Name: 胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶ 胃癌患者由来異種移植片モデルと原発細胞株の確立方法。NSGマウスを用いた無菌操作で腫瘍組織を移植し、組織学的特徴と腫瘍内異質性を保持した前臨床評価モデルを構築する技術を習得できます。

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この研究は、中国国立自然科学財団(81572392)によって支援されました。中国国家主要研究開発プログラム(2016YFC1201704);広東特別支援プログラムの先端科学と技術革新的な若者の才能(2016TQ03R614)。
我々は、特に数字の準備に役立つ広州サジェンバイオテック株式会社に感謝します。

この人間の研究は、Sun Yatsen大学癌センター(SYSUCC、広州、中国)の機関倫理審査委員会によって承認されました。動物研究は、Sun Yatsen大学の機関動物ケア・使用委員会によって承認されました。注:すべての実験は、血液媒介性病原体に対する職業暴露保護ガイドラインを含む、関連する法律および制度ガイドラインに従って行われました。
1. サンプル調製
<ol><li>手術から直接胃癌組織(P0=通路0)を得る。腫瘍標本は0.5 cm3より大きくする必要があります。</li>
	<li>ストック溶液の3-4 mLを調製する:例えば、10%の胎児ウシ血清(FBS)、100 U/mLペニシリンおよび0.1mg/mLストレプトマイシンを補充したRPMI-1640培地(1x)。</li>
	<li>新鮮な腫瘍標本を4°Cのストック溶液に4時間以下入れます。</li>
</ol>2. PDXモデルの確立 (図1)
<ol><li>滅菌手術領域を確保するために、動物実験室に移る前に30分以上紫外線ですべての材料を消毒する。 注:手術室は、ジクロロイソシアヌリ酸坐剤消毒剤で机をきれいにする前に、30分間紫外線で消毒する必要があります。その後、ポビドネヨウ素は、皮膚を消毒するために使用されます。</li>
	<li>鉗子とはさみを使用して、慎重に腫瘍組織を解剖し、無菌条件下でいくつかの小片(約1mm3キューブ)にそれらをトリミングします。</li>
	<li>麻酔機で1-1.5%イソルランに曝露することにより、女性の5〜7週齢のNOD-SCID-IL2rg(NSG)マウスを麻酔する。<ol>
<li>それは苦労を停止するが、呼吸さえ維持するまで、マウスを麻酔します。 注:50 mLの管は麻酔機械と同様に機能する簡単な装置である。手術時間が短いため、乾燥を防ぐための獣医眼の目の欠損の使用は不要です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>無菌はさみを使用して両方の背中の側面に1 cmの切開を行い、マウスの各側面に1つの腫瘍片を移植する。<ol>
<li>腫瘍片が抜けないようにするには、生殖不能鉗子を使用して皮下組織を破壊する。次に、腫瘍組織の一部をクリップし、深部位に配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>外科縫合針で皮下縫合によってインプラント領域を閉じ、ラベル付きの耳のタグでマウスの耳をマークする</li>
	<li>ヨウ素で創傷を殺菌する。</li>
	<li>手術後は、胸骨の再発を維持しながら、マウスを空のケージに静かに置きます。マウスの状態に細心の注意を払う;彼らは目を覚ますと、約3-4分後に歩き始めます。手術を受けたマウスを別の新しいケージに置き、手術を受けていないマウスを分離します。</li>
	<li>移植部位の触診によって腫瘍サイズを評価する。週に2回、バーニエキャリパーで腫瘍を測定する。</li>
	<li>腫瘍が直径10mmに達すると、動物の状態が悪化するか、腫瘍が潰瘍化し、IRB承認法でマウスを安楽死させる。再インプラントは、通過のために2つの新しいマウスに新鮮な腫瘍断片を採取し、または一次細胞株の単離のために氷上のPBSに試料を一時的に保存する。</li>
</ol>3. 組織凍結保存
注: この部分では、主にライブティッシュキットクライオキットの方法を参照しています。主なキットと機器は、材料の表に記載されています。
<ol><li>腫瘍の直径が直径が10mmを超える場合は、IRB承認法でマウスを安楽死させる。</li>
	<li>無菌鉗子およびはさみを用いて、マウスから腫瘍をゆっくりと単離する。</li>
	<li>腫瘍組織をDPBSで10cmの皿で洗います。壊死領域、脂肪組織、血栓、鉗子およびはさみで結合組織を解剖し、除去する。</li>
	<li>腫瘍組織を金型で最大1mmの厚さに切る。</li>
	<li>DPBSでスライスを10cmの皿で洗います。 注:ガラス化プロセスでは、ステップ3.6-3.8でV1/V2/V3とラベル付けされたチューブを使用します。主な成分はDMSOとショ糖です。</li>
	<li>スライスを鉗子でチューブV1に移し、チューブを4°Cで4分間インキュベートし、チューブを短時間反転させ、さらに4分間4°Cに置きます。</li>
	<li>V1溶液を注ぎ、10cmの皿にスライスします。スライスを鉗子でチューブV2に移し、チューブV2を4°Cで4分間インキュベートし、チューブを短時間反転させ、さらに4分間4°Cに置きます。</li>
	<li>V2溶液を注ぎ、10cmの皿にスライスします。スライスを鉗子でチューブV3に移し、チューブを4°Cで5分間インキュベートし、チューブを短時間反転させ、少なくとも5分間4°Cに置きます。<ol>
<li>複数のスライスが浮遊したままの場合は、チューブを一時的に転がして反転させ、すべてのスライスが完全に沈むまでチューブを再び4°Cに置きます。必要に応じて、フローティング スライスを破棄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>V3溶液を注ぎ、10cmの皿にスライスします。</li>
	<li>組織ホルダーを適切な長さに切り、滅菌ガーゼの上に置きます。スライスをホルダーに移します。ホルダーをガーゼで包み、鉗子を使って液体窒素に入れ、その後5分間インキュベーションを行います。</li>
	<li>低温バイアルに組織情報をラベル付けします。</li>
	<li>組織スライスを持つホルダーを液体窒素に貯蔵された低温バイアルに移します。</li>
</ol>4. 一次細胞の分離 (図2)
<ol><li>121 °Cで高圧蒸気で鉗子およびはさみを殺菌する30分間。</li>
	<li>切除標本または収穫されたPDX組織からの切除胃癌サンプル。氷の上にティッシュを置き、その後、10センチメートルの無菌培養皿に組織を転送します。</li>
	<li>壊死領域、脂肪組織、血栓、鉗子およびはさみで結合組織を解剖し、除去する。</li>
	<li>100 U/mLペニシリンと0.1 mg/mLストレプトマイシンを含むDPBSで腫瘍組織を10cm皿に1回洗浄します。</li>
	<li>皿の蓋に腫瘍組織を1mm3に切ります。各部分の最大厚さは1ミリメートルでなければなりません。</li>
	<li>1型コラゲナーゼおよびトリプシン(1:14)溶液の約7 mLを用いて50 mL遠心チューブに組織を移します。混合物を短時間渦にする。</li>
	<li>37°Cの水浴でチューブを30〜40分間インキュベートし、5分ごとに混合物を渦します。</li>
	<li>チューブに10%FBSを補充したRPMI-1640培地(1x)を同量に加えます。混合物を徹底的に渦。</li>
	<li>40 μm フィルターを通してろ過を遅くすることにより、混合物を新しい 50 mL 遠心分離管に移します。 注:40 μm フィルターを使用して、がん細胞の比率を高くします。必要に応じて、100 μm フィルターを使用して、免疫細胞などのより多くの種類の細胞を保存できます。</li>
	<li>RTで5-7分間113-163 x gで濾液を遠心分離します。</li>
	<li>5mLのPBSでペレットを洗浄し、上清を慎重に取り除きます。</li>
	<li>ペレットが赤色の場合、多くの赤血球が含まれています。500 μLの赤血球リシスバッファーでペレットをゆっくりと再中断します。5分のインキュベーションの後、PBSの5 mLを追加し、慎重に上清を除去します。</li>
	<li>培養培地でペレットを再懸濁し、無菌10cm皿に混合物を移す。</li>
	<li>2~3日ごとに培地を血清含有培地に置き換えます。</li>
	<li>トリプシン/EDTAを用いて一次細胞を50%合流に達すると通過する。</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Ca-a+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> Ca-a Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
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</ol>

著者は何も開示していない。

胃癌は、限られた治療選択肢を持つ積極的な疾患です。したがって、胃癌のモデルは、クリニック4、8、17への直接翻訳で機能的研究を可能にする重要なリソースとなっています。ここでは、胃癌PDXモデル及び一次細胞株を確立する方法及びプロトコルについて述べた。重要なことに、胃癌標本の形態学的および生物学的特性の両方がPDXモデルにほとんど保持された。
PDX モデルを確立するためのプロトコルには、エングラフメント速度を高めるために強調する必要がある重要な点がいくつかあります。NSG(NOD-SCID-IL2rg)マウスは、これらのマウスがより重度の免疫抑制であり、T、BおよびNK細胞18、19、20、21において欠乏であるので、</s...

胃癌は、世界で5番目に一般的な癌であり、癌死の第3の主要な原因である。2018年には、世界的に100万人以上の新しい胃癌症例が診断され、推定783,000人がこの疾患1によって死亡した。胃癌の発生率と死亡率は、北東アジア諸国2、3で非常に高いままです。がん治療の分野で大きな進歩を遂げたにもかかわらず、進行性胃癌患者の予後は依然として乏しく、5年生存率は約25%4,5,6, 7,.したがって、胃癌に対する新たな治療戦略の開発が急務である。
胃癌の治療は、その高い不均一性8、9のために困難です。このように、精密医療を実現するために腫瘍の不均一性の課題にどう取り組むかという問題は、がん研究の中心です。インビトロおよびインビボモデルは、胃癌の異種メカニズムおよび生物学を解明する上で重要な役割を果たす。しかし、前臨床研究のための多数の胃癌細胞株および多くの従来のトランスジェニックマウスモデルがあるが、これらのモデルの欠点は、その用途を制限する10.これらのモデルの特性は培養において変化したため、腫瘍の不均一性をモデル化することはなくなり、その応答はヒト11における応答を予測できなかった。これらの問題は、標的薬に反応するがん患者のサブグループを特定する可能性を著しく制限する。原発性腫瘍の短期的な培養は、抗癌薬理学的特性を調査するための比較的迅速かつパーソナライズされた方法を提供し、これはおそらくパーソナライズされた癌治療の特徴となるでしょう。
患者由来異種移植片(PDX)は、薬物応答プロファイリング12の代替前臨床モデルとして好ましい。さらに、PDXモデルは癌13、14の開始および進行を研究するための強力な用具を提供する。PDXモデルは、癌細胞の組織学的外観を維持し、腫瘍内不均一性を保持し、腫瘍微小環境15、16の関連するヒト成分をよりよく反映する。しかし、広く使用されているPDXモデルの限界は、ヒト固形腫瘍を確立し、連続的に伝播するための低い成功率である。本研究では、PDXモデルおよび一次細胞株を確立するためのまともに成功した方法について述べる。

<table><tbody><tr><td>40 &mu;m Cell Strainer</td><td>Biologix, Shandong, China</td><td>15-1040</td><td></td></tr><tr><td>生物顕微鏡</td><td>OLYMPUS, Tokyo, Japan</td><td>OLYMPUS CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Mittelsachsen, Germany.</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、カールスバッド、カリフォルニア州、米国</td><td>HERACELL 150i</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Basalmedia Technology、上海、中国</td><td>L40601</td><td></td></tr><tr><td>電気サーモスタット水キャビネット</td><td>Yiheng、上海、中国</td><td>DK-8AXX</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Wisent Biotechnology、バンクーバー、カナダ</td><td>86150040</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター、中国</td><td>CN2L9100</td><td></td></tr><tr><td>ライブティッシュキット クライオキット</td><td>Celliver Biotechnology、上海、中国</td><td>LT2601</td><td></td></tr><tr><td>ライブティッシュ解凍キット</td><td>Celliver Biotechnology、上海、中国</td><td>LT2602</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>Biocytogen、北京、中国</td><td>B-CM-002-4-5W</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン&ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、カールスバッド、カリフォルニア州、米国</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>Solarbio、北京、中国</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 中</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、カールスバッド、カリフォルニア、米国</td><td>8118367</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Suture Needles with Thread</td><td>LingQiao, Ningbo, China</td><td>3/8 arc 4&times;10</td><td></td></tr><tr><td>組織処理された型と補助ブレード</td><td>Celliver Biotechnology, Shanghai, China</td><td>LT2603</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td><td>2003779</td><td></td></tr><tr><td>Type 1 collagenase</td><td>Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA</td><td>17100017</td><td></td></tr></tbody></table>

胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

腫瘍生物学の理解を深め、治療薬の有効性を調べる前臨床モデルの使用は、がん研究の鍵です。前臨床研究のための多くの確立された胃癌細胞株および多くの従来のトランスジェニックマウスモデルがあるが、インビトロおよびインビボモデルの欠点は、その適用を制限する。これらのモデルの特性は培養において変化したため、腫瘍の不均一性をモデル化することはなくなり、その応答はヒトの応答を予測することができませんでした。したがって、腫瘍の不均一性をよりよく表す代替モデルが開発されている。患者由来異種移植片(PDX)モデルは、癌細胞の組織学的外観を維持し、腫瘍内不均一性を保持し、腫瘍微小環境の関連するヒト成分をよりよく反映する。しかし、通常、多くの胃患者の予想生存期間よりも長いPDXモデルの開発には4~8ヶ月かかります。このため、原発性癌細胞株の確立は、薬物応答研究のための効果的な補完的な方法である可能性がある。現在のプロトコルは、外科的胃癌サンプルからPDXモデルおよび原発癌細胞株を確立する方法を説明する。これらの方法は、創薬やがん生物学の研究に有用なツールを提供します。

ここで、手術からの腫瘍組織は、次のステップまでストック溶液中に保存した。4時間以内に、腫瘍組織を小片に切断し、イソフルラン浸綿を用いて麻酔を行ったNSGマウスの後部側面に移植した。1cm3より大きい腫瘍は、新しいマウスへの移植のために切除することができる(図1)または慎重にスライスし、プロトコルに従って液体窒素中に保存することができる。この研究では、第一世代の腫瘍は後の世代の腫瘍よりもゆっくりと成長し、適切なサイズに達するまでに3週間以上をかかえた。第一世代皮下腫瘍形成の成功率は80%を超えた。顕微鏡下でH&amp;E染色によりPDXモデルから癌細胞の同一性を確認した(図3C)。最後に、凍結保存された腫瘍組織からの腫瘍形成の成功率は約95%であった。
原発癌細胞は、個々の腫瘍を調べるための別の方法として単離された。細胞は、手術標本またはPDXモデルのいずれかから単離された。腫瘍組織をDPBSで洗浄し、断片的に切断した。組織断片を1型コラーゲナ...

現在のプロトコルは、外科的胃癌サンプルから患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび原発癌細胞株を確立する方法を説明する。この方法は、創薬やがん生物学の研究に役立つツールです。

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

患者由来の異種移植片モデルと原細胞株は、医薬品開発の不可欠な部分となり、腫瘍生物学研究の開始と進行を行っています。患者由来の異種移植片モデルは、癌細胞の組織学的外観を維持し、腫瘍内不均一性を保持し、腫瘍微小環境の関連するヒト成分をよりよく反映する。彼のモデルは、ヒト癌の、そして伝統的な癌細胞株のより正確な表現のためのものであり、新しい抗癌療法の前臨床評価を改善する可能性を秘めている。さらに、これらのモデルは、癌患者の異なるサブグループ間で分子特性または腫瘍シグネチャを比較するのに有用であり得る。NSGマウスは免疫不全マウスモデルとして推奨される。マウスの重度の免疫不全のために、すべての実験で無菌性を維持しなければならない。無菌状態では、鉗子とはさみを使用して腫瘍組織を慎重に解剖し、それらをいくつかの小片にトリミングします。マウスを麻酔した後、両方の側部に1センチメートルの切開を行うために無菌はさみを使用してください。滅菌鉗子を使用して皮下組織を破壊する。次に、腫瘍組織の一部をクリップし、深い部位に配置します。外科縫合針で皮下縫合糸によってインプラント領域を閉じる。ヨウ素で傷を殺菌する。この後、胸骨の不順を維持しながら、マウスを空のケージにそっと置きます。彼らは目を覚まし、約3〜4分後に歩き始める必要がありますので、マウスに細心の注意を払ってください。手術を受けたマウスを手術を受けていないものから分離した新しいケージに入れる。移植部位の触診によって腫瘍の大きさを評価し、週に2回、バーニエキャリパーでそれらを測定する。マウスを安楽死させた後、滅菌鉗子とはさみを使用して、マウスから腫瘍をゆっくりと分離する。腫瘍組織をDPBSで10センチ皿で洗います。あなたは壊死領域、脂肪組織、血栓および結合組織を解剖し、除去するために鉗子およびはさみ。次に、カビを使用して腫瘍組織を最大厚さ1ミリメートルに切断する。腫瘍スライスをDPBSで10センチメートル皿で洗います。ガラス化プロセスを開始するには、鉗子を使用してスライスをチューブV1に移し、4分間摂氏4度でインキュベートします。チューブをロールして反転させ、さらに4分間摂氏4度でインキュベートします。次に、V1溶液とスライスを10センチメートルの皿に注ぎ、鉗子を使ってスライスをチューブV2に移します。摂氏4度で4分間インキュベートします。チューブをロールして簡単に反転させ、さらに4分間摂氏4度でインキュベートします。この後、V2溶液とスライスを10センチメートルの皿に注ぎます。チューブV3にスライスを移し、5分間摂氏4度でインキュベートします。チューブをロールして反転させ、摂氏4度でさらに5分間インキュベートします。すべてのスライスがチューブの底に沈むことを確認します。いくつかのスライスが浮いたままの場合は、チューブを短時間ロ

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Cancer Research

がん研究

このビデオでは、GFPレンチウイルスで標識されたPDX由来のCRCオルガノイドが免疫不全マウスの脾臓に転移を生成するためのプロトコルについて説明しています。他の臓器にコロニーを形成するがんの微小転移は、蛍光顕微鏡を使用して検出し、GFP発現を評価できます。...

実験的転移マウスモデルの確立:GFP発現CRCオルガノイド細胞をPDXモデルに移植して微小転移を検出する

緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルス粒子とルシフェラーゼレポーターによる患者由来異種移植片(PDX)の安定な標識方法について説明します。この方法により、一次部位でのPDXの増殖を追跡し、in...

腫瘍の増殖と転移研究のためのトレーサブル記者との乳癌患者由来の異種移植片の標識

ここを確立する、2 次元の単分子膜に 3 D オルガノイドを転送する人間およびマウス由来 3 次元 (3 D) 胃...

再生の研究のための主な胃上皮単層培養のマウスおよびひと由来

このプロトコルは、高品位の尿細胞癌細胞または非肥満糖尿病/重度の組み合わせに大腸癌細胞を直腸内注入することにより、患者由来のオルソトピック異種移植片モデルの生成を記述する。ヒト転移性疾患の進行を模倣するリンパ節間質細胞の影響下で原発性腫瘍増殖および自発的転移のための免疫不全(NOD/SCID)マウス。...

ヒト尿路上皮細胞癌および大腸癌腫瘍増殖および自発性転移に対する患者由来の眼科医異所性Xenograft移植片モデル

インビトロスクリーニングのために患者由来の異種移植片(PDX)を使用してオルガノイドを作成する方法が記載され、インビボ/インビトロモデルのペアが一致する結果となる。PDX腫瘍は、機械的または酵素的に小片に収穫/処理され、その後、元のPDXに対して通過し、凍結保存され、特徴付けられる腫瘍オルガノイドを成長させるCleversの方法が続いた。...

がん薬理学研究のためのPDXとPDX由来オルガノイドのインビボ/インビトロ患者由来モデルペアの作成

中枢神経系転移PDXモデルは、ヒト転移の表現型および分子特性を表しており、前臨床試験の優れたモデルとなっています。ここでは、PDXモデルを確立する方法と、前臨床試験に最適な接種経路について説明します。...

中枢神経系転移の患者由来異種移植モデルの確立と利用

本プロトコルは、PDXモデルがトランスレーショナルオンコロジーの分野で急速に標準になりつつあるため、未分化甲状腺癌(ATC)および頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の患者由来異種移植片(PDX)モデルを確立し、特徴付けます。...

未分化甲状腺癌および頭頸部扁平上皮癌の患者由来異種移植片モデルの確立と特性評価

このプロトコルは免疫不全のマウスの盲腸壁の患者得られた癌細胞の同所性移植を記述する。このモデルは、進行した大腸がんの転移性疾患を再現し、肺および肝臓転移の臨床的に関連するシナリオにおける新しい治療薬の評価を可能にします。...

進行性大腸癌を再現するマウスへの患者由来癌細胞の同所性移植

胃患者由来オルガノイドは研究での利用が増加しているが、標準化された播種密度を持つ単一細胞消化物からヒト胃オルガノイドを生成するための正式なプロトコルが不足している。このプロトコルは、上部内視鏡検査中に得られた生検組織から胃オルガノイドを確実に作成するための詳細な方法を提示します。...

良性胃体および外皮上皮の生検からの患者由来胃オルガノイドの確立と特性評価

次のプロトコルは、患者由来の軟部肉腫 (STS) の主要な文化の確立に焦点を当てください。このモデルでは、分子の背景、これらのまれな悪性腫瘍の薬理学的プロファイルを理解する私たちを助けることができる、STS...

患者由来の軟部肉腫の主な文化の確立

学ぶ 胃癌患者由来異種移植片モデルと原発細胞株の確立方法。NSGマウスを用いた無菌操作で腫瘍組織を移植し、組織学的特徴と腫瘍内異質性を保持した前臨床評価モデルを構築する技術を習得できます。

胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

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