Name: 新生児子豚における腕神経叢における生体内生体力学試験の方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学ぶ新生児子豚を用いた腕神経叢の生体内生体力学試験法。伸展損傷メカニズムの解明と機能・構造的欠損の損傷閾値の測定に役立つ。神経科学とバイオメカニクスの研究に応用可能。

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この出版物で報告された研究は、ユーニス・ケネディ・シュリバー国立小児保健・人間開発研究所が受賞番号R15HD093024の下で国立衛生研究所の人間開発と国立科学財団のキャリア賞によって支援されました番号1752513。

ドレクセル大学の制度的動物ケアと使用委員会は、すべての手順を承認しました (#20704).
1. 動物の到着と順応
<ol><li>到着後少なくとも24時間は1~2日前の子豚を検疫してください。</li>
	<li>アスペンチップの寝具に清潔で衛生的なステンレススチールケージ(x 48 x 36 in x 36 in)の家の子豚をアスペンチップ寝具に乗せ、豚のミルク交換器でアドリビタムを供給します。</li>
	<li>室温を85°Fに保ち、熱中性環境を確保します。</li>
</ol>2. 実験の日
<ol><li>実験の前にフィード2時間を取り外します。</li>
	<li>ケタミン(10~40mg/kg)/キシラジン(1.5~3.0 mg/kg IM)の筋肉内注射で子豚を注射し、搬送ケージを介して手術スペースに輸送します。</li>
</ol>3. 麻酔の誘導と維持
<ol><li>鼻コーンによって酸素に混合された4%のイソフルラン吸入麻酔薬を投与し、パルペブラルおよび離脱反射の不在を評価することによって動物が深く麻酔されていることを確認する。</li>
	<li>動物をすびれ位置に置いて挿管し、喉頭鏡(ストレートブレード)を使用して挿管管(直径2.5~2mm)を気管に導きます。</li>
	<li>挿管管が確保されたら、動物を人工呼吸器の上に置きます。</li>
	<li>子豚がイソフルラン(0.25%-3%メンテナンス)、酸素、亜酸化窒素の混合物を受け取ることを確認してください。</li>
	<li>フェンタニル(10μg/kg)の用量を提供し、鎮痛および沈下の十分な深さを継続し、気管内チューブの崩壊を危険にさらす可能性のある運動アーティファクトを避けるために、1〜2時間ごとに用量を与え続けます。</li>
	<li>皮下腹部静脈または他の末梢静脈における静脈内(IV)アクセスを確立する。</li>
	<li>大腿動脈を通して動脈ラインを確立する。これは、非侵襲的に、またはカットダウンを行うことによって行うことができます。</li>
</ol>4. モニタリングとケア
<ol><li>つま先ピンチに対するカンタル反射の欠如と離脱応答の欠如を確認することにより、麻酔の深さを監視します。</li>
	<li>動脈血圧、心電図検査(ECG)、終潮時CO2、パルスオキシメトリー、体温など、麻酔中および実験全体を通じて生理学的パラメータの連続的なモニタリングを行います。</li>
	<li>血液ガスと血糖値を0.5~1時間ごとにモニタリングし、必要に応じて~100cc/kg/日で1時間より長く麻酔された動物に静脈内液(50%デキストロース、50%正常生理食性)を与え、密血を確実にします。</li>
	<li>動物の麻酔面を注意深く頻繁に監視します。鎮痛を提供し、吸入麻酔を増加させます。</li>
	<li>ノルモキシアを確保するために必要に応じて人工呼吸器パラメータと薬物投与量を制御することにより、通常の酸素張力で動物を維持し、その後、通常の体温が39°Cに維持されるように、温度調節された循環水毛布の上に動物を置きます実験の間のために。</li>
</ol>5. 腕神経叢外科
<ol><li>セクション3で説明されているように適切な麻酔の後、手術台の上に動物を配置し、上肢を誘拐し、腋窩領域を露出させる。</li>
	<li>動物をカバーするために任意の外科的なドレープを使用してください。清潔だが無菌の技術を使用してください。</li>
	<li>気管の上に上にある皮膚と筋膜の上に中線切開(#10ブレードを使用)を行い、胸骨の上3分の1まで、C3-T3間の脊椎レベルに対応して、脊椎の両側の腕神経叢複合体を露出させる。</li>
	<li>鎖骨の縁に沿った上側の鉗子と止血を水平に使用して切開部を外挿し、頭蓋静脈とバジル静脈を分離する。</li>
	<li>はさみと鉗子を使用して鈍い解剖によって上側および下側のフラップを解放し、それぞれ腕神経叢の頸部および胸部領域へのアクセスを可能にする。</li>
	<li>T1で軸(C2)と最初のリブを識別します。これらのランドマークを使用して、下3頸部(C6-C8)と最初の胸部(T1)脊椎骨孔を特定し、その後、神経叢を注意深く調べて、露出を達成するために分裂(M形状)の分岐を見つけます。</li>
	<li>ラベル(神経ループを使用して)これらの分岐の上の腕神経叢領域は、脊椎に根/幹として近く、これらの分岐の下にあるものにコード、腕に近い神経の後にラベルを付けます。</li>
</ol>6. 生体力学試験
<ol><li>生体機械試験装置のセットアップ 注:カスタムメイドの機械試験装置は、BPの生体内ストレッチを実行するように設計され、製造されました(図1)。<ol>
<li>セットアップのベースをカートに取り付けます。</li>
		<li>大型Cクランプを使用して、電気機械アクチュエータをベースに取り付けます。アクチュエータは150ポンドの力、10"の打撃および15のmm/sの速度を提供することができる。速度は0.2 mm/sに減らすことができ、まだ望ましいように機能する。</li>
		<li>200 N ロードセルをアクチュエータに取り付けます。</li>
		<li>パッド入りのプレキシガラスで構成されるロードセルにクランプを取り付ける(ねじ込み)ため、クランプ部位の応力集中を防ぎます。</li>
		<li>三脚にカメラを取り付けます。カメラの解像度が 658 x 4926 ピクセルで最大 120 f/s を記録できることを確認します。</li>
		<li>カメラ、アクチュエータ、ロードセルからUSBケーブルをコンピュータに接続して、セットアップのすべてのコンポーネントを統合して同期します。</li>
		<li>コンピュータ、アクチュエータ、ロードセルを電源に差し込みます。</li>
	</ol></li>
	<li>適用された荷重を記録する前に、ロード セルをキャリブレーションします。これを行うには、次の手順を実行します。<ol>
<li>調整可能なハンドルを使用してアクチュエータを90°の角度に設定し、分度器で角度を確認します。</li>
		<li>ロード セルで動作するソフトウェアを開きます (材料表)。[スタート]ボタンを押して、電圧のライブ読み出しを表示します。</li>
		<li>クランプのウェイトを 0 ~ 1,000 g の範囲でセットアップから 100 g ずつハングアップし、測定された電圧を記録します。</li>
		<li>傾き(m)と切片(b)を求めることによって、電圧と重みの線形方程式を計算します。これは、スプレッドシート プログラムと付属の勾配関数を使用して、以下の式1 から b を計算するために行われます。次に示す方程式 2 を機械セットアップ コードに挿入します。 方程式 1: b = y - mx ここで、y は重みで、x は電圧、m は傾き、b は切片 (定数) です。 方程式 2: y = mx + b ここで、y は重みで、x は電圧、m は傾き、b は定数です。</li>
	</ol></li>
	<li>テスト:BP神経は切断され、カスタム構築されたクランプによってテストセットアップに固定される。<ol>
<li>細かいはさみを使ってBP神経を切ります。</li>
		<li>図 1に示すように、カスタム構築されたクランプで BP 神経の切断側をクランプします。</li>
		<li>クランプされたBPセグメントに黒いアクリル塗料またはインドインクを手動で置きます(図2)。</li>
		<li>1 cmの定規であるキャリブレーショングリッドを動物内に平らに配置して、データ分析の尺度を設定します。</li>
		<li>カメラのソフトウェアを使用して、テストされたセグメント上でカメラの配置を直接表示し、マーカーの動き/変位を監視し、任意の時点で実際の組織歪みを決定できるようにします。</li>
		<li>神経がテーブルから体内に挿入する高さやテーブルからのクランプの高さ、アクチュエータの角度、組織の全長などの初期測定値を記録します。</li>
		<li>プログラミング ソフトウェア (図 3に示すように、グラフィカル ユーザー インターフェイス [GUI] を含むテーブル) を開きます。</li>
		<li>[実行] ボタンを押して GUI を実行します。</li>
		<li>[初期化] ボタンを押してシステムを初期化します。</li>
		<li>タレボタンを押してシステムを引き上します。</li>
		<li>テスト開始ボタンを押してBPセグメントをストレッチします。これはBPの任意の区分で完全な失敗が起こるまで500のmm/minの割り当てられた速度でティッシュを引っ張る。このストレッチレートは、利用可能な文献4、8、18に基づいて選択されます。プログラムはまた、ビデオファイル、適用された引張荷重、組織の変位、および試験の持続時間を保存します。</li>
		<li>組織が破裂する点である障害部位を記録する。</li>
	</ol></li>
	<li>安楽死: ペントバルビタールの致死量 (120 mg/kg i.v.) 実験の終わりに子豚を安楽死させる.</li>
	<li>データ分析:テスト中に取得したビデオの分析にモーショントラッキングソフトウェアを使用します。<ol>
<li>[ファイル] メニューの [モーション トラッキング ソフトウェア] 内の実験からビデオ ファイルを開きます。ビデオ ファイルを開きます。</li>
		<li>キャリブレーション グリッドを使用して、ライン ツールを使用してモーション トラッキング ソフトウェアでスケールを設定し、描画後に線を右クリックし、[測定値の調整] を選択して、既知の値をセンチメートル単位で入力します (図 4)。</li>
		<li>動画を右クリックして[トラックパス]を選択し、マーカーの中心を組織のマーカーに合わせ、破裂するまで取り付けることで、モーショントラッキングソフトウェア内の組織のマーカーを追跡します。</li>
		<li>マーカーから X 座標と Y 座標を書き出す には、[ファイルをスプレッドシートにエクスポート]を選択して、ひずみの計算に使用できるようにします。</li>
		<li>データをプログラミング ソフトウェアにインポートして、時間の経過に従って X 座標と y 座標の間の距離を計算し、ひずみを計算します。</li>
		<li>ストレッチ中の傾斜の変化を考慮した後、距離の変化を元の距離で割ることによって、各時点でひずみ値を計算します。実際のひずみ値は、各時点で隣接するマーカーの各ペア間で決定されます。これらの株の平均も計算されます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

BP組織上のストレッチの生体力学応答に関する利用可能な文献は、広範囲の閾値ならびに方法論的不一致を示す4、6、8、18、19、20、21、22、23である。公表された結果の変動は、組織処理の違い(例えば、固定組織と固定組織)、伸びを測定する際の方法論的差、および使用される種の違いに起因する可能性がある。さらに、これらのデータは、新生児ではなく、成体動物またはヒトの死体から得られる。倫理的な理由により、生きた人間の新生児から...

最近の産科の進歩にもかかわらず、BP複合体に対するストレッチ傷害によるNBPPの問題は、1,000人の出生1,2当たり1.5例の発生率を有する世界的な健康負担であり続けている。関連する危険因子は、母親(すなわち、過度の体重、母親の糖尿病、子宮異常、BP麻痺の歴史)、胎児(すなわち、胎児マクロソミア)、または出生関連(すなわち、肩ジストシア、長期労働、鉗子または真空抽出器による補助出産、ブリーチプレゼンテーション3)であり得る。これらの合併症は、特定の状況では避けられないが、NBPPの予防および治療は、ストレッチを受けたときに新生児BPの生体力学的および生理学的応答の理解を保証する。
BPに関する報告された生体力学的研究は、成体動物およびヒト死体組織を使用しており、有意な不一致を示す4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。複雑なBP組織の生体力学的性質の臨床的関連性は、新生児動物モデルならびに生体内生体力学試験アプローチを保証する。さらに、複雑な実世界の配信シナリオにおけるBPストレッチ傷害の研究に関する制限は、様々な送達合併症および技術の影響の調査を可能にする方法を提供するコンピュータモデルへの依存を高める。これらのモデルの臨床的関連性の鍵は、その生体性(人間のような応答)である。Gonik et al.16およびGrimmら17によって利用可能な計算モデルは、ウサギおよびラット神経組織に依存するが、新生児BP組織には依存しない。臨床的に関連する新生児動物モデルで生体内バイオメカニカル検査を行うことは、利用できない新生児BPデータの重大なギャップを埋めることができる。
現在の研究では、生体内の機械的検査装置と3-5日齢の男性ヨークシャー新生児子豚で生体力学的検査を行う手順について説明しています。このデバイスは、クランプ、アクチュエータ、ロードセル、および故障時に生体内の歪みと負荷を適用および監視するカメラシステムで構成されています。カメラシステムはまた破裂の間に故障の場所の監視を可能にする。全体的に、システムは伸張を受けたときに新生児BPの詳細な生体力学的特徴付けを可能にし、それによって生体内の機械的故障のためのBPの閾値株およびストレスを提供する。得られたデータは、NBPPに関連する配信シナリオにおけるBPストレッチに対する内因性および内因性力の影響を調査するように設計された既存の計算モデルの人間のような行動(生物忠実性)をさらに改善することができる。

<table><tbody><tr><td>オメガサブミネイチャーテンション&圧縮ロードセル</td><td>Omega</td><td>LCM201-200N</td><td>200N ロードセル</td></tr><tr><td>Basler acA640-120uc カメラ</td><td>Basler</td><td>acA640-120uc</td><td></td></tr><tr><td>フィードバック リニアアクチュエータ</td><td>プログレッシブオートメーション</td><td>PA-14P</td><td>10インチストローク、150lb 力、15mm/秒</td></tr><tr><td>モーショントラッキングソフトウェア</td><td>Kinovea</td><td>N/A</td><td>オープンソース</td></tr><tr><td>プロラミングソフトウェア - MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>N / A</td><td>バージョン、2018A</td></tr><tr><td>、手術器具</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>、鉗子</td><td>、ファインサイエンスツール社</td><td>、11006-12および11027-12または11506-12</td><td></td></tr>、<tr><td>止血剤、</td><td>ファインサイエンスツール社</td><td>、13009-12</td><td></td></tr>、<tr><td>はさみ</td><td>、ファインサイエンスツール社</td><td>、14094-11、または14060-09</td><td></td></tr></tbody></table>

新生児子豚における腕神経叢における生体内生体力学試験の方法

Methods for In Vivo Biomechanical Testing on Brachial Plexus in Neonatal Piglets

新生児腕神経叢麻痺(NBPP)は、頸部および肩領域に位置する神経複合体における出産過程で起こるストレッチ傷害であり、総称して腕神経叢(BP)と呼ばれる。最近の産科医療の進歩にもかかわらず、NBPPの問題は、1,000人の出生につき1.5例の発生率を有する世界的な健康負担であり続けています。この傷害のより重篤なタイプは、肩から下に腕の永久的な麻痺を引き起こす可能性があります。NBPPの予防および治療は、ストレッチを受けた場合の新生児BP神経の生体力学的および生理学的応答の理解を保証する。新生児BPの現在の知識は、生体内の新生児BP組織の代わりに成人動物または死体BP組織から外挿される。本研究では、生体内の機械的試験装置と、新生児子豚における生体内バイオメカニカル試験を行う手順について説明する。装置は、クランプ、アクチュエータ、ロードセル、および故障まで生体内の株と負荷を適用し、監視するカメラシステムで構成されています。カメラシステムはまた破裂の間に故障の場所の監視を可能にする。全体的に、提示された方法は、ストレッチを受けたときに新生児BPの詳細な生体力学的特性評価を可能にする。

BP神経叢の4つのセグメント(4つのマーカー間)からの代表的な負荷時間プロットとひずみがそれぞれ図5および図6に示されている。得られた8.3 Nの故障負荷は、35%の平均故障株で、ストレッチを受けたときに新生児BPの生体力学的応答を報告する。神経の一部の領域は、神経の長さに沿って不均一な傷害を示す他のものよりも高い株を受ける。カメラデータを使用すると、故障の位置をフォアマンに近接して報告できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59860/59860fig1.jpg"> 図1:アクチュエータ、ロードセル、クランプを含む生体内機械試験装置の詳細<a href="https://www.jove.com/file...

ここで提示する方法は、新生児子豚モデルにおける腕神経叢に対して生体内生体力学試験を行う方法である。

Neonatal brachial plexus palsy (NBPP) is a stretch injury that occurs during the birthing process in nerve complexes located in the neck and shoulder ...

この技術は、子豚における腕神経叢の生体力学的ストレッチ試験を複製し、非常に関連性の高い臨床的大きな新生児動物モデルとして機能する。これらの方法は、ストレッチ傷害メカニズムを理解するのに役立つだけでなく、新生児上腕神経叢内の機能的および構造的な欠陥の傷害閾値を報告することもできる。手順をデモンストレーションするのは、私の研究室の大学院生であるレイチェル・マギーです。パルペブラルと離脱反射の欠如を確認した後、麻酔豚を手術台の上肢を上肢に置き、上肢を腋窩領域にさらします。動物の上にドレープを置き、マークされた皮膚の上に切開を行うために番号10メスの刃を使用しています。中線の切開は、胸骨の上3分の1まで気管を覆い、脊柱の両側の腕神経叢複合体を露出させる。動物の腕神経叢の片側を露出させるために、上方切開は、C3に対応する中線切開の上端から上腕に、そして、T3に対応する正中線切開の下端から上腕に下切りがなされる。切開の両側に鉗子を使用して、鎖骨の端に沿ったシュラスタールノッチから上腕に組織を分離し、頭蓋静脈とバジリック静脈を温和化します。はさみ、鉗子、鈍い解剖を使用して、上のフラップを離して上腕神経叢の頸部領域にアクセスし、下のフラップを上腕神経叢の胸部領域にアクセスする。上腕神経叢を露出させるために表面筋に鈍い解剖を行う。次に、神経叢を慎重に調べて、分裂の分岐を見つけ、腕に近い分岐の下の腕神経叢領域を、脊索および神経および分岐の上の領域として、脊椎に近い根または幹として特定する。バイオメカニカルテスト装置をセットアップするには、デバイスのベースをカートに取り付け、大きなCクランプを使用して電気機械式アクチュエータをベースに取り付けます。200ニュートンのロードセルをアクチュエータに取り付け、クリュージガラスを埋め込んだクランプにネジを入れ、クランプ部位での応力集中を防ぎます。三脚を使用して、658 x 492 ピクセルの解像度で毎秒 100 フレームまで記録できるカメラを取り付け、カメラ、アクチュエータ、およびロード セルの USB ケーブルをコンピュータに接続して、セットアップのすべてのコンポーネントを統合および同期します。次に、コンピュータ、アクチュエータ、およびロードセルを電源に接続します。適用された荷重を記録する前にロード セルを調整するには、調整可能なハンドルを使用してアクチュエータを 90 度の角度に設定し、垂直に位置合わせし、分度器で角度を確認します。ロードセルソフトウェアを開き、[開始]をクリックして、電圧のライブ読み出しを表示します。次にクランプから1,000グラムの重量を100グラム単位で吊り下げ、各負荷で測定された電圧を記録します。10個の重みすべてに対して電圧が記録されたら、傾きと切片を計算して電圧と重みの線形方程式を決定します。孤立した腕神経叢の生体力学的検査のために、細かいはさみを使用して神経を切断し、カスタムクランプを使用して神経の切断側をクランプします。黒いアクリル塗料でクランプされた神経セグメントにラベルを付け、1センチの定規を動物の中に平らにして、データ分析のスケールを設定します。カメラソフトウェアでは、カメラの視野をテストしたセグメントの上に直接配置して、マーカーの動きや変位を監視し、特定の時点で実際の組織歪みを決定できるようにします。テーブルから神経が体内に挿入する高さ、テーブルからのクランプの高さ、アクチュエータの角度、組織の全長などのベースライン測定値を記録します。プログラミング ソフトウェアを開き、[実行] をクリックします。ファイル名と変位を入力し、[初期化と TARE] をクリックします。[開始]をクリックして、腕神経叢セグメントをストレッチします。組織は、神経組織の任意のセグメントで完全な障害が発生するまで、1分間に500ミリメートルの割り当てられた速度で引っ張られます。次に、ビデオファイル、適用された引張負荷、組織の変位、およびテストの持続時間を保存し、組織が破裂するセグメントとして故障部位を記録します。4つの腕神経叢セグメントのこの代表的な試験では、得られた故障負荷は8.3ニュートンであり、平均ひずみ故障はストレッチを施した際に新生児神経組織サンプルに対して35%であった。神経のいくつかの領域は、他のものよりも高い株を受け取りました, 神経の長さに沿って不均一な傷害を示します.カメラデータにより、この実験における故障箇所を、前者に近い位置として同定することができた。まず、動物が深く麻酔され、痛みや不快感の徴候を示さないことを確認することが重要であり、第二に、ロードセルを較正し、第三に、組織をしっかりとクランプする。このin vivo動物モデルは、様々な程度のストレッチの後に腕神経叢組織の機能的および組織学的変化を研究し、複雑な出産シナリオを研究するために使用することができる。

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