Name: キトサン膜上のヒト歯周靭帯細胞スフェロイドの形成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 14 s
Description: 学ぶキトサン膜を用いたヒト歯周靭帯細胞スフェロイド培養法。3D培養システムにより自己更新能と骨芽細胞分化能が向上し、従来の培養法より優れた細胞機能を実現します。歯周組織再生医療への応用が期待されます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、中国国立自然科学財団(NSFC 81700978)、中央大学基礎研究基金(1504219050)、上海自然科学財団(17ZR1432800)、上海医療探査プロジェクト()17411972600)。

研究プロトコルは、トンジ大学の学校と胃科の病院の倫理委員会によって承認されました.すべての患者は、書面によるインフォームドコンセントを提供しました。
1. PDLセル分離
<ol><li>PDL細胞の培養のための増殖培地を作る:10%FCSおよび100 U/mLペン/ストレップを補充したα-MEM培地。</li>
	<li>隔離された第3モルを転送するために氷で容器を準備します。</li>
	<li>オートクレーブを使用して手術器具を殺菌します。</li>
	<li>トンジ大学の医学部・病院の歯科医院で、成人(18~28歳)から正常なヒトに影響を受けた第3の臼歯を抽出する。</li>
	<li>増殖培地に第3モルを入れ、4°Cで実験室に移す。</li>
	<li>抽出した歯を無菌の100mmペトリ皿に入れ、バイオハザード層流フード内で作業します。</li>
	<li>抽出した歯を洗浄するためにPBSの10 mLを追加します。洗浄手順を2回繰り返します。</li>
	<li>無菌メスを使用して、PDLを根元から穏やかに分離します。 注:PDLは、歯肉または頂点組織からの汚染を避けるために、根の中央の3番目の部分から削り取る必要があります。</li>
	<li>殺菌されたメスの刃の助けを借りて1-2-mmの断片にミンチPDL。</li>
	<li>PDLフラグメントをT-25培養フラスコに入れ、増殖培地の3〜4mLで満たします。</li>
	<li>加湿空気で5%CO2で37°Cのインキュベーターでサンプルを培養する。</li>
	<li>PDL細胞の増殖後に培養培地を変化させた。PDL細胞の増殖には通常1~2週間かかります。逆相コントラスト顕微鏡を介してPDL細胞の増殖を観察します。</li>
	<li>その後、培養培地を週2回変更する。</li>
	<li>PDL細胞が合流に達すると、サブ培養細胞の比は1:4(経通路1)である。</li>
	<li>毎日細胞の増殖を観察し、週に2回培養培地を変更する。</li>
	<li>細胞が80%の合流を達成した後、1:4の比率で各後続の通過を行います。セルシードには、第 3 世代から第 5 世代の PDL セルを使用します。</li>
</ol>2. キトサンフィルムの製作
<ol><li>1%(v/v)酢酸溶液の調製のために、きれいなガラスビーカーに495 mLの二重蒸留水に酢酸の5 mLを追加します。</li>
	<li>1%w/vキトサン溶液の調製のために、キトサン粉末の5g(平均分子量400kDa、アセチル化の85%程度)を重量を量り、1%(v/v)酢酸溶液の495 mLに添加する。</li>
	<li>60°Cで攪拌バーと磁気攪拌プレートで24時間調理した溶液をかき混ぜます。</li>
	<li>キトサンの完全な溶解を確実にするために、準備された溶液をオートクレーブします。 注: 実験は、この段階で一時停止できます。</li>
	<li>キトサンフィルムを形成するには、0.25 mL/cm2で組織培養ポリスチレン(TCPS)皿に1%w/vキトサン溶液を加えます。例えば、1%w/vキトサン溶液の0.5 mLを24ウェルプレートの1つのウェルに加えます。</li>
	<li>60°Cのオーブンで24時間TCPS皿を乾燥し、キトサンフィルムを形成します。</li>
	<li>0.5N N水酸化ナトリウム(NaOH)を調調します。10gのNaOHを少しずつ、磁気攪拌棒を用いて大量の二重蒸留水にかき混ぜ、溶液を希釈して0.5Lにする。 注:水にNaOHを追加する -- 固体NaOHに水を追加しないでください。ナオに触らないで!化学的な火傷を引き起こす可能性があります。</li>
	<li>0.5 N NaOHでキトサンフィルムを中和します。0.5 N NaOH溶液の0.5 mLを24ウェルプレートの1つのウェルに2時間加えます。</li>
	<li>キトサンフィルムを二重蒸留水で3回洗います。 注: 実験は、この段階で一時停止できます。</li>
	<li>細胞播種の前に、室温で一晩70%アルコールでキトサンコーティングされた24ウェルプレートを殺菌します。</li>
	<li>室温でPBSで3回キトサンコーティングプレートを洗い出します。</li>
	<li>室温で一晩紫外線下で処理することにより、キトサンコーティングプレートを殺菌します。</li>
</ol>3. 細胞播種
<ol><li>37°Cに対する予め温拡散培地PBS溶液およびトリプシン/EDTA溶液。</li>
	<li>上清をT-75細胞培養フラスコから廃棄する。</li>
	<li>10 mLのPBS溶液でコンフルエントPDL細胞を洗浄します。</li>
	<li>PBS ソリューションを破棄します。</li>
	<li>T-75細胞培養フラスコに1mLのトリプシン/EDTA溶液を添加する。</li>
	<li>トリプシン/EDTA溶液で細胞を37°Cで3分間インキュベートします。</li>
	<li>T-75細胞培養フラスコに3mLの増殖培地を添加してトリプシンの消化プロセスを終了する。</li>
	<li>調製したセル懸濁液を15 mLの円錐遠心管に移します。</li>
	<li>300 x gおよび室温で5分間懸濁液を遠心分離する。</li>
	<li>15 mLの円錐遠心管から上清を廃棄し、増殖培地の500μLで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
	<li>血球計でPDL細胞を数えます。</li>
	<li>0.5 x 10 4、1 x 104、3x 104、および 6 x 104セル/cm2の密度でシード PDL 細胞 。</li>
	<li>加湿空気を含む5%CO2で37°Cのインキュベーター中のキトサンフィルム上の培養PDL細胞。</li>
	<li>その後、培養培地を週2回変更する。</li>
	<li>1日目、2日目、3日目、4日目、5日目に、逆相コントラスト顕微鏡を介して毎日細胞形態を観察する。</li>
</ol>4. 細胞生存率
<ol><li>1、3、および6日間の培養後、市販の生存率/細胞傷害性キットを用いて細胞の生存を決定する。</li>
	<li>15mLチューブで、5秒の渦でPBS中の2mMカルセインAMおよび4 mMエチジウムホモジマーの新鮮な溶液の2 mLを調製する。 注:暗闇の中でプロセスを維持します。</li>
	<li>培養培地を取り出し、PBSでスフェロイドを洗浄します。</li>
	<li>暗闇の中で室温で30分間2mMカルセインAMおよび4 mMエチジウムホモジマーを含むPBSの中でスフェロイドをインキュベートする。</li>
	<li>PBSで2回スフェロイドをすすいでくす。24ウェルプレートの1つのウェルからのスフェロイドの場合は、毎回2 mLのPBSを使用します。</li>
	<li>10倍または20倍の倍率を使用して蛍光顕微鏡を使用してサンプルを観察します。</li>
</ol>

<ol><li>Albandar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+risk+factors+of+periodontal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dental+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and risk factors of periodontal diseases.</a> Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).</li>
<li>Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering%3A+a+new+paradigm+for+periodontal+regeneration+based+on+molecular+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology.</a> Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).</li>
<li>Chen, F. M., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+tissue+engineering+and+regeneration%3A+current+approaches+and+expanding+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Review%22%5BJournal%5D)">Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities.</a> Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).</li>
<li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+periodontal+tissue+regeneration+by+periodontal+cell+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Periodontology%22%5BJournal%5D)">Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation.</a> Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).</li>
<li>Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Approaches+in+Periodontal+Regeneration%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Periodontal+Defect+Models+in+Animal+Experimental+Work%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B+Review%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work.</a> Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).</li>
<li>Itaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+changes+of+periodontal+ligament-derived+cells+during+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).</li>
<li>Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+engineered+tendon+matrix+in+the+stemness+of+tendon+stem+cells+in+vitro+and+the+promotion+of+tendon-like+tissue+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo.</a> Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).</li>
<li>Elliott, N. T., Yuan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+three-dimensional+in+vitro+tissue+models+for+drug+discovery+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).</li>
<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>Yeh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+with+injectable+cell+sheet+fragments+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+in+an+immune-suppressed+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model.</a> Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).</li>
<li>Kabiri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+osteogenesis+and+autocrine+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).</li>
<li>Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Duration+Three-Dimensional+Spheroid+Culture+Promotes+Angiogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Activities+of+Adipose-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells.+Biomolecules+%26+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic.</a> Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).</li>
<li>Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+formation+and+stemness+preservation+of+human+periodontal+ligament+cells+on+chitosan+films%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films.</a> Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).</li>
<li>Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+a+three-dimensional%2C+microarray+environment+on+human+Cell+culture+in+drug+screening+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems.</a> Biomaterials. , (2012).</li>
<li>LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+proliferation+in+multicellular+spheroids+is+mediated+through+differential+expression+of+cyclin-dependent+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.</a> Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).</li>
<li>Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compaction%2C+fusion%2C+and+functional+activation+of+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate.</a> Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).</li>
<li>Cesarz, Z., Tamama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+Culture+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 9176357(2016).</li>
<li>Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+spheroid+culture+to+human+hepatocytes+and+maintenance+of+their+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation.</a> Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).</li>
<li>Lee, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+injectable+spherically+symmetric+cell+aggregates+self-assembled+in+a+thermo-responsive+hydrogel+for+enhanced+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation.</a> Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).</li>
<li>Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+three-dimensional+culture+methods+enhance+mesenchymal+stem+cell+properties+and+increase+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+spheroid+culture+system+on+micropatterned+substrates+for+improved+differentiation+efficiency+of+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).</li>
<li>Miyagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+scaffold+induces+the+spheroid+formation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+progenitor+cells+and+promotes+efficient+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation.</a> Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).</li>
<li>Bartosh, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+%28MSCs%29+into+3D+spheroids+enhances+their+antiinflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).</li>
<li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+culture+of+mesenchymal+stem+cell+spheroids+in+suspension+preserves+multilineage+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential.</a> Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).</li>
<li>Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+as+antimicrobial+agent%3A+applications+and+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action.</a> Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

本研究では、従来の2D単層細胞培養に関するいくつかの制限を克服するために、3D細胞培養システムを導入した。プロトコルによると、PDL細胞スフェロイドはキトサンフィルム上の細胞を培養することによって正常に形成された。我々の以前の研究は、スフェロイド形成がPDL細胞14の自己再生および骨形成分化能力を増加させたことを報告した。TCPSから細胞を採取するために酵素を使用する代わりに、PDL細胞スフェロイドは、単に培地を数回14回ピペッティングすることによってキトサンフィルムから収穫することができる。したがって、ECMおよび細胞間接合部は十分に保存することができる。
このプロトコルの重要なステップは、(1)手術器具とキトサンフィルムが細胞培養のために殺菌されていることを確認します。(2) 歯肉または頂点組織からの汚染を避けるために、根の中央の3番目の部分からPDLを削り取る;そして(3)PDL細胞の正常なスフェロイド形成のために、より高い細胞播種密度(≥3 x 104細胞/...

歯周炎は、主に歯垢1によって初期化され、歯周靭帯(PDL)、肺胞骨、およびセメントを含む歯周組織の損傷によって特徴付けされる。歯周炎の現在の治療は、通常、活動性疾患の進行を防ぐことに成功しているが、失われた歯周組織の再生は臨床的な課題のままである。近年、歯周組織再生のための細胞ベースのアプローチにおいて、現在の治療2、3、4の欠点を克服するための重要な進歩がなされている。
我々の以前の系統的レビューは、PDL細胞が歯周再生5に大きな可能性を示したことを明らかにした。従来、PDL細胞は、組織培養ポリスチレン(TCPS)などの2次元(2D)基板上で培養される。しかしながら、インビトロ培養6の間にPDL細胞の特徴的な変化が観察されている。この現象は、2D TCPS がインビボ 3 次元 (3D) マイクロ環境7と異なるためと考えられます。2D基板上で培養された細胞と比較して、3D微小環境で増殖した細胞は、生体内細胞8とより類似性を示す。したがって、3D細胞培養モデルは、従来の2D単層細胞培養に有望な代替手段を提供する。
従来の3D培養法は、細胞を3Dバイオマテリアルに封入する。3Dバイオマテリアルに封入された細胞と比較して、細胞スフェロイドは、異物9、10、11を含まない細胞の凝集体であるため、生体内の状況をより密接に模倣する。12.細胞スフェロイドは、フィブロネクチンおよびラミニン13を含む細胞外マトリックス(ECM)成分の保存を介してMSC生物活性を促進したと報告されている。従来のPDL細胞培養モデルを改善するために、キトサンフィルム14上のPDL細胞のスフェロイド形成に基づく3D PDL細胞培養法を最近開発した。スフェロイド形成は、PDL細胞14の自己再生および骨形成分化能力を増加させた。ここでは、キトサン膜に基づく詳細なPDL細胞スフェロイド培養プロトコルを紹介する。PDL細胞スフェロイドの3D培養システムは、従来のTCPS細胞培養に関連する欠点の一部を克服し、したがって、将来の歯周組織再生のための高められた治療効果を有するPDL細胞の産生に適している可能性がある。

<table><tbody><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Gibco</td><td>11900-073</td><td></td></tr><tr><td>酢酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64197</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ 25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Heppe Medical&nbsp;Chitosan GmbH</td><td>/</td><td>分子量500 kDa, 脱アセチル化度 85%</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>分子&nbsp;プローブ</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310732</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>KeyGen Biotech&nbsp;</td><td></td><td></td>KGB5001</tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA&nbsp;</td><td>KeyGen Biotech&nbsp;</td><td></td><td></td>KGM25200</tr><tr><td>15 mL 円錐形遠心分離管</td><td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr></tbody></table>

キトサン膜上のヒト歯周靭帯細胞スフェロイドの形成

Formation of Human Periodontal Ligament Cell Spheroids on Chitosan Films

歯周靭帯(PDL)細胞は、歯周組織再生に大きな期待を持っています。従来、PDL細胞は、組織培養ポリスチレン(TCPS)などの2次元(2D)基板上で培養される。しかしながら、インビトロ培養中にPDL細胞の特徴的な変化が観察されている。この現象は、2D TCPS がインビボ 3 次元 (3D) マイクロ環境と異なるためと考えられます。2D基板で培養した細胞と比較して、3D微小環境で増殖した細胞は、生体内細胞とより類似性を示します。したがって、3D細胞培養モデルは、従来の2D単層細胞培養に有望な代替手段を提供する。従来のPDL細胞培養モデルを改善するために、キトサンフィルム上のPDL細胞のスフェロイド形成に基づく3D細胞培養法を最近開発した。ここでは、キトサンフィルムに基づく詳細な細胞スフェロイド培養プロトコルを紹介する。PDL細胞スフェロイドの3D培養システムは、従来の2D単層細胞培養に関連する制限の一部を克服し、したがって、将来の歯周組織再生のための高められた治療効果を有するPDL細胞の産生に適している可能性がある。

本プロトコルを用いて、生存可能なPDL細胞スフェロイドが正常に形成された。図1は、付着した細胞の代わりに懸濁細胞またはスフェロイドが主にキトサンフィルムで観察されたことを示した。0.5 x 104細胞/cm2の播種密度については、1日目と3日目に付着したPDL細胞が時折見つかり、PDL細胞スフェロイドはめったに観察されなかった。それどころか、3 x 104および6 x 104細胞/cm2の播種密度については、1日目以降、様々なサイズのPDL細胞スフェロイドが見出された。PDL細胞スフェロイド形成は、3日後に全ての播種密度から観察された。図1に示すように、PDL細胞スフェロイドの大きさがこの細胞播種密度において均質であったため、3 x 104細胞/cm2が最適なPDL細胞種分密度であった。培養の5日後、す...

ここでは、ヒト歯周靭帯(PDL)細胞スフェロイドをキトサン膜で培養するプロトコルを紹介する。三次元(3D)細胞スフェロイドの培養は、従来の組織培養ポリスチレン(TCPS)培養システムに代わるものとなる。

Periodontal ligament (PDL) cells hold great promise for periodontal tissue regeneration. Conventionally, PDL cells are cultured on two-dimensional (2D) ...

キトサンフィルムによる歯周靭帯細胞スフェロイドの培養の詳細なプロトコルです。従来の培養システムと比較して、スフェロイド培養システムは、自己再生能力および骨形成分化能力を有する歯周靭帯細胞を産生する。まず、原稿の指示に従って1%重量から容積のキトサン溶液を準備します。24ウェル組織培養ポリスチレンプレートの各ウェルに0.5ミリリットルのキトサン溶液を加えます。オーブンで60°Cで24時間乾かしてキトサンフィルムを形成します。キトサンフィルムを中和するには、24ウェルプレートのウェルに0.5標準水酸化ナトリウムを0.5ミリリットル加え、室温で2時間インキュベートします。その後、キトサンフィルムを二重蒸留水で3回洗います。キトサンコーティング24ウェルプレートを室温で一晩70%アルコールで殺菌する。PBSでプレートを3回リンスし、一晩紫外線の下に放置します。細胞播種前、プリウォーム増殖培地、PBS溶液、およびトリプシンEDTA溶液を摂氏37度にする。細胞培養フラスコから上清を捨て、10ミリリットルのPBSでコンフルエント歯周靭帯(PDL細胞)を洗浄します。PBSを捨て、フラスコにトリプシンEDTA溶液を1ミリリットル加えます。フラスコを37°Cで3分間インキュベートし、3ミリリットルの増殖培地を加えてトリプシン消化を終了します。細胞懸濁液を15ミリリットル円錐形チューブに移し、それを300回gで5分間遠心分離する。上清を捨て、増殖培地の500マイクロリットルで細胞を再懸濁する。血球計で細胞を数え、5、10、30、および60千の細胞/平方センチメートルでプレートに播種します。PDL細胞を摂氏37度で5%炭酸ガスと加湿空気で培養し、週2回培地を交換する。逆相コントラスト顕微鏡で、細胞形態を毎日5日間観察します。実行可能なPDL細胞スフェロイドは、このプロトコルを使用して正常に形成されます。スフェロイドは、1日目と3日目の低播種密度ではめったに観察されません。しかし、2つの高密度では、1日目から様々なサイズのスフェロイドが存在します。最適な播種密度は、均質な回転楕円体をもたらすため、30,000セル/センチメートル平方メートルです。培養の5日後、より大きなスフェロイドは、すべての播種密度のために観察される。生存アッセイは、PDL細胞の大部分が1日目、3日目、6日目に生きているが、死んだ細胞の数は6日目に増加することを示している。このプロトコルの1つの制限は、スフェロイド形成後の細胞の増殖減少である。そこで、スフェロイド形成後の細胞の増殖を促進するためのさらなる研究が必要とされている。

formation-human-periodontal-ligament-cell-spheroids-on-chitosan

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

小説の製造、FDAが承認した成分からフレキシブル薄膜外科用接着剤、キトサンおよびインドシアニングリーンが記載されている。低出力の赤外線レーザーで簡単なアクティベーションプロセスによりコラーゲン組織にこの接着剤の接着性を示す。...

キトサンベース、レーザー活性薄膜外科用接着剤、 &#39;SurgiLux&#39;：準備とデモ

現在の幹細胞治療の主要なハードルは、ホスト組織にこれらの細胞を提供するための最も効果的な方法を決定しています。ここでは、その多能性を維持するために、脂肪由来幹細胞を可能にしながら、アプローチの効率的かつ単純であるキトサンベースの配信方法について説明します。...

幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

本発明者らは、三次元構築物をヒトの運動調節血清で処理し、コラーゲン含有量、機能および細胞生化学について分析した靭帯組織のモデルを提示する。...

運動調節血清による靭帯構築物の治療：翻訳組織工学モデル

ここで動的イミン化学を用いたキトサン ベース注射ゲルの作製について述べる。ハイドロゲルの機械的強度と 3 D...

キトサンを用いた注射ゲルおよび 3 D 細胞培養への応用の準備

ここでは、自己組織化ペプチドのひと関節軟骨細胞の脱分化型軟骨への分化を促進する足場の 3 D 培養システムを取得するためのプロトコルを提案する.

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン bioink...

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン ゲル 3 Dの in Vitroモデル システム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

このプロトコルは、微小重力下でのアメロブラスト様細胞の培養と3D増殖を行い、細長い偏光形状とエナメル質特異的タンパク質発現を維持する方法を提示します。微小重力下での歯周工学コンストラクトや肺器官の培養のための培養条件についても記載する。...

微小重力下での歯科および呼吸器細胞および臓器の増殖

本プロトコールは、キトサン−ゲニピンミクロゲルの作製のための非エマルジョンベースの方法を記載する。これらのミクロゲルのサイズは正確に制御することができ、pH依存性の腫脹を示し、...

組織工学用途のためのサイズ制御およびエマルジョンフリーのキトサン-ジェニピンミクロゲルの製造

この研究では、歯周炎の誘発のラットモデルが、保持性結紮糸とポルフィロモナスジンジバリス由来のリポ多糖の反復注射の組み合わせを介して提示されます、...

ラットモデルにおける結紮糸とリポ多糖の注射 の組み合わせによる 歯周炎の誘発

本研究では、重力を利用して低接着条件下で細胞をスフェロイドに凝集させ、得られたスフェロイドをミニバイオリアクターで培養することにより、軟骨球性スフェロイドを作製する方法について述べています。...

重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製

この研究では、マウスで歯周炎を誘発するための修正された6-0ナイロンライゲーション法について説明しており、再現性が高く、研究者が歯周病の発生から病理学的結果までを研究するための代替手段を表しています。...

上顎第二大臼歯のナイロン結紮による進行性歯周炎のマウスモデル

学ぶキトサン膜を用いたヒト歯周靭帯細胞スフェロイド培養法。3D培養システムにより自己更新能と骨芽細胞分化能が向上し、従来の培養法より優れた細胞機能を実現します。歯周組織再生医療への応用が期待されます。

キトサン膜上のヒト歯周靭帯細胞スフェロイドの形成

さらに動画を探す