Name: 分化HepaRG細胞における大胞性脂肪症の誘導と特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぼう、分化HepaRG細胞における大胞性脂肪症の誘導法と脂質蓄積の検出・定量法。オレイン酸ナトリウムを用いたこのin vitroモデルは、肝臓代謝と関連疾患の研究に有用なツールを提供する。

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私たちは、HepaRG細胞を親切に提供してくれたクリスチャン・トレポ教授(INSERM U871、フランス、リヨン)に感謝します。私たちは、行政支援のためにリタ・アポディアに感謝しています。この研究は、MIUR-大臣デル・イストルツィオーネ、デルユニバーシタ・エ・デッラ・ライスカ(FIRB 2011-2016 RBAP10XKNC)、ローマのサピエンツァ大学(プロト)によってサポートされました。C26A13T8PS;Prot。C26A142MCH;Prot。C26A15LSXL)。

1. 培養培養剤・試薬の調製
<ol><li>増殖培地:グルタマックス、10%の胎児ウシ血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、5 μg/mLインスリンおよび0.5 μMヒドロコルチゾン半球シミネチン酸を含むウィリアムのE培地を補う。</li>
	<li>分化媒体:グルタマックス、10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、5μg/mLインスリン、50 μMヒドロコルチゾン半球シクチン酸塩および2%DMSOを含むウィリアムのE培地を補う。</li>
	<li>凍結培地:10%DMSOで増殖培地を補合する。</li>
	<li>オレイン酸ナトリウム:100mM濃度で99%メタノールに溶解し、O/Nをかき混ぜ、-20°Cで保存する。</li>
	<li>オイルレッドO:ストックソリューションを準備します。オイルレッドOの0.35gの重量を量り、イソプロパノールの100 mLで溶解します。O/N、フィルター(0.2 μm)をかき混ぜ、RTで保存する作業溶液を準備する:dH2 Oの4 mLとオイルレッドOストック溶液の6 mLを混ぜます。室温(RT)に20分間座り、0.2μmフィルターで濾過します。適切なろ過は、背景を避けるために正常な染色のために強くお勧めします。</li>
	<li>ボディピー(505/515):100μMのストック濃度でDMSOでボディピー(505/515)染料を溶解し、暗い暗い中で-20°Cで保存し、最終的な100nM濃度で使用します。</li>
	<li>CARS実験用の透明なガラス底料理を取得します。</li>
</ol>2. HepaRG細胞の解凍、増幅、凍結保存
<ol><li>窒素凍結保存HepaRG細胞を解凍するまで37°C浴に浸漬して解凍する。低パッセージ バッチ (<20) を選択します。HepaRG細胞は市販されている。</li>
	<li>細胞を10mLの増殖培地と遠心分離機を含む15mLチューブに5分間(200 x g、4°C)で迅速に移入します。</li>
	<li>上清を廃棄し、増殖培地の5mLで細胞を再懸濁する。</li>
	<li>細胞を数え、2.5 x 104セル/cm2をプレートするために希釈します。</li>
	<li>2 日または 3 日ごとにメディアを更新します。細胞は約24時間の倍増時間で増殖する。</li>
	<li>トリプシン溶液0.05%で3〜5分インキュベーションにより80%合流時にHepaRG細胞を剥離する。増殖培地と遠心分離機で細胞を5分間集めます(200 x g、4°C)。</li>
	<li>上清を廃棄し、増殖培地の5mLで細胞を再懸濁する。</li>
	<li>細胞を数え、2.5 x 104セル/cm2をプレートするために希釈します。</li>
	<li>この段階では、ステップ2.5〜2.8を繰り返して細胞を増幅し、適切な数の細胞に到達して実験を開始するか、ステップ2.10のように凍結保存する。</li>
	<li>肝保存HepaRG細胞を凍結保存するには、トリプシン溶液0.05%で3-5分インキュベーションによりめっき後24時間細胞を剥離する。増殖培地と遠心分離機で細胞を5分間集めます(200 x g、4°C)。上清を廃棄し、凍結培地の1mL/バッチ、1.5 x 106細胞/バッチで細胞を再懸濁し、液体窒素中のバッチを凍結保存する。</li>
</ol>3. HepaRG細胞の分化(0~21日目) (図1A)
<ol><li>0日目。低密度(2.5 x 104細胞/cm2)の種子HepaRG細胞を、適切な増殖培地を用いた培養処理食(図1B)を用いた。2つの皿は、各アッセイ(オイルレッドO染色、FACS分析、qPCR):コントロール細胞用とオレイン酸処理細胞用の1つ)にメッキする必要があります。CARS測定を行う場合(ステップ8)、透明なガラス底の皿に並列に細胞を播種する。対照として、未処理の皿を1つ収穫し(増殖細胞0日目)、分化マーカー遺伝子の遺伝子発現解析を行う(ステップ3.6参照)。</li>
	<li>2日目と4日目。適切な増殖培地で培地を変更し、合流するまで細胞を増殖させる。</li>
	<li>7日目。セルは 100% コンフルエントでなければなりません (図 1C)。1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で細胞を一度洗います。1x PBSを取り外し、分化媒体の適切なボリュームを追加します。</li>
	<li>8日目、9日目、12日目、15日目、18日目。 1x PBSで細胞を1回洗います。1x PBSを取り外し、分化媒体の適切なボリュームを追加します。</li>
	<li>21日目。顕微鏡下でHepaRG細胞を観察し、細胞が結合分化培養物であることを確認する(図1D)。</li>
	<li>対照として、分化マーカー遺伝子の遺伝子発現解析(ステップ7)を行う1つの対照皿(分化細胞21日目)を収穫する(図1E)。</li>
	<li>21日目に、分化したHepaRG細胞を液体窒素中で凍結保存することができる。</li>
</ol>4. ベシキュラー脂肪症の誘導(21日目~26日目)
<ol><li>21日目。250 μM(1:400)の最終濃度に完全な分化媒体の適切な容積を有するオレイン酸ナトリウム(100 mM)を希釈する。99%メタノール1:400(オレイン酸ナトリウムと同じ体積)を分化媒体の別のアリコートに加え、車両制御処理を行います。(例えば:オレイン酸ナトリウムの25 μLを培地の10mLに加え、平行に25 μLの99%メタノールを10mLの培地に加える)。1x PBSで細胞を1回洗浄し、車両またはオレイン酸ナトリウム培地を追加します。</li>
	<li>23日目と25日目。ステップ 4.1 のように、作成した培地の適切な体積で培地を変更します。</li>
	<li>26日目。オレイン酸ナトリウム処理細胞に脂質液滴が蓄積し、図2Aのように細胞質中の半透明の液滴として容易に見える光学顕微鏡で観察する。</li>
</ol>5. 脂質過負荷と脂肪症誘導の評価:オイルレッドO染色
<ol><li>1x PBSで一度細胞を洗浄し、1x PBSを完全に除去します。</li>
	<li>4%のパラホルムアルデヒド(1x PBSで希釈)を加え、RTで15分間インキュベートします。 注意:パラホルムアルデヒドは有毒なので、このステップは、手袋、ラボコート、マスクなどの保護具を備えたヒュームフードで行う必要があります。</li>
	<li>パラホルムアルデヒドを除去し、1x PBSで細胞を2回洗浄します。細胞は、染色前に数日間4°Cで1x PBSに保つことができます。パラフィルムで包み、アルミホイルで覆い、細胞の乾燥を防ぎます。</li>
	<li>1x PBS を削除します。RTで5分間60%イソプロパノールで細胞をインキュベートします。</li>
	<li>イソプロパノールを取り除き、細胞をRTで完全に乾燥させます。</li>
	<li>オイルレッドO作動液を追加し、30分間RTでインキュベートします。各サンプルに必要な作業解の量は、細胞の培養に使用される培養量に対応します。</li>
	<li>オイルレッドO溶液を取り出し、すぐにddH2Oを加え、ddH2Oで細胞を4回洗浄する。</li>
	<li>分析のために顕微鏡下で画像を取得する(図2B)。</li>
	<li>油赤いO染料を溶出させる:すべての水を除去し、乾燥させるための。100%イソプロパノールの1mLを追加し、RTで穏やかな振りながら10分間インキュベートします。</li>
	<li>イソプロパノールを繰り出し、オイルレッドO染料を数回上下に繰り出し、すべてのオイルレッドOが溶液中であることを確認します。溶液をキュベットに移します。分光光測定でOD500nmを測定し、100%イソプロパノールをブランクとして使用する(図2C)。</li>
</ol>6. 脂質過負荷と脂肪症誘導の評価:ボディピー染色と細胞フルオロメーション分析
<ol><li>1x PBSで細胞を1回洗います。37°Cで40分間暗闇の中で1x PBSで希釈したボディピーの100 nMでインキュベートします。染色されていないコントロールは、フローサイトメトリー測定に含める必要があります。この時点から、可能な限り光からサンプルを保護します。 注:各サンプルに必要な染色溶液の量は、細胞の培養に使用される培養物の量に対応します。</li>
	<li>染色液を除去し、1x PBSで細胞を一度洗浄します。手順 6.3-6.6 に進みます。FACS(蛍光活性化細胞選別)分析または顕微鏡イメージング用ステップ6.7用。</li>
	<li>1x PBSで細胞をそっと削り、15mLチューブに移します。遠心分離機 10 分 (200 x g, 4 °C)</li>
	<li>ペレットを乱さずに上清をそっと取り除き、1x PBSの3mLで洗浄します。遠心分離機 5分(200 x g、4 °C)。</li>
	<li>上清を取り出し、1x PBSの300 μLで再中断し、FACSチューブに移します。</li>
	<li>505/515 nmの励起/発光波長を用いてサイトフルオロメシス分析によりボディピの蛍光強度を直ちに測定する(図3A,B)。</li>
	<li>1x PBSで細胞を1回洗浄し、完全にPBSを除去します。</li>
	<li>4%のパラホルムアルデヒド(1x PBSで希釈)を加え、RTで15分間インキュベートします。 注意:パラホルムアルデヒドは有毒なので、このステップは、手袋、ラボコート、マスクなどの保護具を備えたヒュームフードで行う必要があります。</li>
	<li>パラホルムアルデヒドを除去し、PBSで5分間サンプルを3倍洗います。細胞は4°Cで1x PBSに保つことができるか、またはすぐに画像化することができる(図3C)。貯蔵のために、パラフィルムで包み、細胞が乾燥するのを防ぐためにアルミ箔で覆う。</li>
</ol>7. 脂質過負荷および脂肪症誘導の評価:qPCR
<ol><li>1x PBSで細胞を1回洗います。1x PBSで細胞を掻き取り、遠心分離機を200x gで削り、上清を捨てます。この工程では、細胞を-80°Cで回収するか、ステップ7.2のように処理することができる。</li>
	<li>メーカーの指示に従って市販の試薬を使用して、標準的な方法で全RNA単離を行います。</li>
	<li>UV分光光測定によるRNA濃度を評価し、A260/A280の読み取りに基づいてRNA純度が高い(2.0に近い)ことを確認します。</li>
	<li>標準的なcDNA合成キットを使用して、総RNAの1 μgからcDNAを合成します。</li>
	<li>CDNAをH2 Oで最終的な50μL体積に希釈します。</li>
	<li>qPCRによって三重に各cDNAサンプルを分析する:コントロールとして3つのハウスキーピング遺伝子に特異的なプライマーを含む各プライマーに必要な反応に十分な1つのqPCRマスターミックス(表1)を準備する:グリセラルデイド-3-fosfatoデイドロゲナシ(GAPDH)、アクチンBおよびリボソーム18S(プライマー配列については材料表を参照)</li>
	<li>PCRマルチウォールプレートにウェルあたり18 μLのマスターミックスを分配します。</li>
	<li>各ウェルに2μLのcDNAサンプルを加えます。プレートをシールします。</li>
	<li>サーマルサイクラーの指示に従ってサンプルを実行します。</li>
</ol>8. 脂質過負荷および脂肪症誘導の評価: CARS
<ol><li>手順 5.1- 5.3 で説明されているように、以前にガラス底の皿に調製したセルを修正します。</li>
	<li>市販の調整可能なピコ秒パルスレーザーシステムをオンにし、異なる波長の2つの出力を得るためにそれを調整します。出力間の周波数差は、メチレン対称ストレッチに対応する強烈なCARS光信号を生成するために2,840 cm-1でなければなりません。1,064 nm(「ストークス」光)の固定波長出力の場合、他の波長は817nm(「ポンプ」光)に調整する必要があります。</li>
	<li>817 nm 出力が空間的および一時的に 1,064 nm 出力と重なっていることを確認する:適切なダイクロイックミラー(すなわち、817 ~1,064 nmの間のカット)を使用して、光遅延線を使用して光遅延ラインを使用してレーザーの時間的な重なりを得るパルス。</li>
	<li>2つのコプロパゲーションビームが両方コリメートされ、その直径がサンプルに焦点を当てる顕微鏡内の光学系に適した同様の値を持っていることを確認します。必要に応じて、それらを組み合わせたダイクロイックミラーの前にビームを別々にコリメートします。</li>
	<li>赤外線レーザー走査ユニットとデュアルチャンネルの赤/緑エピ検出ユニットを含む必要がある市販の反転顕微鏡システムをオンにし、コプロパシングレーザービームを走査ユニットに合わせます。</li>
	<li>デュアルチャネルエピ検出ユニットを開き、フィルタキューブを取り外し、赤波長検出フィルタをバンドパスフィルタに置き換え、817/1,064 nmポンプ/ストークス励起の663 nmを中心とした2,840 cm-1 CARS信号を選択できます。スキーム。狭帯域(20 nm)フィルタは、高レベルの蛍光バックグラウンド信号の収集を避けるために好ましい。</li>
	<li>反転CARS顕微鏡のステージに皿を置き、100倍の油浸目的を使用して、目的の垂直位置をシフトして細胞に焦点を合わせます。</li>
	<li>顕微鏡ソフトウェアをセットアップして、127 μm x 127 μm の視野で高解像度(1024 x 1024 ピクセル)の画像を収集します。</li>
	<li>顕微鏡ソフトウェアを設定して、127 μm x 127 μm の画写界の画像を継続的に取得して表示し、画像収集パラメータを最適化しながら表示された画像を確認します。レーザーパワーが迅速な画像収集と最小限の損傷のためにバランスを取っていることを確認し、必要に応じてビームパスに適切な中性密度フィルタを挿入し、良好な信号ツーノイズの画像の収集を可能にするピクセルのドウェル時間を選択します。選択されたレーザーの力条件の下の比率。</li>
	<li>最適化された条件の下で皿内のいくつかの異なる視野の画像を取得し、保存します。必要に応じて、緑色波長放出によって生成されるマルチフォトン蛍光画像(主に817nmの2光子励起から)、他のエピ検出器を介して同時に収集してもよい。各料理に対して8.7-8.10の手順を繰り返します。</li>
	<li>CARS 画像解析では、ImageJ の FIJI 実装を使用してイメージを処理します。詳細を失うことなく信号対雑音比を向上させるために、さらに分析する前に、各画像にデスペックル関数(または同様のデノレーションツール)を操作します。</li>
	<li>FIJIを使用して手動で細胞を選択し、セグメント化された個々の細胞内の脂質液滴を自動的にカウントして、各セルの脂質液滴領域と数値、および各皿の画像データセット全体に関する統計を生成します。</li>
</ol>9. MTT細胞生存率アッセイ
<ol><li>プレートは、分化培養培地の最終100μL体積において1x105細胞/ウェルの密度を持つ96ウェルプレートにHepaRG細胞を分化した。</li>
	<li>播種後24時間、99%メタノール(車両)で細胞を処理し、100μM、250μMおよび500 μMのオレイン酸ナトリウムおよびパルミ酸ナトリウムを100μLの分化培地/ウェルで三重に希釈した。</li>
	<li>99%メタノールで培地を変更し、100 μM、250 μM、500 μMのオレイン酸ナトリウムとパルミテートナトリウムを100μLの分化培地/ウェル毎に24時間ごとに希釈します。</li>
	<li>メタノール/オレイン酸ナトリウム/パルミテートナトリウム処理後96時間、分化培地/ウェルの分化培地/ウェルを100μLで希釈した2μMドキソルビシンで細胞を対照として処理する。</li>
	<li>ドキソルブウシン処理後18時間、分化培養培地の100μLで培地を変化する。</li>
	<li>3-(4,5-ジメチルチアゾル-2-yl)-5-(3-カルボキシキホキフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム試薬MTT(材料表)のピペ20μLを100μL培地中の細胞を含有する96ウェルブリュゼウプレートの各ウェルに.トリプリケート中の分化培養培地の100μLの細胞なしでコントロールに20 μLの試薬をピペッティングすることにより、バックグラウンドコントロールを含めます。</li>
	<li>加湿、5%CO2雰囲気で37°Cでプレートをインキュベートします。</li>
	<li>MTTテトラゾリウム試薬で30、60、90分間インキュベートした後、96ウェルプレートリーダーを使用して490nmで吸光度を記録します。他のサンプルの吸光度値から、無細胞制御ウェルのバックグラウンド吸光度を減算します。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

このプロトコルは、HepaRG細胞を区別する方法と、オレイン酸ナトリウム処理による小胞性脂肪症を誘導する方法について説明する(図1A)。実際、他のヒト肝細胞癌(HCC)細胞株と比較して、HepaRG細胞株は成人ヒト肝細胞の特徴を示し、一次ヒト肝細胞を培養したex vivoに代わる貴重な代替手段を表す13,14 、15.HepaRG細胞株は、肝臓細胞毒性研究、薬物代謝、およびウイルス学研究15、16、22に広く使用されている。
HepaRG細胞と比較して、HepG2、HUH7、HUH6およびHep3Bのような他のHCC細胞...

肝脂肪症は、肝臓体重の少なくとも5%のトリグリセリド含有脂脂脂滴内の肝内脂肪蓄積として定義される。長期の肝脂質貯蔵は、潜在的に可逆的なプロセスであるが、それは肝臓代謝機能障害、炎症および非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)の高度な形態、多くの部分で慢性肝疾患の主な原因を引き起こす可能性がある世界1、2.NAFLDは、より積極的な非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)に進化する多因子性疾患であり、肝硬変に進行し、患者のごく一部では肝細胞癌(HCC)1、3に進行する可能性がある。NAFLDの特定の治療法として承認された治療法は現在利用でき、食事とライフスタイルの変更の組み合わせは、NAFLDおよびNASH管理4、5、6の柱のままです。
NAFLDの病因における肝性テアトーシスの発症につながる分子機構は、依然として解明されるべきである7.この文脈において、ヒトのステアトーシス病の進行を研究するためにマウスモデルが開発された。無数の異なるモデルが存在し、それぞれが異なるアプローチを組み合わせた遺伝的、栄養的および化学的に誘導されたモデルを含む、その長所と短所を持っています。遺伝子組み換え(トランスジェニックまたはノックアウト)マウスは、自発的に肝疾患を発症する。しかしながら、これらの変異はヒトでは非常にまれであり、単一遺伝子の欠失または過剰発現(例えば、ob/obマウス)は、分子レベル8、9における多因子ヒト疾患の病因を模倣しないかもしれないことに留意されたい。同様に、食事または薬理学的操作後にマウスによって獲得された疾患は、ヒト8におけるNAFLDの発症に関連するヒト食の影響を模倣しないかもしれない。しかし、動物モデルは、NAFLDの理解の開発を容易にしており、このアプローチは現在、実験室研究で最も頻繁に使用される戦略です。それにもかかわらず、動物モデルで得られた結果のヒトにおける複製は繰り返し失敗し、診療所10への翻訳が不十分である。
従って、NAFLDのインビトロモデルは、NAFLD進行の分子機構を解明する上で基本的な役割を果たし、多数の化合物をスクリーニングする貴重なツールを表す。一次細胞培養、不死細胞株および肝生検は、研究目的11のために広く使用されている。原発性ヒト肝細胞はヒトの臨床状態によく似ていますが、ドナーの数は限られており、一次細胞培養は細胞の変動性に起因する再現性が低い。これらの観察は、倫理的およびロジスティックな問題と共に、ヒト原発性肝細胞の使用が12に制限される結果となった。したがって、肝細胞株は、肝細胞株が着実に成長し、ほぼ無制限の寿命を有し、安定した表現型を有するので、一次培養に対するいくつかの本質的な利点を有する便利な代替手段を表す。さらに、細胞株は容易にアクセス可能であり、肝細胞株の培養条件は原発肝細胞の培養条件よりも単純であり、異なる実験室間で標準化されている。
ここでは、脂肪酸オレイン酸オレイン酸で処理した肝分化HepaRG細胞に代表される肝小胞性脂肪症のインビトロ細胞ベースモデルを詳細に説明する。HepaRG細胞株は、C型肝炎感染の影響を受けた女性患者およびエドモンドソングレードIよく分化した肝腫瘍14から確立された。HepaRG細胞株は、2%ジメチルスルホキシド(DMSO)に曝露した際に、胆汁様および肝細胞様細胞の2つの異なる細胞型に対して分化することができるヒトの二分性前駆細胞株である。分化HepaRG細胞(dHepaRG)は、成人肝細胞といくつかの特徴と特性を共有し、アルブミン、アルドラセB、シトクロムP450 2E1(CYP2E1)、およびシトクロムP450 3A4(CYP3A4)13などの肝臓特異的遺伝子を安定的に発現する能力を有する。(ステップ 3)を使用します。脂肪酸塩オレイン酸ナトリウム(250μM)を用いたdHepaRG細胞の治療は、細胞質脂質液滴の生成につながり、脂肪肝14、15、17、18()ステップ 4)。脂質液滴の蓄積は、オイルレッドO染色(ステップ5)、中性トリグリセリドおよび脂質赤オレンジを染色するリソクロム脂肪溶解色素によって容易に検出することができる。脂肪dHepaRGの脂質を効率的に定量するために、ここでは4,4-ジフルオロ-1,3,5,7-テトラメチル-4-ボラ-3a-3a-3a-4a-diaza-s-インダシン(Bodipy 505/515)(ステップ6)で染色した後の細胞フルオロ分析を例示します。細胞内脂質体に、脂質液滴19を標識するために使用されている。また、ここでは、dHepaRG細胞における複数の代謝遺伝子の定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)(ステップ7)によるテアトーシスの評価方法を示す。オレイン酸ナトリウム処理後の脂質液滴の蓄積をさらに特徴付け、定量化するために、一貫性のあるアンチストークス・ラマン散乱(CARS)顕微鏡検査(ステップ8)を行い、視覚化と定量化を可能にする革新的な技術を行いました。20、21を標識せずに脂質液滴。

<table><tbody><tr><td>ハイクロン ハイクローン胎児クローンII&nbsp;</td><td>GEヘルスケア</td><td>SH30066</td><td></td></tr><tr><td>ウィリアムGlutaMAXを使用したS E媒体&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>32551087</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>インスリン&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン ヘミスコハク酸</td><td>SIGMA</td><td>H2270</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, ジメチルスルホキシド</td><td>SIGMA</td><td>D2438&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>オレイン酸ナトリウム</td><td>SIGMA</td><td>O7501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>SIGMA</td><td>179337</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>SIGMA</td><td>278475</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY 505/515</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D3921</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>RNAse フリー DNAseI</td><td>Promega</td><td>M198A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底の皿</td><td>Willco Wells</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red solution</td><td>SIGMA</td><td>O625</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution</td><td>Promega&nbsp;</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>q-PCR オリゴ名</td><td>Sequence<></td><td></td><td></td>/</tr><tr><td>ACACB FOR</td><td>CAAGCCGATCACCAAGAGTAAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACACB REV</td><td>CCCTGAGTTATCAGAGGCTGG&BETA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>;-ACTIN FOR</td><td>GCACTCTTCCAGCCTTCCTC</td><td></td><td></td></tr>&<tr><td>BETA;-ACTIN REV</td><td>AGGTCTTTGCGGATGTCCAC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALBUMIN FOR</td><td>TGCTTGAATGTGCTGATGACAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALBUMIN REV</td><td>AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTCATC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALDOB FOR</td><td>GCATCTGTCAGCAGAATGGA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ALDOB REV</td><td>TAGACAGCAGCCAGGACCTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APOB FOR</td><td>CCTCCGTTTTGGTGGTAGAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APOB REV</td><td>&NBSP;CCTAAAAGCTGGGAAGCTGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APOC3 FOR</td><td>CTCAGCTTCATGCAGGGTTA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APOC3 REV</td><td>GGTGCTCCAGTAGTCTTTCAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPT1A</td><td>for TCCAAGAAATGTCGCACG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPT1A REV</td><td>GCCTCGTATGTGAGGCAAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CYP2E1 FOR</td><td>TTGAAGCCTCTCGTTGACCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CYP2E1 REV</td><td>CGTGGTGGGATACAGCCCAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CYP3A4 FOR</td><td>CTTCATCCAATGGACTGCATAAAT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CYP3A4 REV</td><td>TCCCAAGTATAACACTCTACACAGACAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH FOR</td><td>TGACAACTTTGGTATCGTGGAAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH REV</td><td>AGGGATGATGTTCTGGAGAGCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPAM FOR</td><td>TCTTTGGGTTTGCGGAATGTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GPAM REV</td><td>ATGCACATCTCGCTCTTGAATAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL6 FOR</td><td>CCTGAACCTTCCAAAGATGGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL6 REV</td><td>ACCTCAAACTCCAAAAGACCAGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDK4 FOR</td><td>ACAGACAGGAAACCCAAGCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDK4 REV</td><td>TGGAGGTGAGAAGGAACATACACG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLIN2 FOR</td><td>TTGCAGTTGCCAATACCTATGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLIN2 REV</td><td>CCAGTCACAGTAGTCGTCACA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLIN4 FOR</td><td>AATGAGTTGGAGGGGGGGGGGGGGACATC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLIN4 REV</td><td>GGTCACCTAAACGAACGAAGTAGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD FOR</td><td>TCTAGCTCCTATACCACCACCA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCD REV</td><td>TCGTCCCAACTTATCTCCTCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SLC2A1 FOR</td><td>TGCTCATCAACCGCAACGAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SLC2A1REV</td><td>CCGACTCTCTTCCTTCATCTCCTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18S FOR</td><td>CGCCGCTAGAGGTGAAATTC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18S REV</td><td>TTGGCAAATGCTTTCGCTC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

分化heparg細胞における大胞性脂肪症の誘導と特徴付け

Inducing and Characterizing Vesicular Steatosis in Differentiated HepaRG Cells

肝脂肪症は、肝細胞におけるトリグリセリド含有脂脂脂小滴の蓄積から生じた代謝機能障害を表す。過剰な脂肪の蓄積は、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)につながり、潜在的に可逆的であり、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、最終的には肝硬変および肝細胞癌(HCC)に進化する可能性がある。肝細胞の脂質蓄積とNASHへの進行、不可逆的な肝臓損傷、線維症、肝硬変、さらにはHCCを結びつける分子機構は依然として不明である。この目的のために、いくつかのインビトロおよびインビボモデルは、NAFLDを引き起こす病理学的プロセスを解明するために開発された。本研究では、脂肪酸塩オレイン酸オレイン酸で処理したDMSO分化ヒト肝肝肝細胞細胞からなる肝小胞性脂肪症の誘導に関する細胞モデルについて述べた。実際、オレイン酸ナトリウム処理HepaRG細胞は細胞質中の脂質液滴を蓄積し、脂肪症の典型的な特徴を示す。このインビトロヒトモデルは、生体内マウスモデルならびに一次ヒト肝細胞に対する貴重な代替手段を表す。また、オイルレッドO染色、細胞フルオロメトリックボディピー測定、qPCRによる代謝遺伝子発現解析、コヒーレントアンチストークなど、HepaRG細胞における脂肪蓄積の定量と評価のためのいくつかの方法の比較も提示します。ラマン散乱(CARS)顕微鏡。CARSイメージングは、材料科学アプリケーションでよく知られている化学分析技術であるラマン分光法の化学的特異性と、高速かつ高解像度の非線形光学顕微鏡の利点を組み合わせることで、正確な精度を可能にします。脂質蓄積および脂質液滴ダイナミクスの定量化。小胞性脂肪症の誘導のための効率的なインビトロモデルの確立は、脂質蓄積の定量化および特性評価のための正確な方法と共に、NAFLDの早期診断の開発につながる可能性がある。分子マーカーの同定、および新しい治療戦略の生成に。

このプロトコルは、オレイン酸ナトリウム処理によるDMSO分化HepaRG細胞における小胞性脂肪症を誘導し、特徴付ける効率的な方法を説明する(図1A)。
HepaRG細胞の分化 分化を効率的に誘導するには、増殖細胞を低密度(2.5 x 104細胞/cm2)で増殖培地に播種する必要があります。低密度で播種すると、細胞は積極的に分裂し、細長い未分化形態を獲得する(図1B)。細胞は、100%の合流に達するまで、7日間増殖培地で増殖したままにしておくべきである(図1C)。2%DMSOに曝露した後、細胞は分化し始め、胆汁性上皮様細胞に囲まれた典型的な肝細胞様コロニーを形成する(図1</stro...

本研究では、脂肪酸塩オレイン酸オレイン酸を用いた分化HepaRG細胞における肝小胞性脂肪症を誘導するための詳細なプロトコルを説明し、一貫性のある抗ストークスを含む脂質蓄積の検出と定量のための方法を採用する。ラマン散乱(CARS)顕微鏡、細胞フルオロメトリクス分析、オイルレッドO染色、およびqPCR。

分化HepaRG細胞における大胞性脂肪症の誘導と特徴付け

Hepatic steatosis represents a metabolic dysfunction that results from an accumulation of triglyceride-containing lipid droplets in hepatocytes. Excessive ...

このプロトコルは、脂質蓄積の検出と定量のための方法と分化 HepaRG 細胞で肝臓の小胞性脂肪症を誘導する方法を記述します。.このインビトロヒト細胞モデルは、生体内マウスモデルおよび原発性ヒト肝細胞に代わる貴重な代替手段となる。脱霜するまで37度摂氏バスに浸漬することにより、HepaRG細胞の窒素凍結保存低通過バッチを解凍する。増殖培地の10ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブに急速に細胞を移す。5分間遠心した後、上清を捨て、増殖培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁する。細胞を数え、1平方センチメートルあたり250,000個の細胞をプレートするために希釈する。100ミリメートルの細胞培養皿に細胞をプレートし、2〜3日ごとに培地を更新します。細胞は約24時間の倍加時間で増殖する。HepaRG細胞が80%の合流度に達したら、0.05%トリプシン溶液で3〜5分間のインキュベーションを経て取り外します。増殖培地と遠心分離機で細胞を5分間収集します。上清を捨て、増殖培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁する。繰り返しますが、細胞を数え、1平方センチメートルあたり250,000個の細胞をプレートするために希釈する。この段階では、これらのステップを繰り返して細胞を増幅し、実験を開始する適切な数の細胞に到達する。HepaRG細胞を凍結保存するには、0.05%トリプシン溶液で3〜5分間のインキュベーションを通してめっきした24時間後に細胞を取り外します。増殖培地と遠心分離機で細胞を5分間収集します。上清を捨て、凍結培地の1バッチあたり1ミリリットルで細胞を再懸濁し、液体窒素中のバッチを凍結保存する。ゼロ日目に、HepaRG細胞を250,000平方センチメートルで播種し、適切な量の増殖培地を有する培養処理された料理に入る。2つの皿は、各アッセイのために、コントロール細胞用とオレエード処理細胞用に1つ、メッキする必要があります。2日目と4日目に、適切な量の増殖培地で培地を交換し、合流するまで細胞を増殖させます。7日目には、細胞は100%コンフルエントでなければなりません。1X PBSで細胞を1回洗います。その後、1X PBSを取り出し、適切な分化媒体のボリュームを追加します。8日目、9日目、12日目、15日目、18日目に、細胞を1X PBSで1回洗浄してから、適切な分化培地を添加します。21日目に、HepaRG細胞を顕微鏡で観察し、細胞がコンフルエント分化培養であることを確認する。コントロールとして、1つの対照皿を収穫し、分化マーカー遺伝子の遺伝子発現解析を行う。21日目において、分化したHepaRG細胞は液体窒素中で凍結保存することができる。21日目に、オレイン酸ナトリウムを、完全な分化培地の適切な量で希釈し、最終濃度の250マイクロモルにする。99%メタノールを1~400の割合で分化媒体の別のアリコートに加え、車両制御処理を行います。1X PBSで細胞を1回洗浄し、車両またはオレイン酸ナトリウム培地を添加します。23日目および25日目に、調製した培地の適切な量で培地を交換する。26日目に、光学顕微鏡で細胞を観察する。脂質滴は、オレイン酸ナトリウム処理細胞に蓄積し、細胞質中の半透明の液滴として容易に見える。オイルレッドO染色を行うために、まず1X PBSで細胞を1回洗浄し、1X PBSを完全に除去します。4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で15分間インキュベートします。パラホルムアルデヒドを取り出し、1X PBSで細胞を2回洗浄します。PBSを取り除いた後、室温で5分間60%イソプロパノールで細胞をインキュベートする。イソプロパノールを取り出し、細胞を室温で完全に乾燥させます。オイルレッドOの働き溶液を細胞に加え、室温で30分間インキュベートします。各サンプルに必要な作業溶液の量は、細胞の培養に使用されるメディアの量に対応します。オイルレッドO溶液を取り外し、すぐに二重蒸留水を加えます。二重蒸留水で細胞を4回洗浄した後、顕微鏡下で画像を取得して分析します。オイルレッドO染料を溶かすために、すべての水を取り除き、乾燥させます。その後、100%イソプロパノールの1ミリリットルを加え、室温で穏やかな揺れをして10分間インキュベートします。イソプロパノールを溶出したオイルレッドO染料を数回上下にピペットし、すべてのオイルレッドOが溶液中であることを保証します。溶液をキュヴェットに移します。分光光度計で500ナノメートルの光学濃度を測定し、ブランクとして100%イソプロパノールを使用します。1X PBSで細胞を1回洗います。その後、100ナノモルのボディーを暗闇の中で1X PBSで37°Cで40分間希釈してインキュベートする。未染色のコントロールは、フローサイトメトリー測定に含まれるべきです。染色液を取り出し、1X PBSで細胞を1回洗います。その後、再度細胞を洗浄し、PBSを完全に除去します。4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で15分間インキュベートします。パラホルムアルデヒドを取り出し、PBSでサンプルを5分間3回洗浄します。細胞は摂氏4度で1X PBSに保つか、すぐに画像化することができる。保管の場合は、パラフィルムで包み、アルミニウム箔で覆い、細胞が乾燥するのを防ぎます。ステアトーシスの効率的な誘導を検証するために、油性処理およびコントロールHepaRG細胞をオイルレッドO色素で染色した。染色後、脂質滴は赤い液滴として容易に見える。染色は、イソプロパノールで溶出した油性RO色素の分光光度測定により定量することができる。細胞から溶出したオイルレッドOの吸光度は、細胞質脂質滴集積に直接比例する。オレイン酸ナトリウム濃度および曝露時間は、MTTの着色細胞生存率測定法によって決定した。Formosan製品は、490ナノメートルの吸光度によって定量化され、培養中の生細胞の数に直接比例します。オレイン酸ナトリウム処理をパルミテナトリウム処理と比較した。アポトーシス薬ドキソルビシンをコントロールとして使用した。オレイン酸ナトリウム処理後の細胞脂質含有量の増加を定量化するために、ボディー色素による染色を使用して脂質滴を標識した。細胞フルオロメトリック分析を用いて、コントロール細胞と比較してオレイン酸処理細胞において高い蛍光強度を意味するBodipy平均によるトリグリセリド含有量を定量化することができる。これは、オレエード処理後の効率的な脂肪蓄積を示す。実際、Bodipy染色された細胞の画像は、コントロール細胞に見えないオレア酸処理細胞の明るい緑色の蛍光脂質液滴を示す。オレイン酸ナトリウム処理後の脂質滴の蓄積をさらに特徴付けるために、CARS顕微鏡法は、標識を行わずに脂質滴定量を可能にするテキストプロトコルに記載されているように行うことができる。この細胞ベースのモデルは、非発性脂肪性肝疾患に関与する分子メカニズムに関する知識を高め、早期診断と新しい治療戦略のための新しいマーカーの開発につながる可能性があります。

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