自動ワークステーションを用いた質量分析のためのプラズマサンプル調製
2020年4月24日
ここでは、質量分析ベースの定量プロテオミクス解析のための自動化された血漿タンパク質消化法を紹介する。このプロトコルでは、タンパク質変性、還元、アルキル化、トリプシン消化反応のための液体の移動およびインキュベーションステップが合理化され、自動化されています。所望の精密の96の井戸版を準備するのにおよそ5時間かかる。
この自動化されたワークフローは、再現性とスループットに優れた一貫したタンパク質酵素消化を提供します。これにより、質量分析によるバイオマーカー発見、検証、臨床応用の精度と信頼性が向上します。この技術の利点は、大多数のタンパク質に対して20%未満のアッセイおよび相互アッセイCVを使用して、約5時間で96個のサンプルのワークフロー全体を完了できることです。
この正確な高スループットサンプル調製により、組織や生体液の疾患プロテオームを大規模に調査することができます。さらに、自動化されたプロテオームサンプル調製ワークフローは、高含量および定量プロテオミクス分析のための強固な基盤を提供します。この手順のデモンストレーションは、シダーシナイのハイスループットセンター所長の秦福博士と、私の研究室の研究員であるケイシー・ジョンソン氏です。
分析を開始する前に、プールされた健康なヒトプラズマの5マイクロリットルを96ラウンドの深いウェルプロピレンプレートに加えます。すべてのサンプルがロードされたら、液体ハンドラデバイスソフトウェアを開き、メソッドタブで、すべての軸を選択して、自動液体ハンドラを向けます。すべてのワークステーションのシリンジに可視の気泡が含まれていないことを確認し、新しい方法を開き、[実行]をクリックしてメソッドを開始します。
オートサンプラーのプロンプトに使用する値を入力して、メソッドの最後にオートサンプラープレートを準備し、[OK]をクリックします。最初の列に使用する値を入力し、[OK]をクリックします。最後の列プロンプトに使用する値を入力して、「OK」をクリックします。サンプルプレートを少なくとも 20 マイクロリットルのサンプルボリュームで使用する場合は、サンプルプレートに使用する値を入力するプロンプトに true と入力し、「OK」をクリックします。ガイド付き Labware セットアップ ウィンドウの指示に従い、[続行] をクリックします。適切な試薬を適切なウェルにロードし、[次へ]をクリックします。試薬、反応、サンプル、オートサンプラープレート、6ウェル90マイクロリットルチップボックス、空の90マイクロリットルチップボックス、フル230マイクロリットルチップボックスを含む図示に示すように、再び[Next]をクリックして、自動化された液体ハンドラデッキをレイアウトします。
次に、[完了] をクリックしてメソッドを開始します。遠心分離後の継続時に、反応板を取り出し、遠心分離機に入れる。遠心分離の最後に、自動液体ハンドラ内の位置に反応プレートを戻し、[続行]をクリックします。
液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析では、C18 2.1 x 100ミリメートル3.5マイクロメートルカラムのペプチドを、毎分250マイクロリットルの流量を有する高圧液体クロマトグラフィーで、3倍極数質量分析計で一列に解析します。ローディングの5分後、5%バッファーB溶液でカラムを平衡化し、30分間にわたってリニアな5〜35%の緩衝剤Bでペプチドを溶出させる。溶出の終わりに、98%のバッファーBでカラムを10分間洗い、次のサンプルをロードする前に5%バッファBで5分間洗浄します。
オンライン転用の場合、2相切替弁を使用して、後列溶離液をイオン源に入る前に無駄にします。すべてのサンプルが溶出すると、複数の反応モニタリングデータを処理できます。この代表的な分析では、3つのβ-galペプチドおよび2つのアルブミンペプチドを、スパイクされたβ-galおよび処理された血漿アルブミンタンパク質から監視した。
自動サンプル調製ワークフローの精度は、選択した全プロテオミクス反応モニタリングワークフローの分散係数から、液体クロマトグラフィータンデム質量分析の分散係数の割合を差し引いた値として計算した。予想通り、ヒト血清アルブミンおよびβ-galタンパク質の両方に対して良好なシグナル強度が観察された。液体転写ステップの精度を監視するために、独立した試薬の移送ステップで内因性ヒト血清アルブミンおよび外因性β-galタンパク質に対して安定同位体標識ペプチド標準をスパイクすることができる。
自動化されたプロテオームサンプル調製ワークフローを検証するために、同じ日に調製された21のウェルから、1日中の分散係数値を計算した。40個のタンパク質の平均日中分散係数は4~20%の範囲で、プレートベースの自動化ワークフローのエッジ効果を評価するために、分散係数パーセントは、指定された列および行内の特定のウェルから計算することができます。この代表的な実験では、複数の反応監視信号強度は、3-22%の範囲の分散係数パーセントを持つ列と行のすべての構成で類似していた最も重要なステップは、所望の96ウェルプレートマップに従ってサンプルを正しく追加し、ソフトウェアの指示に従って試薬プレートを正しく設定することです。
この自動化されたプロテオームサンプル調製法により、研究者は信頼性の高い定量的プロテオミクスデータを大規模に収集することができます。
概要
本記事では、質量分析ベースの定量的プロテオミクス解析向けに設計された、自動化プラズマタンパク質消化法を紹介します。この合理化されたワークフローにより、約5時間で96検体の調製が可能となり、再現性とスループットが向上します。
研究の主要構成要素
科学分野
- プロテオミクス
- 質量分析
- バイオマーカー探索
背景
- 自動化されたワークフローにより、プロテオミクス研究における精度と信頼性が向上します。
- 大規模な調査には、ハイスループットな試料調製が不可欠です。
- 定量分析には、一貫した酵素消化が極めて重要です。
- 信頼性の高い結果を得るためには、アッセイ内およびアッセイ間のばらつきを最小限に抑える必要があります。
研究の目的
- 再現性を向上させたタンパク質消化の自動化手法を開発すること。
- 疾患プロテオームの高スループット解析を促進すること。
- 定量的プロテオーム解析の基盤を提供すること。
使用された手法
- サンプル調製用の自動液体分注装置。
- 分析用の液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法。
- 精度モニタリングのための安定同位体標識ペプチド標準物質の使用。
- ワークフローの精度を評価するための変動係数の算出。
主な結果
- ほとんどのタンパク質において、アッセイ内およびアッセイ間のCVは20%未満であった。
- 40種類のタンパク質における1日あたりの平均CVは4-20%の範囲であった。
- エッジエフェクト解析の結果、プレート構成全体で一貫したシグナル強度であることが示された。
- 大規模かつ信頼性の高い定量データの収集が達成された。
結論
- 自動化された手法により、プロテオーム解析の効率が大幅に向上します。
- これにより、研究者は高い信頼性をもって大規模な研究を実施することが可能になります。
- 最適な結果を得るためには、適切なセットアップとサンプルのロードが極めて重要です。
よくある質問
産業界における重要性
質量分析のための血漿サンプルの自動調製は、バイオマーカーの探索および検証における、ハイスループットで再現性のあるプロテオミクスワークフローというバイオ製薬業界のニーズに応えるものです。変動を抑え、96検体の酵素消化を5時間で一貫して行うことで、本手法は信頼性の高い統計的比較と大規模な疾患プロテオーム解析を可能にします。これにより、本ワークフローは、初期探索およびトランスレーショナルリサーチにおける定量プロテオミクスのためのスケーラブルな基盤となります。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 精密なタンパク質消化とペプチド生成により、後続の質量分析のための仮説検証を可能にする。
- 運用上の価値： 手動の液体移送ステップを9回から6回に削減し、ワークフローの効率を向上させ、操作者によるばらつきを低減する。
- 予測の信頼性： ほとんどのタンパク質においてアッセイ内およびアッセイ間CVを20%未満に抑え、信頼性の高い定量化と実験間のデータの比較可能性をサポートする。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 選択的チップピペッティングが可能な96チャンネルピペッティングヘッドを使用し、ピペッティング時間の短縮とスループットの向上を実現します。
- 再現性： システムを完全に密閉することで温度および環境制御を向上させ、コンタミネーションのリスクを低減し、アッセイの整合性を高めます。
- 品質管理： 安定同位体標識ペプチドとβ-ガラクトシダーゼタンパク質を内部標準として導入し、プロセス全体を通じて精度を監視し、ワークフローのパフォーマンスを検証します。
翻訳・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：組織または生物学的流体における疾患プロテオームの大規模な調査をサポートし、定量的な厳密さを伴うバイオマーカーの探索を可能にします。
- 前臨床モデルとの整合性：疾患に関連する系において、メカニズムの理解やターゲットの検証に寄与する信頼性の高いプロテオミクスデータを生成します。
- リスク調整済みの進展：技術的なばらつきを最小限に抑え、一貫したデータ品質を提供することで、前臨床開発におけるgo/no-go決定をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
この自動化ワークフローは、サンプル調製からデータ解析に至るディスカバリー・コンティニュアムに組み込まれており、ターゲット選定やリード最適化の取り組みに寄与する再現性の高いプロテオミクスプロファイリングを可能にします。
- 探索生物学：一貫性のあるペプチド混合物を生成することで、正確なタンパク質の同定および定量に基づいた、仮説駆動型のプロテオミクス解析を促進します。
- スクリーニング：LC-MS/MS解析に向けた生物学的サンプルのハイスループットな調製を可能にし、拡張性のあるスクリーニングキャンペーンを支援します。
- 分析：変動係数の低い定量的なペプチド測定を実現し、異なる条件下におけるタンパク質発現の精密な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：再現性のあるサンプル処理を通じて、臨床サンプルにおけるバイオマーカー候補の検証のための基盤を提供します。
- 組織的な再利用：標準化され自動化可能なプラットフォームを構築し、プロジェクトやチームを越えて一貫したプロテオミクスワークフローとして再利用することを可能にします。
運用および企業への影響
- 科学的価値：分析前変動を最小限に抑えることで、タンパク質定量における予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値：実作業時間の短縮とサンプル処理能力の向上により、研究室の効率を高める。
- 戦略的価値：信頼性と再現性のあるプロテオミクスデータを提供することで、ターゲットバリデーションにおける意思決定を強化する。
- ポートフォリオへの影響：サンプルセット全体で一貫したデータ品質を維持することで、リスク調整に基づいたバイオマーカーの優先順位付けをサポートする。
実施上の考慮事項
- 自動液体ハンドリングおよび質量分析ベースのプロテオミクスの専門知識が必要です。
- 温度制御およびエンクロージャー機能を備えた互換性のある自動ワークステーションへのアクセスに依存します。
- ソフトウェア誘導プロトコルに従った、標準化された試薬調製およびプレートセットアップを必要とします。
- 適切なサンプルロード、遠心分離の統合、およびメソッドの開始に関するトレーニングが含まれます。
- 精密なモニタリングと品質管理のために、安定同位体標識ペプチドの使用に依存します。
