Name: マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学ぶマウス小腸の上皮内リンパ細胞の生体イメージング法。GFP標識γδ IELを可視化し、粘膜免疫における細胞動態と免疫-上皮相互作用をリアルタイムで観察する技術を解説します。

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この研究は、NIH R21 AI143892、ニュージャージー州保健財団助成金、ブッシュバイオメディカルグラント(KLE)によってサポートされています。私たちは、原稿を編集し、代表的な結果に示されたデータを提供する彼女の支援のためにマドレーヌHuに感謝します。

すべての研究は、ラトガースニュージャージー医科大学比較医学リソースによって承認されたプロトコルに従って、実験室動物ケア(AALAC)認定施設の評価と認定の協会で行われました。
1. マウスの準備
注:動物の調製と手術を含む次の手順は、手術前に30〜40分かかります, 顕微鏡をオンにし、顕微鏡上の囲まれたインキュベーターを37 °Cにウォームアップ.
<ol><li>ベルナール・マリッセン(INSERM、パリ、フランス)から得られたC57BL/6バックグラウンドで、8~10週齢のTcrdEGFPマウスに対して実験を行う。IACUC承認の手順によると、動物の体重に基づいてケタミン(120mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)のi.p.注射によってマウスを麻酔する。呼吸率(毎分55〜65呼吸)21、つま先ピンチとパルペブラル反射によって麻酔のレベルを評価します。</li>
	<li>外科用飛行機麻酔に達したら、直腸温度計で監視できる体温を維持するために、テープを使用してマウスの後ろ足を加熱パッドに固定します。麻酔がすり減っている兆候がある場合(例えば、呼吸数の増加、点滅および/または眼筋のけいれん反応は、マウスが完全に鎮静されるまで一度に50 μLのケタミン/キシラジンを再投与する)。</li>
	<li>0.9%の生理生理生理の315 μLでホーヒスト33342(10 mg/mL)の50 μLを希釈することによって核色素を調述します。最終的な濃度は、マウスの重量(200 μLおおよその容積)に基づいて37.5 mg/kgです。マウスが麻酔されたら、レトロ軌道静脈洞を通してツベルクリン注射器を用いてホエヒトをゆっくりと注入する。 注:次のステップに進む前に1〜2分待って、マウスがレトロ軌道注入後の循環体積の変化に順応できるようにします。</li>
	<li>少量の潤滑油を目の上に置き、乾燥を防ぎます。</li>
</ol>2. マウス手術:腸粘膜を露出させる腹腔内膜
<ol><li>下腹部の中線に沿って皮膚および腹膜を通して2cmの垂直切開を行い、画像化する腸の領域を外部化する。</li>
	<li>斜めの鉗子を使用して、慎重に精巣腔から盲腸を引き出し、画像化される小腸の領域を特定する。このプロセス中に腸間膜血管を引き裂かないように注意してください。.潜在的な損傷や出血を最小限に抑えるために、鉗子で腸をつかむか、またはつまむのを避けてください。</li>
	<li>最小限の大腸の内容物を含むイメージングのための小腸(2〜3センチメートル)の適切な領域を見つけます。慎重に盲腸と残りの小腸を精巣腔に戻し、関心のあるセグメントを外部化したままにする。 注:このステップの間に盲腸を穿刺したり、腸間膜血管を破壊することは避けてください。</li>
	<li>血管間の下の腸間膜の両側に2組の鉗子を置き、鉗子の先端をそっとこすり合わせて膜に穴を開ける(図1)22。これは、腸の下の腹膜腔を閉じるときに針が腸間膜を通過することを可能にします。</li>
	<li>腸のループを外部化したまま切開部を閉じます。斜めの鉗子と湾曲したテーパーポイント針を5cm縫合に取り付け、腹膜の片側を貫通し、前工程で作られた穴を通り抜け、腹膜裏地の反対側を通る。1つの縫合糸を上部に置き、もう1つは切開部の底部の近くに置きます。 注:このステップ中に血管系を損傷しないようにしてください。</li>
	<li>このプロセスを繰り返して、腸ループの下の皮膚を閉じ、切開の真ん中に1本の縫合糸を置き、下層の下腸膜の前の縫合糸の間に置く。 注:イメージ化する領域だけを外部化することが重要です。これはイメージ投射の間に無関係の動きを減らす。腸間膜動脈を結び付けないようにしてください。</li>
	<li>電気焼灼を使用して、抗腸間膜境界に沿って穿起のラインを作ります。焼灼直後に、腸の表面に数滴の水を塗布し、熱誘発組織の損傷を防ぎます。残留水を除去するためにキンワイプでブロット。</li>
	<li>Vannasはさみを使用して焼灼組織の遠位端に小さな水平スリットを切断し、粘膜を露出させるために外部組織セグメントの近位端(長さ約1.5cm)に向かって焼灼線の長さに沿って切断に進みます。表面。 注:必要に応じて、鉗子を使用して、露出した粘膜表面に残っている余分な胎児含有量を穏やかに除去します。</li>
	<li>湿ったキンワイプでマウスの腹部を覆い、組織が脱水するのを防ぎます。覆われた容器の顕微鏡にマウスを運ぶ。</li>
</ol>3. スピニングディスク共焦点顕微鏡による画像取得
<ol><li>HBSSの1 μM AlexaFluor 633のピペット150 μLは、35mm皿の底部を滑り落ちたガラスカバーに入れた。開いた粘膜面がカバースリップに直接接触できるように、マウスを配置します。</li>
	<li>顕微鏡の頭部を後ろに傾け、あらかじめ温められたインキュベーターでイメージングステージの上にマウスを置きます。または、体温を維持するために加熱毛布でマウスを覆います。</li>
	<li>イメージング ソフトウェアを起動します。各レーザーの励起強度と露光時間は、光の漂白を避け、時間ポイント間の間隔を最小限に抑えるために、それぞれ10-15 mWまたは120〜150ミリ秒を超えてはなりません。フレーム平均を「2」に調整し、EMゲイン機能をオンにしてバックグラウンドノイズを低減します。63xの客観的なキャリブレーションを選択して、ピクセルサイズの正しい測定を確認します。 注:上記の設定は、初期参照を提供することを目的としていますが、個々の顕微鏡構成によって異なります。</li>
	<li>405 nmレーザーと20倍の空気目的を使用して、顕著な動きや目によるドリフトを欠く絨毛のフィールドを見つけるために核を視覚化します。呼吸、蠕動または心拍によるアーティフィカルな動きの領域を避けてください。</li>
	<li>XYスキャンを用いて、対象分野のXY座標を記録し、グリセロール浸漬63X目的に切り替える。</li>
	<li>選択したフィールドの villi が、405 nm チャネルで最大 1 分間ライブ イメージを取得して安定していることを確認します。</li>
	<li>405 nm チャネルでライブイメージを取得する場合は、フォーカスを調整して、ビロス先端のすぐ下にある直交面を見つけます。1.5 μmのステップを使用して、約15〜20 μmの核を解決することが困難になるまで、絨毛先端上皮のすぐ下から始まるZスタックを取得します。 注:上記の露光時間を用いて3チャンネル(405、488、640nm)で撮像する場合、約20秒間隔で3つのチャンネルすべてを順次取得することができる。</li>
	<li>分析モードでソフトウェアを開き、取得開始後3~5分、画像安定性とβIEL運動性を確認する。ヴィリの各フィールドのための30-60分の画像を取得し続けます。各マウスの 2 ~ 3 つのフィールドを記録します。イメージング中は、マウスを 5 分ごとに監視します。 注:麻酔が摩耗し始める場合は、鉗子を使用してマウスの首をそっと擦り、一度に50 μLのケタミン/キシラジンを投与する。麻酔レベルを監視し、必要に応じて再管理を続けます。</li>
	<li>1 つのマウスを 4 時間以上イメージすることはお勧めできません。画像取得が完了したら、子宮頸部脱臼によってマウスを犠牲にし、続いて両側気胸を犠牲にする。</li>
</ol>4. 4D画像解析
<ol><li>イメージング ファイルを 4D レンダリング ソフトウェアに直接インポートします。</li>
	<li>IEL とルーメンの個々のサーフェスを作成し、最初の参照として表 1で概説したパラメータを使用して、時間の経過と一度にサーフェスを追跡します。IEL の場合は、指定されたシード ポイントの直径を使用してタッチ オブジェクトを分割します。</li>
	<li>自己回帰トラッキング アルゴリズムを使用して、IEL 運動性を決定します。トラッキング アルゴリズムは比較的正確ですが、個々の IEL のトラックを視覚的に検査することが不可欠です。トラックが正しくない場合は、[トラックの編集]タブの[切断]機能と[接続]機能を使用してトラックを修正します。</li>
	<li>各 IEL から内膜までの距離を決定するには、内膜サーフェスを選択し、[ツール]メニューの下で距離変換機能を実行します。プロンプトが表示された場合は、[外部サーフェス]を選択します。計算されると、距離変換は 4 番目のチャネルとして表示されます。</li>
	<li>4番目のチャネルの強度分をフィルタリングして、横細胞間空間(LIS)内にあるγΔ IElを選択します。この値は、柱上皮セルの高さに基づいて、15 μm に近い値にする必要があります。この範囲内の全βILsの割合は、LISにおけるγδ IElsの頻度として報告される。</li>
	<li>さらに分析を行う場合は、IEL トラック速度、トラックの変位、直線性、トラックの長さなどの統計データをエクスポートします。または、ヴァンテージモジュールを使用してデータを分析します。実験に応じて、取得したデータから、LISまたはIEL/上皮相互作用内の所持ち時間を含む追加のメトリックを取得します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は何も開示していない。

生体内顕微鏡技術の開発は、細胞内構造の再編成を観察する前例のない機会を提供している8,9,22, 細胞細胞相互作用12, 25および細胞移動挙動13、14、15、16、26は、そうでなければアクセスできない組織において。生体内18、27のβILsの調節と機能を研究するツールが一般的に欠如しており、そ...

上皮内リンパ球(IEL)は腸上皮内に位置し、横細胞間空間1の地下膜と隣接する上皮細胞の間の両方に見出される。5-10上皮細胞ごとに約1つのIELがあります。これらのIELsは、腸上皮バリア2の大きな広がりの免疫監視を提供するセンチネルとして機能する。γΔ T細胞受容体(TCR)を発現するIELは、マウス小腸におけるIEL集団全体の60%までを占める。γΔT細胞欠損マウスの研究は、腸損傷、炎症および感染3、4、5に応答してこれらの細胞の主に保護的役割を示す。Tcrdノックアウトマウス6の生成にもかかわらず、γδ IEL生物学の我々の理解は、γδ TCRによって認識されたリガンドがまだ同定されていないという事実のために、依然として限定的なままである。その結果、この細胞集団を研究するためのツールが不足し、生理的および病理学的条件下でのγΔ TCR活性化および機能の役割を調べることを困難にしている。このギャップを埋めるために、生体イメージング技術を開発し、β(IEL)の移動挙動や近隣腸細胞との相互作用を可視化し、生体内のβIEL機能と外部刺激に対する応答性に関するさらなる洞察を提供する手段として開発しました。
過去10年間にわたり、インビタルイメージングは、上皮細胞脱落8、上皮バリア機能の調節を含む腸生物学の複数の面に関与する分子事象に関する我々の理解を著しく拡大した9 ,10, 明るさ内容の骨髄細胞サンプリング11,12, 宿主微生物相互作用11,13,14,15,16.IEL生物学の文脈では、生体内顕微鏡の使用は、IEL運動の時空間ダイナミクスと、その監視行動を媒振する要因に光を当てた13,14,15, 16.核GFP発現17でβ(IELS)を標識するTcrdH2BeGFP(TcrdEGFP)レポーターマウスの開発により、γΔ Ielsは上皮内で非常に運動性が高く、微生物に反応する独自の監視挙動を示すことを明らかにした。感染17,13,14.最近、細胞質中のGFPを発現する別のβΔT細胞レポーターマウス(Tcrd-GDL)が開発され、細胞全体の可視化を可能にした。同様の方法論は、IEL運動性19、20のダイナミクス上のGタンパク質結合受容体(GPCR)-18および-55などの特定のケモカイン受容体の要件を調査するために使用されてきた。細胞特異的レポーターが存在しない場合、CD8αに対する蛍光共役抗体は、生体内19、20におけるIEL運動性を可視化および追跡するために使用された。2光子レーザースキャニング顕微鏡は、一般的にイントラビタルイメージングに使用されますが、スピニングディスク共焦点レーザー顕微鏡を使用すると、バックグラウンドノイズを最小限に抑えて高速かつ高解像度のマルチチャンネル画像をキャプチャする独自の利点があります。この技術は、腸粘膜の複雑な微小環境内の免疫/上皮相互作用の時空間的ダイナミクスを解明するのに理想的である。さらに、様々なトランスジェニックおよび/またはノックアウトマウスモデルの使用を通じて、これらの研究は腸内免疫および/または上皮細胞機能の分子調節に関する洞察を提供することができる。

<table><tbody><tr><td>35 mm ディッシュ、No. 1.5 カバースリップ</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 ヒドラジド</td><td>Invitrogen</td><td>A30634</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 皮下注射針 - 27 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-826-48</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip 滅菌シリンジ - 1 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD Tuberculin Syringe</td><td>Thermo Fisherサイエンティフィック</td><td>14-829-9</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>電気焼灼</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50822501</td><td></td></tr><tr><td>密閉型インキュベーションチャンバー</td><td>OKOLAB</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>アイニードル、サイズ #3; 1/2 サークル、テーパーポイント、12 mm コード長</td><td>ロボズ</td><td>RS-7983-3</td><td></td></tr><tr><td>ハンクスバランス塩溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55037C</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Imaris (v. 9.2.1) スタート、トラック、XTモジュール付き</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>倒立型DMi8</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>IQ3 (v. 3.6.3)</td><td>Andor</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Putney</td><td></td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannasはさみ3インチ(7.5センチ)ロング 5 x 0.15 mm ストレート シャープ</td><td>ロボズ</td><td>RS-5600</td><td></td></tr><tr><td>非吸収性外科用縫合糸、シルクスプール、ブラック ブレイド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>NC0798934</td><td></td></tr><tr><td>ニュージェント フォーセプス 4.25インチ(11センチ)ロングアングルスムース1.2mmチップ</td><td>Roboz</td><td>RS-5228</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 軟膏</td><td>Dechra</td><td></td><td>潤滑眼軟膏</td></tr><tr><td>スピニングディスク横河CSU-W1、63x 1.3 N.A. HC PLAN APOグリセロール浸漬対物レンズ、iXon Life 888 EMCCDカメラ、405 nmダイオードレーザー、488 nm DPSSレーザー、640 nmダイオード</td><td>レーザーAndor</td><td></td><td>共焦点システム</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td></td><td>麻酔</td></tr></tbody></table>

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

γδT細胞受容体(γδ IEL)を発現する上皮内リンパ球は、腸上皮の免疫サーベイランスにおいて重要な役割を果たす。γΔT細胞受容体に対する決定的なリガンドの欠如により、γΔ IEL活性化の調節と生体内での機能に関する我々の理解は限られている。このため、γδ IEL機能の調節に関与するシグナル伝達経路と、これらの細胞の局所微小環境への応答性を調知るための代替戦略の開発が必要である。γδ IELは病原体の転移を制限することが広く理解されていますが、インビタルイメージングの使用は、定常状態および侵襲性病原体に応答するIEL/上皮相互作用の時空間的ダイナミクスを理解するために重要です。本明細書では、逆紡糸ディスク共焦点レーザー顕微鏡を用いてGFPγδT細胞レポーターマウスの小腸粘膜におけるIEL移動挙動を可視化するためのプロトコルを提示する。このアプローチの最大イメージング深さは、2光子レーザー走査顕微鏡の使用に比べて制限されていますが、回転ディスク共焦点レーザー顕微鏡検査は、光漂白を低減した高速画像集録の利点を提供し、光の損傷。4D画像解析ソフトウェアを使用して、T細胞監視挙動と隣接細胞との相互作用を実験操作後に解析し、腸粘膜内のIEL活性化と機能に関するさらなる洞察を提供します。

TcrdEGFPレポーターマウスのインビタルイメージングを用いて、γδ IElsが動的な監視挙動を示し、地下膜に沿って横細胞間空間(LIS)に移動して上皮をパトロールすることを以前に示した。状態 (図 2、 ムービー 1)
このアプローチは、特定の細胞シグナル伝達経路および/または受容体の阻害がγδ IEL移動挙動にどのように影響するかを評価するためにも使用することができる。例えば、インターロイキン(IL)-15は、γΔ IEL恒常性23、24に不可欠な多発性サイトカインである。IL-2Rβ受容体を介したIL-15シグナル伝達が定常状態でのβIEL運動の運動に寄与するかどうかを決定するために、TcrdEGFPレポーターマウスは、抗IL-2Rβ抗体(TM-β1)またはアイソタイプIgG2b制御の投与後2時間を画像化した。色付きの軌跡は、30分の経過の間に個々のγΔ IElsの...

逆紡糸円盤共焦点顕微鏡によるマウス小腸のインビタルイメージングを用いてGFP標識γΔ IElsを可視化する方法について述べた。この技術は、粘膜内の生細胞の追跡を最大4時間可能にし、腸内免疫上皮相互作用の様々な調査に使用することができる。

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

小腸粘膜の生体内顕微鏡検査は、異なる免疫細胞タイプ間、またはこれら2つの区画間の上皮内の細胞相互作用の時空間的ダイナミクスに関する洞察を提供することができる。この技術の主な利点は、腸粘膜内の高速かつ高解像度の画像をリアルタイムで取得できることです。腸のライブイメージングは、細胞相互作用、または粘膜免疫、上皮生物学または癌生物学に関与する細胞シグナル伝達に関するさらなる洞察を提供することができる。これは、外科的技術の練習だけでなく、画像取得のためのマウスの忍耐と最適な位置を必要とする挑戦的な方法です。麻酔付きトランスジェニックマウスにおけるつま先ピンチへの応答の欠如を確認した後、強化された緑色蛍光タンパク質、またはEGFP、Γ-delta T細胞受容体を発現し、結核注射器を使用して、新たに調製したHoechst 33342 Dye Solutionをレトロオービタル静脈静脈静脈内にゆっくりと200マイクロリットル注入する。注射の1~2分後、動物の目に軟膏を塗布して乾燥を防ぎます。次に、下腹部の正中線に沿って皮膚と腹膜を通して2CM垂直切開を行い、角度付き鉗子を使用して腹腔からcaecumを慎重に引き出します。最小の便内容を含む小腸の2〜3CM領域を特定し、腸間膜血管を引き裂かないように注意し、慎重にcaecumと残りの小腸を腹腔に戻し、関心のあるセグメントを外部化したままにします。血管間の下線の腸間の両側に2組の鉗子を置き、鉗子の先端をそっとこすり、膜に穴を開ける。5CM縫合糸に付けられた斜めの鉗子と湾曲したテーパーポイント針を使用して、膜内の穴を通って腹膜の片側を貫通し、腹膜裏地の反対側を通り抜け、1つの縫合線を上部に配置し、切開の底付近に切開を入れ、腸管のループを外部化したまま切開を閉じる。成功の可能性を高めるために、腹部縫合糸を配置しながら血管を縛ったり引き裂いたりせず、腸の余分な取り扱いを制限してください。次に、腸ループの下の皮膚を同様に閉じ、下線腹骨の前の縫合糸間の切開の途中に1つの縫合糸を配置する。電気焼灼器を使用して、前腸間縁に沿って穿穿のラインを作り、すぐに追加の熱誘発組織の損傷を防ぐために腸の表面に水の数滴を適用します。残りの水を取り除くためにキムワイプでブロット。vannaはさみを使用して、焼灼された組織の遠位エッジで、焼灼線の長さに沿って、外付された組織セグメントの近位端に向かって約1.5CMの水平スリットを切断します。粘膜表面が露出したら、組織を水分補給するために湿ったキムワイプで腹部を覆います。スピニングディスク共焦点顕微鏡イメージングの場合、マウスを覆われた容器内の顕微鏡に搬送します。イメージングソフトウェアを起動し、顕微鏡の頭を後ろに傾け、1マイクロモルノミアレクサフルオール染料とハンクの緩衝生理食塩水を150マイクロリットルのグラスカバーの滑った底に加えます。開いた粘膜表面がカバースリップに直接接触するようにマウスを置きます。マウスと皿を事前に温めたインキュベーターのイメージングステージに置きます。各レーザーの励起強度と露出時間をそれぞれ10~15ミリワット以下、120~150ミリ秒以下に設定し、フレーム平均を2に調整します。電子乗算ゲイン機能をオンにしてバックグラウンドノイズを低減し、63倍の目的キャリブレーションを選択してピクセルサイズを正しく測定します。405ナノメートルレーザーと20X空気の目的を使用して、手動で核を視覚化して、目立つ動きやドリフトを欠く絨毛のフィールドを見つけ、呼吸、蠕動または心拍による実際の動きの領域を避けます。X-Yスキャンを用いて、対象分野のX-Y座標を記録し、グリセロール浸漬63X目的に切り替える。405ナノメートルのチャンネルで最大1分間ライブ画像を取得し、選択したフィールドの絨毛が安定していることを確認し、焦点を調整してビラス先端のすぐ下に直交する面を見つけます。その後、1.5マイクロメートルのステップを使用して、核を解決することが困難になるまで、約15〜20マイクロメートル下のvillus先端上皮のすぐ下から始まるzスタックを取得します。取得開始から3~5分後、画像安定性とガンマデルタ上皮内細胞運動性を確認し、絨毛の各フィールドについて30〜60分間画像を取得し続けます。ガンマデルタ上皮内リンパ球は、地下膜に沿って、研究状態で横間空間に移動することによって上皮をパトロールする動的な監視行動を示す。これらの代表的な画像では、色付きのトラックは、30分間にわたって個々のガンマデルタ上皮内リンパ球の回遊経路を示す。抗インターロイキン-2受容体β抗体で治療したマウスでは細胞間間空間における上皮内リンパ球の頻度は増加したが、これらのガンマδ上皮リンパ球の30%以上がアイドリング挙動を示した。このアイドリング表現型は、対照に対するインターロイキン-2受容体遮断に続くガンマ-デルタ上皮リンパ球の瞬間速度および閉じ込め比の両方の有意な減少によって確認された。さらに、アイドルガンマデルタ上皮内リンパ球は、より長い住空間を持ち、また、モチルガンマデルタ上皮内リンパ球と比較して、より頻繁に細胞間空間内に局在していた。蠕動による過度の動きを欠く絨毛の畑を特定することは困難である。マウスの位置を変更すると、より安定したフィールドを見つけるのに役立ちます。細胞追跡データのさらなる分析は、特定の運動行動を特定したり、細胞間相互作用を測定するための追加の指標を提供するのに役立つ可能性があります。IEL-運動性のインビタルイメージングと分析は、IEL機能の標準的な読み取り出しとなっており、自然免疫シグナル伝達がガンマデルタIEL機能をどのように調節するかの洞察を提供しています。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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このビデオは、共焦点顕微鏡を用いたトランスジェニックマウスのγδ上皮内リンパ球(IEL)の可視化を示しています。外科的処置では、穿孔線を作成し、腸粘膜と絨毛を露出させるために縦方向に切開します。トランスジェニックマウスは、レポータータンパク質をγδ...

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における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージングのApc最小/ +腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

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マウス小腸管免疫系からリンパ球を分離すること

ここでは、我々 は生体内の白血球、炎症、ナイーブから出口の定量化とマウス皮膚の悪性の方法を示します。我々 は 2 つのモデルの比較を実行: 経皮 FITC...

マウスの皮膚腫瘍からリンパ管を介して白血球出口の定量化

生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。...

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このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドの樹立、マウス小腸固有層からの1型先天性リンパ系細胞の単離、および腸上皮細胞と1型先天性リンパ系細胞との間の双方向相互作用を研究するための両方の細胞型間の3次元(3D)共培養を確立するための詳細な指示を提供する。...

マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

ここでは、レーザー誘導創傷時の腸の画像を取得する方法を紹介します。マウスの腸を多光子レーザーにさらすことによって、単一または複数の陰窩の喪失が局所的に誘発される。損傷領域を数か月にわたって繰り返しイメージングすることにより、腸の回復のリアルタイムのダイナミクスがキャプチャされます。...

腸のリモデリングを研究するためのレーザーアブレーションと生体内顕微鏡

学ぶマウス小腸の上皮内リンパ細胞の生体イメージング法。GFP標識γδ IELを可視化し、粘膜免疫における細胞動態と免疫-上皮相互作用をリアルタイムで観察する技術を解説します。

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

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