Name: 超音波増強原発性成人線維芽細胞分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学ぶ超音波増強による原発性成人線維芽細胞分離法。酵素処理と機械的攪拌、超音波を組み合わせた簡便な手法で、細菌汚染リスクを低減し、初心者でも迅速に習得可能です。

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ロミー・ケンペさんとアネット・オピッツ夫人の技術サポートに感謝します。また、ビョルン・ビンニューエルグ氏のITサポートにも感謝します。この研究は、フェルダークライス・ドレスラー・ヘルツ=クライスラウフ・テージe.V.、b)「ハビリテス・フェルダー・プログラム・フュール・フラウエン」、カール・グスタフ・カルス・ドレスデン医学部、その他クレーナー・フォルシュングスコレッグ(EKFK)の助成金によって支えられました。カス・ドレスデン私たちは、資金と支援に感謝しています。

以下のプロトコルは、ドイツのテクニッシュ大学ドレスデン(ファイル番号:T 2014/4)および国際的に受け入れられている動物ケアガイドライン(FELASA)17の制度的な動物ケアガイドラインに従っています。図 1は、セルの分離プロセスを視覚化します。
1. セットアップ、マテリアル、メディアの準備
<ol><li>細胞培養培地、PBS溶液、コラゲナーゼブレンドストック溶液(無菌超純水の12mLで凍結乾燥コラゲナーゼブレンドの50mgを再構成)、および0.25%トリプシン溶液を調出す。</li>
	<li>培地、PBS及びトリプシン溶液を37°Cに温める。</li>
	<li>超音波水浴を37°Cに予熱します。</li>
	<li>鉗子、ステンレス鋼のへら、メス(器官あたり2xメス)および70%のエタノールが付いている2つのガラスビーカーを消毒し、細胞培養フードの下にこれらの材料を置く。</li>
	<li>1つのビーカーに70%のエタノールを入れ、もう一方を滅菌水またはPBS溶液で満たします。これらのビーカーは、各臓器の行列の後に器具を消毒し、洗浄するために必要とされます。</li>
	<li>湿った氷の上に冷たいPBSを含む無菌の15 mLプラスチック管を置く。チューブの数は、線維芽細胞を分離したい器官の数によって異なります。</li>
</ol>2. マウスの解剖と臓器の除去
<ol><li>2組の手袋をもう一方の上に着用し、動物が解剖されるとすぐに最初のペアを取り除くことができます。 注:この手順は、動物の毛皮や皮膚からの細菌が器官の上に広がるのを防ぎます。</li>
	<li>マウスを安楽死させ(例えば、頚部脱臼)、ポリスチレンパッドにすべての手足に針で死体をピン留めます。</li>
	<li>70%エタノールスプレーを使用してマウスの死骸を消毒します。毛が渦巻かないように、毛皮がエタノールに浸されていることを確認してください。</li>
	<li>外科鉗子と外傷性はさみを使用して泌尿生殖器管の真上に毛皮を切る。最初の切開の点から首(3-4センチメートル)に中間線と一緒に皮膚をカットし、手足にレリーフカットを追加します。 注意:細菌汚染を避けるために、このステップで筋肉層を穿当しないでください!</li>
	<li>腹腔を覆う筋肉に最適なアクセスを持つために、ポリスチレンフォームパッドに皮膚をピン留めします。</li>
	<li>70%エタノールを使用して腹部筋を2回消毒する。次のステップに進む前にエタノールを乾燥させてください。</li>
	<li>最初の手袋を取り外します。鉗子とはさみの新しい、生殖不能のセットを使用してください。</li>
	<li>外科的はさみで筋肉層を切開して腹腔と胸郭を開き、選択した器官を穏やかに取り除きます。したがって、外科鉗子でオルガンを穏やかに保持し(臓器を貫通せず、最小限の圧力を使用する)、はさみで器官のエントリポイント付近の供給血管を切断します。</li>
	<li>冷たいPBSを含む無菌管に器官を入れる。チューブをしっかりと閉じます。ステップ3.1に進むまで、濡れ氷の上にチューブを置きます。</li>
</ol>3. 組織ミンチ、消化、細胞抽出
<ol><li>無菌細胞培養フードの下にチューブを移します。 注意:手袋の新鮮なペアを着用し、フードの下にそれらを転送する前に、70%エタノールでチューブを消毒!</li>
	<li>滅菌鉗子を使用して15 mLチューブから器官を取り出します。滅菌6cmペトリ皿の半分に器官を置き、余分な血液を除去するためにPBSで短時間臓器を洗浄します。ペトリ皿の後半にオルガンを転送し、余分なPBSを削除します。</li>
	<li>2つの滅菌メスを使用して組織をミンチします。残りの組織断片は、1 - 2ミリメートルより大きくすべきではありません。</li>
	<li>無菌へらを使用して新しい無菌15 mLチューブにミンチティッシュを移し、0.25%トリプシン溶液の2 mLを追加します。チューブを37°Cの細胞培養インキュベーターに5分間入れます。</li>
	<li>チューブを10sで穏やかに渦(約1400/分)。</li>
	<li>4 mL FCS含有細胞培地(ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)など)を添加して細胞培養フード下でのトリプシン反応を停止する。</li>
	<li>心臓または肺組織を含む各チューブに250 μLのコラゲナーゼブレンド溶液を加え、腎臓または肝臓にそれぞれ100μLを加える。</li>
	<li>チューブを超音波水浴(37°C)に入れ、超音波超音波装置を10分間活性化します。 注:このプロトコルで使用される超音波水浴は、35 kHzの動作周波数と320 Wの最大電力を持っています。</li>
	<li>チューブを10sで穏やかに渦(約1400/分)。</li>
	<li>チューブを再び超音波水浴に10分間入れます。</li>
	<li>渦は10sのために穏やかに(約1400/分)。</li>
	<li>70%のエタノールでチューブを消毒し、滅菌細胞培養フードの下でそれらを転送します。</li>
	<li>40 μm メッシュで溶液を新しい無菌 15 mL チューブにフィルター処理します。</li>
	<li>チューブを500 x gで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を取り出し、新鮮な培地の1 mLでペレットを再中断します。</li>
	<li>細胞を適切な細胞培養容器(例えば、6ウェルプレート)に移し、37°Cおよび5%CO2で一晩細胞培養インキュベーターに容器を入れます。</li>
	<li>翌日、培地を取り出し、PBSで3回洗浄し、次に新鮮な培地を加える(添加した容積は、選択した細胞培養容器に依存し、6ウェルプレートのウェル当たり2mLなど)。</li>
	<li>1 日おきにメディアを変更します。 注:線維芽細胞は、90%の光学合流に達した後(通常5〜7日後)に分割することができます。</li>
</ol>

<ol><li>Baum, J., Duffy, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+and+myofibroblasts%3A+what+are+we+talking+about%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 376-379 (2011).</li>
<li>Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+identity+of+cardiac+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Redefining the identity of cardiac fibroblasts.</a> Nature Reviews. Cardiology. 14 (8), 484-491 (2017).</li>
<li>Weissman-Shomer, P., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+fibroblasts+senscence+in+vitro%3A+pattern+of+cell+division+and+life+span+as+a+function+of+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 4 (2), 159-166 (1975).</li>
<li>Angello, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+potential+and+the+duration+of+the+cell+cycle+in+human+fibroblasts%3A+coordinate+stimulation+by+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 62 (1), 1-12 (1992).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fibroblasts+in+vitro+senesce+with+a+donor-specific+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length.</a> FEBS Letters. 516 (1), 71-74 (2002).</li>
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<li>Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+fibroblasts+and+inflammatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 258-269 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li>
<li>Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+physiological+functions+and+ion+currents+in+atrial+fibroblasts+from+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation.</a> Physiological Reports. 4 (2), (2016).</li>
<li>Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Isolation+of+High+Quality+Cardiomyocytes%2C+Endothelial+Cells%2C+and+Fibroblasts+from+an+Adult+Rat+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55601(2017).</li>
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<li>Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+enzymatic+isolation+of+fibroblasts+for+the+creation+of+autologous+skin+substitutes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40 (8-9), 268-277 (2004).</li>
<li>El-Armouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+inhibitor-1-deficient+mice+are+protected+from+catecholamine-induced+arrhythmias+and+myocardial+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy.</a> Cardiovascular Research. 80 (3), 396-406 (2008).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+Guidelines+and+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+primary+adult+fibroblast+cultures+from+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), 2033(2010).</li>
<li>Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts+differentiate+from+fibroblasts+when+plated+at+low+density%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (9), 4219-4223 (1996).</li>
<li>Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblasts+in+cell+culture+systems%3A+myofibroblasts+all+along%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 389-399 (2011).</li>
<li>Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484</a> (2019).</li>
<li>Coppé, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li>
<li>Singh, M., Sharma, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outgrowth+of+fibroblast+cells+from+goat+skin+explants+in+three+different+culture+media+and+the+establishment+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47 (2), 83-88 (2011).</li>
<li>Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removal+of+fibroblasts+from+human+tissue+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems.</a> Experimental Cell Research. 185 (2), 519-528 (1989).</li>
</ol>

宣言する利益相反はありません。

不死線維芽細胞株と比較して、一次線維芽細胞はいくつかの利点を提供する。それらは高品質および量で費用を効果的に隔離することができる。さらに、一次培養は、複数の個体から細胞を研究する可能性を提供し、得られた結果の信頼性を高め、単に細胞培養アーティファクトを研究する可能性を減少させる。新しい一次培養の連続的な生成は、一般的に繰り返し通過後に発生する遺伝的変化を防ぎます21.さらに、細胞老化22、23または増加した筋線維芽細胞分化は、高い通路20における培養においてより頻繁に起こる。低い通過路(2-3)では、基底筋線維芽細胞数は約20〜30%(図示せず)であり、β-ガラクトーシダーゼ発現に基づいて老化と考えられていたのはわずか2.89%であった(図5B)。このため、最大5回まで培養物を通過し、以下に置き換えることをお勧めします。これにより、実...

線維芽細胞は、複数のステラプロセスと広範な大まかな小平性網膜1、2を持つ平らな、紡錘形の細胞である。平均線維芽細胞は30 - 100 μmを測定し、57 ±3日1、3の寿命を有する。ヒト線維芽細胞の平均細胞周期持続時間は、培養条件4に応じて16〜48時間の範囲である。培養された原発性線維芽細胞の複製能力と機能的品質がドナー年齢と否定的に相関するという証拠があり、可能であれば若いドナー(動物または患者)が好ましいことを示唆している5、6.
線維芽細胞は、ほとんどの哺乳類の体組織の主要な細胞型を構成する。彼らのユビキタスな存在にもかかわらず、線維芽細胞の分子同定はまだ挑戦7である。線維芽細胞は、胚発生時に異なるソースから組織や臓器を開発するために移行します 8.このため、線維芽細胞に見られるマーカータンパク質は多数存在しますが、すべての線維芽細胞集団に存在し、線維芽細胞に排他的なユニークなマーカータンパク質がまだ欠落しています。したがって、いくつかの認識されたマーカーの発現パターンは、通常、線維芽細胞を同定するために使用される。最も認識されたマーカーの中には、ビメンチン、ヒト線維芽細胞表面タンパク質(hFSP)、ディスコイジンドメイン受容体2(DDR2)およびα平滑筋アクチン(αSMA)がある。
線維芽細胞は、主要な細胞外マトリックス(ECM)産生細胞型である。それにより、線維芽細胞は整然とした組織構造を維持し、隣接する細胞1に機械的支持を提供する。ECM合成と分解のバランスは、よく規制されたプロセスです。合成に向かうシフトは、過度のECM沈着の始まりをマークし、終了しない場合は線維化を引き起します。線維症は、分子および異型的な変化を受けている活性化線維芽細胞に由来する筋線維芽細胞によって媒介される。筋線維芽細胞の1つの特徴は、ECMおよびサイトカインの分泌を増強し、整然と配置されたαSMAマイクロフィラメント9の発現である。
一次線維芽細胞は、線維症、組織炎症および線維芽細胞癌細胞相互作用10、11に焦点を当てた最近の研究のスポットライトを浴びている。しかしながら、健康および疾患における線維芽細胞特性を効果的に研究するためには、生存可能な原発性成人線維芽細胞を定期的に単離する必要がある。線維芽細胞12、13、14を分離するために利用可能ないくつかの方法があります。線維芽細胞単離の3つの主要な方法は、組織チャンク12、酵素組織消化15、および中空器官9、13、16の酵素灌流からの成長である。成長の利点は、酵素細胞の分解のない穏やかな単離プロセスである。一方、成長培養は通常、細胞が実験に使用されるまで長期間培養期間を必要とします。一般的な酵素消化は速いが、組織を機械的に溶解するために必要な攪拌過程における他の細胞タイプ(例えば、内皮細胞)または細菌との汚染のリスクを負う。さらに、これらの方法は、多くの場合、精巧であり、学ぶために時間とスキルを必要とします。
研究における一次線維芽細胞の重要性に関しては、迅速性、簡易性、信頼性の面で既存の細胞分離アプローチを最適化する必要があります。ここでは、高品質の細胞を提供する新規な超音波系酵素線維芽細胞分離法が提供される。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>T4049-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA</td><td>Gibco LS15140148&nbsp;</td><td>ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)</td></tr><tr><td>細胞培養フード</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>51023608</td><td>HeraSafe KSP15</td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>50049176</td><td>BBD 6220</td></tr><tr><td>細胞培養プレート</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>容器によって異なります</td><td>6、12、24ウェル Nunclon 表面</td></tr><tr><td>細胞培養吸引</td><td>VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany</td><td>20727400</td><td>BVCプロフェッショナル吸引</td></tr><tr><td>セルストレーナー(メッシュ)</td><td>コーニング、テュークスベリー、米国</td><td>431750</td><td>40 &micro;m ナイロン</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国</td><td>75007213</td><td>メガフュージ8R</td></tr><tr><td>コードレスピペッティングコントローラー</td><td>ヒルシュマン、エバーシュタット、ドイツ</td><td>9907200</td><td>ピペタス</td></tr><tr><td>使い捨てピペットチップ</td><td>シグマ・アルドリッチ、セントルイス、米国</td><td>容量によります</td><td>ピペット用のSafeSealチップ(10 & micro;L、20 &micro;L、100 &micro;L、200 &micro;L、1000 &micro;L)</td></tr><tr><td>使い捨てプラスチックピペット</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>vary on volume</td><td>5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL</td></tr><tr><td>Disposable sterile scalpel</td><td>Myco Medical, Cary, USA</td><td>n.a.Techno</td> <td>cut</td></tr><tr><td>Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>41965-062</td><td>High glucose</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Eppendorf, Hamburg, Germany&nbsp;</td><td>ボリューム</td><td>50&microに依存します。L、500 &micro;L、1.500&micro;L、2.000 &micro;L</td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>F2442-50ML</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼブレンド</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>5401020001</td><td>Liberase TL Research Grade</td></tr><tr><td>Petri dish 6 cm</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P5481-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D8537-500ML</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>老化検出キット</td><td>Abcam, Cambridge, UK</td><td>ab65351</td><td></td></tr><tr><td>Shaker/ Vortex</td><td>IKA, Staufen im Breisgau, Germany</td><td>n.a.MS2</td> <td>Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)</td></tr><tr><td>滅菌プラスチックチューブ</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>Falcon 352095</td><td>BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)</td></tr><tr><td>Ultrasonic water bath</td><td>BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany</td><td>312</td><td>Sonorex RK100H</td></tr><tr><td>手術用ハサミ (非外傷性)</td><td>Aesculap AG, Tuttlingen, Germany</td><td>NR 82</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ&nbsp;</td><td>Aesculap AG、Tuttlingen、ドイツ</td><td>eq 1060.09</td><td></td></tr><tr><td>外科用鉗子</td><td>Aesculap AG、Tuttlingen、ドイツ</td><td>BD577</td><td></td></tr></tbody></table>

超音波増強原発性成人線維芽細胞分離

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

原発性成人線維芽細胞は、すべての体組織における線維症、線維芽細胞相互作用および炎症を研究するための重要なツールとなっている。一次線維芽細胞は筋線維芽細胞分化または老化誘導のために無期限に分裂することができないため、新しい培養物を定期的に確立する必要があります。しかし、信頼性の高い分離プロトコルと一次線維芽細胞分離自体を開発する過程で克服すべきいくつかの障害があります:方法の難易度(特に初心者向け)、細菌汚染のリスク、一次線維芽細胞が実験に使用されるまでに必要な時間、およびその後の細胞品質と生存率。本研究では、酵素消化と超音波攪拌を組み合わせた、マウス心臓、肺、肝臓および腎臓から原発性成人線維芽細胞を分離および培養するための、迅速で信頼性が高く、学習しやすいプロトコルが提供される。

固体マウス組織から成体線維芽細胞を分離するこのプロトコルの能力が実証された。免疫蛍光染色や増殖実験などの後続の実験に用いることができる生細胞芽細胞が得られた(図2D-F、図5A)。 
成体線維芽細胞は、通常単層12、18で成長する複数の細胞プロセスを持つ平らな紡錘形細胞である。得られた結果は、これらの形態学的特徴を反映し、異なる器官からの線維芽細胞集団における明確な形態学的差を示す(図2)。腎線維芽細胞は特に小さく、心臓、肺または肝線維芽細胞よりも高密度で成長した(図2)。
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我々は、初心者(例えば、学生)が実行可能な、簡単で迅速かつ信頼性の高い方法で原発性成人線維芽細胞を分離するためのプロトコルを提示する。この手順は、酵素組織の消化と機械的撹拌を超音波と組み合わせて、一次線維芽細胞を得ます。プロトコルは、特定の実験要件(例えば、ヒト組織)に容易に適合させることができる。

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

当社のプロトコルは、細菌汚染を避けることに明確な焦点を当てた原発線維芽細胞の分離のための簡単かつ迅速なアプローチを提供し、これは大きな問題になる可能性があります。特に初心者向け。私たちの技術の主な利点は、そのシンプルさです。それは広範な手動スキルや経験を必要としないので、それは簡単に短いトレーニング期間内に誰もが学ぶことができます。この技術を発表するマンジャ・ニューは、研究室の技術者です。解剖を始める前に、使い捨て手袋を2組着用し、1組を他方の上に置きます。そして、ポリスチレンパッドにマウスを固定します。毛皮を70%エタノールで消毒し、動物が浸されたことを確認します。そして、エタノール殺菌手術鉗子と外傷性ハサミを使用して、泌尿生殖管のすぐ上の皮膚をカップに入れた。最初の切開から首まで中線に沿って3〜4センチメートルカットし、手足にリリーフカットを追加します。そして、腹腔を覆う筋肉への最適なアクセスを達成するためにパッドに皮膚を固定します。次いで、新鮮な70%エタノールで腹筋を2回消毒する。エタノールが乾燥したら、手袋の最初のペアを取り除きます。そして、腹腔と胸部を開くために筋肉層を切開するために鉗子とはさみの新しい滅菌セットを使用してください。目的の器官を取り除くために、組織を突き刺すことなく外科用鉗子で各器官をそっとつかむ。そして、臓器の入り口付近で供給血管を慎重に切断するためにはさみを使用します。各器官を無菌、冷たいPBSのチューブに入れ、チューブをしっかりと閉じます。器官が集められると、各管を湿った氷の上に置く。すべての臓器が収穫されたら、滅菌細胞培養フードに入れる前に70%エタノールでチューブをスプレーします。手袋の新鮮なペアを身に着けて、無菌の6センチメートルのペトリ皿の半分に各臓器を転送するために無菌鉗子を使用しています。そして、余分な血液を除去するために新鮮なPBSで臓器を簡単に洗います。各ペトリ皿の後半にすすい出した器官を移し、余分なPBSを取り除きます。2つの無菌メスを使用して、臓器を1〜2ミリメートルの断片にミンチする。そして、滅菌ヘラを使用して、組織片を新しい、個々の、無菌、15ミリリットルのチューブに移します。各チューブに0.25%トリプシン溶液の2ミリリットルを追加します。そして、チューブを37°Cの細胞培養インキュベーターに5分間入れます。インキュベーションの終わりに、10秒間毎分約1400回転でチューブを渦付けする。そして、チューブあたり胎児子牛血清を補充適切な培養培地の4ミリリットルでトリプシン反応を逮捕する。次に、各チューブにコラゲアーゼ配合液の適切な量を加えます。そして、10分間摂氏37度の超音波水浴にチューブを置きます。超音波処理の終わりに、10秒間チューブをそっと渦を出します。チューブを超音波水浴に戻す前に、さらに10分間。2回目の超音波処理の終わりに、10秒以上のチューブを渦。そして、70%エタノールでチューブを消毒します。細胞培養フードでは、個々の40マイクロメートルストレーナーを通して細胞懸濁液を新しい無菌15ミリリットルチューブにフィルター処理します。遠心分離により細胞を回収する。1チューブあたり新鮮な培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁します。そして、適切なめっき密度で適切な細胞培養容器内の細胞を参照してください。次いで、細胞を細胞培養インキュベーターに一晩入れる。翌朝、各培養物をPBSで3回洗ってから、新鮮な培地を添加し、培養器に細胞を戻す。このプロトコルを使用して、後の実験で使用するために生き生きと線維芽細胞を得ることができる。例えば、アミノ蛍光染色や増殖実験など。成体線維芽細胞は、平らな紡錘形細胞であり、一般的に単層で増殖する複数の細胞プロセスを有する。しかし、異なる器官からの線維芽細胞集団における明確な形態学的差異は観察され得る。例えば、腎線維芽細胞は心臓、肺または肝線維芽細胞よりも小さく、高密度で成長する。単離された線維芽細胞は高い増殖率を示し、およそ6日後に90%を超える光学合流に達する。ここで、特徴的なα平滑筋アクチンマイクロフィラメントを有する分化された筋線維芽細胞が観察できる。これらの細胞は、心臓、腎臓、肝臓、および肺細胞培養において豊富に見られる。単離および培養細胞の約20〜30%だけが整然と発現するが、配列されたα平滑筋アクチンマイクロフィラメントは、培養7日後にビメンチンおよびフィジジンドメイン受容体2に対して事実上全ての細胞が陽性である。最も重要なことは、細菌汚染を避けなければならないので、手順全体を通して正しい技術を使用することです。一次線維芽細胞の単離後、細胞はあらゆる種類の精神医学実験および特徴付けに使用することができる。免疫細胞化学の増殖や創傷治癒エッセイ、または分子生物学的評価など。

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