マウス生殖管自発的運動性を評価するためのEx Vivo法とデータ解析のためのMATLABベースの子宮運動追跡アルゴリズム
2019年9月1日
子宮収縮は女性の幸福のために重要である。しかし、病理学的に収縮性が増加すると、特に若い女性では月経困難を引き起こす可能性がある。ここでは、月経困難の治療に使用できる平滑筋弛緩剤の有効性を迅速に評価できる簡単なex vivo製剤について説明する。
我々のプロトコルは、無傷の子宮の自発的運動性を評価するための最初の定量的ex vivo方法を提供するため、重要である。この新しいアプローチは、合成化合物で天然の治療薬の弛緩電をテストするための簡単で安価な代替手段を提供します。この技術の主な利点は、すべての子宮内細胞相互作用が実験を通してそのまま残っているということです.
子宮の収縮性の過多は、子宮弛緩剤が治療に有用であり得る月経困難症に関連している。この方法は、新しいリラックス剤を簡単にテストする方法を提供します。エストルースサイクルステージを確認した後、マウスをスペイン位置に置き、四肢を広げて腹部骨盤領域を露出させる。
腹部を70%エタノールで濡らし、鉗子を使用してクリトリスよりも優れた皮膚を慎重に持ち上げます。腹膜を露出させるために下腹部の側面に小さな横切開を行います.子宮の角を傷つけることなく、胃腸管を露出するために腹膜を慎重に切断し、胃腸管を覆う筋膜および脂肪組織を除去するために鉗子を使用する。
十二指腸、半腸、腸、盲腸、および上昇と横コロンを削除します。膀胱の真下に見られる腟を見つけるために尿膀胱を見つける。陰部の交骨を膀胱に合流させ、膀胱に尾を向き、はさみを使用して、陰部線維カルテリガン組織を通して陰部交腫の側面を慎重に切開してアクセスを得て膣抽出のルートを提供する。
外陰部と内耳の間に位置する会陰を切り取り、鉗子を使って膣を持ち上げて直腸の切除を遅らせる。膣にロストリーフォークに分岐する2つの子宮の角を識別し、各角の端に畳み込まれた卵管と卵巣を見つける。子宮の角を正しく識別することは、組織が損傷していないことを確認する手順に不可欠です。
小さな解剖はさみを使用して、腹腔内の角、卵管および卵巣に接続して支える靭帯を取り除き、膣、子宮、卵管および卵巣を取り除く。単離した生殖管全体を、10ミリリットルのダルベッコPBSを含む100ミリメートルのペトリ皿に移します。鉗子と外科用はさみを使用して、子宮の角と膣を取り巻く結合組織や脂肪組織、および画質を妨げる可能性のある陰部の毛皮を取り除きます。
広い靭帯を取り除いて子宮角の運動性を可能にし、分離された生殖管を3ミリリットルの酸素化クレブス溶液を含む35ミリメートルのペトリ皿に移す前に、新鮮なダルベッコのPBSで洗浄ごとに2回組織を洗浄します。自発的運動性イメージングの場合は、ペトリ皿を室温の黒い表面に置き、自発的な収縮が始まるのに15〜30分かかります。動きが観察できる場合は、あらゆるタイプのデジタルビデオ機器を使用して、軸面から10分間自発的な子宮運動を記録します。
次に、試験化合物を加えた酸素化されたクレブスバッファーを含むペトリ皿に製剤を移し、同じ方法でさらに10分間自発的な子宮運動を記録する。記録期間の終わりに、100ミリメートルペトリ皿でダルベッコのPBSの10ミリリットルで生殖管全体を洗浄し、治療の可逆性を評価するために、新たに酸素化されたクレブスバッファーの新しいペトリ皿にサンプルを転送します。最後の2つの録音と同じように、約10分間自発的な子宮運動を記録します。
その後、試験化合物の車両に補われた酸素化されたクレブスバッファーで満たされた別の35ミリメートルのペトリ皿に準備を移し、自発的な子宮運動に機械的に誘発された変化がないことを確認する。生殖管調製物は、エピネフリンの不在時にパネルAおよびCに高い運動性を示した。しかし、この表現型は、1つのマイクロミュラーエピネフリンの存在を持つパネルBで休眠状態にある。
ここで、エピネフリン投与および自発的運動性回復のサンプルデータ分析が示され、化合物処理前、試験中、および試験後に採取した組織の記録から、生殖管自発的運動性に対するホルモンの影響を定量化する方法を示す。それ以外の場合、自発的な収縮性は観察されませんが、子宮角を圧縮または過剰に伸ばすことを避けるために重要です。我々の方法はまた、子宮の収縮性を増加させる可能性のある化合物を試験するために使用することができる。
この手順は、妊娠の初期段階で妊娠中のマウス子宮に適用することができます.この実験は、スループット薬物スクリーニングのための6つのウェルプレート形式にアップグレードされる可能性を秘めています。
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概要
本研究では、特に若年女性の月経困難症に関連した子宮収縮の重要性について検討します。ここでは、子宮の運動能および平滑筋弛緩剤の有効性を評価するための新しいex vivo法を提示しており、これが月経困難症の治療選択肢となる可能性があります。
研究の主要構成要素
研究領域
- 子宮収縮能
- 月経困難症の治療
- ex vivo評価手法
背景
- 子宮収縮能の亢進は月経困難症に関連しています。
- 子宮運動能を評価する既存の手法は、その有効性に限界があります。
- 本研究は、弛緩剤の試験をより円滑に行うため、評価技術の向上を目的としています。
使用方法
- 子宮運動性の定量的なex vivo評価。
- 子宮の相互作用が維持されたマウスモデルシステム。
- 運動性記録のためのデジタルビデオ装置の使用。
主な結果
- 子宮収縮能を評価するための再現性のある手法の確立。
- 弛緩剤に対する自発的な収縮能の定量化。
- 弛緩剤および収縮亢進剤の両方の化合物を試験できる可能性。
結論
- 本研究では、子宮収縮能および弛緩剤の有効性を評価するための実用的な手法を導入します。
- これらの知見は、月経困難症の治療に関する今後の研究に寄与します。
よくある質問
産業上の重要性
このex vivo法では、マウスの完全な生殖管における自発的な子宮運動の定量的な評価が可能であり、子宮弛緩剤や収縮調節剤を評価するための生理学的に適切なモデルを提供します。子宮内の固有の細胞間相互作用を維持することで、本アプローチは月経困難症および関連する子宮運動障害を標的とする化合物のメカニズム的なリスク低減を支援します。また、本手法は、ウィメンズヘルス分野の創薬における初期段階のターゲットバリデーションおよびリード化合物の同定に向けた、拡張性と再現性の高いプラットフォームを提供します。
バイオ製薬研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：自発的な運動性の変化を定量化することで、子宮平滑筋機能に関する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：生体組織の構造と細胞間相互作用を維持することで、標的のリスクを低減させる再現性の高いex vivoシステムを提供する。
- 予測的価値：子宮収縮能に対する化合物の影響について、定量的な用量反応データを提供し、ポートフォリオの選別を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況：MATLABベースのモーショントラッキングにより標準化された運動性の読み取り値を生成し、一貫した化合物スクリーニングを可能にします。
- 拡張性：デジタルビデオキャプチャに対応し、6ウェルプレートなどの高スループット形式に適応可能です。
- アッセイの堅牢性：エピネフリンで実証されているように、運動性の可逆的な抑制を測定でき、アッセイのバリデーションおよび化合物の確認をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：ヒト子宮内膜の波状活動をモデル化しており、月経困難症の病態生理に関するトランスレーショナルな知見を提供します。
- 前臨床での連続性：実験を通じて生殖管の相互作用を維持することで、基礎研究から前臨床評価への橋渡しを行います。
- リスク調整後の進展：収縮能の調節および化合物の効果の可逆性を定量化することで、開発継続か中止かの判断基準を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲット仮説の検証からリード化合物の同定、そして前臨床検証に至る創薬の連続的なプロセスに適合するものであり、特に子宮収縮調節化合物において有用です。
- ディスカバリーバイオロジー： 無垢な組織コンテキストにおける子宮収縮経路のメカニズム解析およびターゲットエンゲージメントの検証を促進します。
- スクリーニング： 自発的な運動能に対する化合物の影響を信頼性高く比較することを可能にする、定量的で動きに基づいたリードアウトを提供します。
- アナリティクス： モーショントラッキングアルゴリズムを用いて、用量反応およびキネティック解析のための測定可能で再現性のある出力を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： ヒトの月経困難症に関連する生理学的な子宮組織間の相互作用を維持することで、前臨床モデルへの継続性をサポートします。
- エンタープライズ再利用： 平滑筋機能に関わる化合物クラスや治療領域全般に適用可能な、再利用可能な運動能アッセイプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：子宮平滑筋反応におけるメカニズム的な曖昧さを排除することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：最小限の設備（デジタルカメラ、MATLABアルゴリズム）で実施可能な、低コストで標準化されたex vivoアッセイを提供する。
- 戦略的価値：リソースを大量に消費するin vivo研究の前に、子宮弛緩薬候補の早期リスク低減を可能にし、資本効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：定量化された運動抑制能および可逆性プロファイルに基づいた、データ駆動型の化合物優先順位付けを可能にする。
実施上の留意点
- 生存能を維持するため、マウス生殖管の解剖および組織ハンドリングに関する専門知識が必要である。
- 一貫した運動性を確保するため、酸素飽和Krebs緩衝液による維持および温度管理されたイメージング環境に依存する。
- 信頼性の高い運動追跡解析を行うため、ビデオ録画パラメータ（角度、時間、照明）の標準化が必要である。
- 系統や条件によって異なる子宮角の運動パターンに対応するため、MATLABベースのアルゴリズムの最適化が必要である。
- サンプルの10-20%で自発的な運動が見られないため、反応性のある組織を事前にスクリーニングする必要がある。
