでに知られている変異型植物モデルを用いたクロロフィル蛍光分析による葉反射率の同時測定により、新たな反射率パラメータの確立が容易となる。当社の方法による新しいリーフ反射率パラメータの構築により、自然環境条件下での変化する植物行動のリアルタイムモニタリングが可能です。実験を始める前に、この回路図に示すように測定システムを設定します。サンプルステージ、光源、PAMフルオロメーター、およびスペクトル放射計を使用。次に、カスタムメイドのサンプルステージに直径1cmの穴を持つ10cmの正方形の鋼板を取り付けます。そして2つの薄い繊維の調査をしっかりと合わせる。プローブをプラスチックテープで包みます。次に、ホルダーを使用して、テーピングされたプローブをサンプルステージにクリップします。プローブをサンプルステージに垂直に配置します。そして、ハロゲン光源にガラス繊維で作られたビフォークされた光導口を取り付けます。次に、サンプルステージを両方向から約45度の角度で根絶します。光源を調整して、光が影を落とさずにサンプル ステージを均一に照らします。左反射率とクロロフィルの蛍光分析を同時に測定するために、緑色のセロファン光のある暗い部屋で、試料ステージの葉ホルダーに試験プラントを配置し、ステージ上の鋼板の穴に対して葉をタッチする。弱い緑色のライトを消した後、PAMのフルオロメーターをオンにし、測定光で葉のサンプルを根絶します。蛍光強度が約100を測定し、プローブとリーフの間の距離を測定するようにアジャスターを移動します。アジャスターを所定の位置に固定し、アジャスターの距離の値を記録します。その後、測定光をオフにし、試験プラントを取り外します。アクチン性光強度測定では、サンプル葉が配置される位置に光量計を配置します。ハロゲン光源から光を照射し、光源強度を測定する。光源ダイヤルのどの位置で 30、60、120、240、480 マイクロモル陽子を毎秒 1 メートルあたり 2 乗で生成するかを決定します。白いプレートを反射性標準として葉試料の位置に配置します。そして、スペクトル放射計をオンにします。350~850ナノメートルのスペクトル反射率を調整します。照射光がないため、現時点ではスペクトルデータはありません。ハロゲンランプをオンにして、毎秒480マイクロモル光子を1メートルあたり480マイクロモル光子で照射します。このテストで最高の放射強度を、飽和を避けるために、ラジオメーターの検出強度を調整します。次に、1秒あたり30、60、120、240、480マイクロモル光子を照射して分光反射率を記録します。葉の反射率とクロロフィルの蛍光分析の同時測定のために、同じ温度と湿度で成長室から暗室に植物を移します。1時間後、葉のサンプル位置にシロイヌナズナズの植物を置きます。そして、葉表面が検出プローブに垂直になるように、サンプルリーフを葉に固定します。PAMのフルオロメーターをオンにして、カーブ記録を開始します。この値はゼロと呼ばれます。測定ライトを点灯し、約30秒待ってカーブが反応します。この値は F ゼロと呼ばれます。PAMから0.8秒間、毎秒4,000マイクロモル光子の飽和パルスを1秒当たり0.8秒間送達し、蛍光強度を高めて曲線のスパイクの最高値を得る。この値はFmと呼ばれ、次に式を使用して、暗闇の中で写真系2の最大量子収率を計算します。定常状態での光合成挙動を測定するために、Fmを記録した後、1メートル当たり30マイクロモル光子を1秒あたり30マイクロモル光子で葉試料を照射する。スペクトル放射計をオンにしながら、葉の反射率を監視します。光合成反応が安定した状態になるまで少なくとも20分待ちます。この反応期間中、飽和パルスは1分間隔で供給されます。定常状態の蛍光強度はFsと呼ばれ、20分間のパルス光の後に達成される最大の蛍光値はFm素数と呼ばれます。この時点でスペクトル反射率を記録します。定常状態での光合成活性を計算するために、光の下で飽和パルスを照射することで推定できるフォトシステム2の量子収率を算出する。フォト系2つの反応中心から直線電子流束を推定する。次に、非光化学消光を計算し、531および570ナノメートルから光化学反射率指数を計算する。Fsとリーフ反射率を取得した後、行動光をオフにし、暗いリラクゼーション中に1分間隔で飽和パルスを提供します。暗闇下の飽和パルスによって誘導される最大の蛍光値をFmダブル素数と呼ぶ。そして、2と10分で、2と10分で、Fmダブルプライムデータを保存します。緩和結合体からの非光化学的消光のパラメータを計算するには、2分間の暗い適応FmダブルプライムデータでqEを推定する。10分の暗黒適応Fmダブルプライムデータで、ザントキシラム依存クエンチング、qZを計算します。次に、写真抑制状態を計算する。次の測定として、1秒当たり60マイクロモル光子で数光をオンにし、同じ測定を繰り返します。本代表的実験では、野生型と変異型シロイヌナズナシス植物を比較した。光化学反射率指数の変化を、葉の反射率から算出したPRIは、PAMフルオロメーターによって推定される光系2からの光依存性の線形電子流量に対してプロットした。本実験では、PRIの変化は、野生型植物の線形電子流量と負の相関を持ち、変異型植物では相関しなかった。キサントフィルサイクルを表すqZは、非光化学消光の暗い緩和コネクティックから分画され、PRIの変化に対してもプロットされた。この分析では、qZは両方の植物株のPRIの変化と強く相関しており、PRIはキサントフィルサイクルを反映していることを示唆した。同じ光源または強度を用いて同じリーフ領域を同時に測定するためには、固定装置内で同じ検出ファイバを使用して、葉を垂直に配置する。反射率分光法は、植物分子機構を解明するために野生型および変異植物において様々な表現型の分析に使用される可能性を有する。

evaluation-photosynthetic-behaviors-simultaneous-measurements-leaf

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

この手順の目標は、微細藻類のスクリーニングにマイクロタイタープレートフォーマットを使用することの再現性と適応性を実証することです。この迅速なスクリーニングは、WATER-Pulse-Amplitude-Modulated(WATER-PAM)蛍光測定を組み合わせて、少量の細菌-藻類共培養によるPhotosystem...

水 - パルス振幅変調（WATER-PAM）蛍光測定を用いて細菌/植物プランクトンの共培養を評価するために小音量バイオアッセイ

RGB とハイパー スペクトル イメージング植物根系の生育する土壌の評価の実験的プロトコルが表示されます。ケモメトリック ハイパー スペクトル情報かシリーズ スキャン RGB...

RGB とスペクトルのルート画像植物表現型解析および生理学的研究: 実験概要およびイメージ投射プロトコル

ここでは、再現可能な方法で植物成長挙動と特に表現を勉強するためのプロトコルを提案する.変数と同じ時間安定した光の条件で提供する方法を示します。適切な分析は、十分なサンプル数と有効な統計的評価によって異なります。...

異なる光質におけるシロイヌナズナ成長挙動の解析

このプロトコルは、ロダミンベースの蛍光プローブとリグニンポリマー間のフェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)を厚い植物切片で直接評価するために、スペクトルと蛍光寿命の測定値を組み合わせたオリジナルのセットアップについて説明します。...

ネイティブ自己蛍光に基づくsFLIMによる植物切片における蛍光プローブとリグニン間の相互作用の測定

高速繰り返し速度蛍光光度計(FRRf)は、光システムII光生理学および一次生産性を測定するための有益な方法である。ここでは、キュベット型FRRfを用いて基質動物プランクトン上のエピゾイ藻類、 コラシウム...

キュベット型高速繰り返し速度蛍光光度計による コラシウム 属の付着ステージの光生理機能の測定

このプロトコルは、パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定法による非光化学的消光の緩和を測定するためのハイスループット法を導入する。この方法は、野外で栽培された グリシンマックス...

パルス振幅変調クロロフィル蛍光測定を用いた作物の非光化学的急冷のハイスループット分析

クロロフィル蛍光を用いて低CO2 処理後の植物の光合成効率の変化を測定する手法について述べる。...

クロロフィル蛍光解析による光呼吸変異体の光合成効率評価

本プロトコルは、スペクトル分析に基づく紅藻におけるフィコビリタンパク質変化の段階的な自己蛍光イメージングおよび評価を記載する。これは、希少な材料しか利用できず、実験室条件下で細胞がゆっくりと成長するか、まったく成長しない場合に、極端な生息地への細胞の適応を評価するためのラベルフリーで非破壊的な方法です。...

紅藻生理機能を評価するための自己蛍光イメージング

ここでは、 シロイヌナズ ナの苗木の脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成モニタリング用に設計された高度なツールについて説明します。この新しい方法論は、高い空間分解能と時間分解能で非侵襲的なリアルタイムクロロフィル蛍光イメージングを提供します。...

シロイヌナズナ脱etiolationの初期段階におけるクロロフィル生合成速度測定のための非侵襲的アッセイ

本論文は、光システムIIの量子効率、スペクトル反射率、植物構造の自律的フィールド測定のための非破壊的かつ高スループットのアプローチを記述し、農学および育種のフィールド試験における大規模な樹冠光合成表現型解析を可能にします。...

自律ロボットを用いた作物植物の光合成効率の現場での高スループットスクリーニング

学ぶ 葉反射率とクロロフィル蛍光の同時測定法。Arabidopsisを用いて光合成挙動をリアルタイムで評価し、新規反射率パラメータの確立と植物生理応答の理解を深める手法です。

葉反射率とクロロフィル蛍光解析の同時測定による光合成挙動の評価

さらに動画を探す