長距離逆PCRによるホットLINE-1のレトロトランスポジション活性の検出

この方法は、LINE-1sと呼ばれる遡及的な転置の活性を検出することができる。これらの移動遺伝子要素は、がんゲノムにデノボ挿入を引き起こし、それによってゲノム不安定性に寄与する。この PCR ベースの手法の利点は、ハイスループット シーケンシング アプローチに比べてシンプルでコスト効率が高い点です。

我々は、ヒト染色体22のTTC28遺伝子内のLINE-1に由来するデノボ挿入を検出する際の有用性をここで実証する。LINE-1活性は、特に大腸癌または高級漿液性卵巣癌のような上皮腫瘍タイプにおいて悪性腫瘍または前悪性腫瘍のバイオマーカーとして役立つことができる。LINE-1挿入に加えて、この方法は、理由のために常に再配置を必要とするDNA再配列のような他のゲノム収差を検出することができます。

適切な制限酵素を選択し、逆プライマーを設計するために、まず、L1BaseなどのLINE-1データベースからFASTA形式のTTC28 LINE-1配列をダウンロードします。TTC28 ライン 1 の L1Base ID は 135 です。5キロベースのシーケンスを含み、5つの素数と3つの素数、ライン1シーケンスの終わりの両方を横に並べています。

シーケンスをワード プロセッサにエクスポートします。ここでは、行 1 の横並びシーケンスは、茶色のフォントと行 1 のシーケンスにグレーのフォントでアセニングされています。TTC28 Line-1の3つの素数の下流の1キロベースシーケンスにユニークなタグを決定し、ポリアドクやドラゴンPolyAスポッターなどのポリアデニル化信号予測ツールの1つに。

この1キロベースウィンドウ内のすべてのポリアデニル化信号にアナメを付けます。ピンクで強調されたTTC28 LINE-1自身の弱いポリアデニル化信号と最強のポリアデニル化信号の下流との間のシーケンスは、このLINE-1のユニークなタグです。逆 PCR プライマーを設計するには、特定の PCR プライマーを生成する NCBI のプライマー-BLASTのように、ウェブベースのプライマー設計ツールに固有のタグシーケンスを入力し、プライマーペアが互いに近い状態であることを示すために、製品長パラメータを最小限に抑えます。

適切なゲノムデータベースを選択します。プライマーブラストの出力は、互いに向き合う従来のPCRプライマーを生成する場合、逆補関数を使用して逆PCRを行います。設計間プライマーは、可能な限り東ポリアデニル化信号に対応する。

TTC28 LINE-1のユニークタグで3つの強いポリアデニル化信号に対応するティールとグリーンで強調された3つのプライマーペアを有しています。次に、適切な制限酵素を選択し、規制マッパーなどのウェブベースのツールを使用して、5キロベースの上流および下流側面とともに、その5キロベースの上流および下流側面をシリカで消化します。これにより、この理由を消化する制限酵素の包括的なリストが提供され、異なる制限フラグメントが生成されます。

LINE-1の5つの素端の5つの素数の上流に、LINE-1自体の中にある場合はLINE-1の5つの素端に向かって5つの素数カットを行う制限酵素を選択します。そして、ユニークなタグから下流の3つのプライムカード。選択制限酵素によって作られたLINE-1配列およびその固有のタグを有するネイティブ制限フラグメントは、PCRによって効率的に増幅されない可能性があるため、12キロベース以下であってはなりません。

選択的制限酵素はDNAメチル化に対して無神経であり、熱不活性化性であるべきであり、互いに相補的な粘着性の端を生成する必要があることに注意してください。長距離逆PCRを実証するために、ここでハイライトされたDAZCTC部位でDNAをカットするSacI制限酵素をライトグリーンで使用します。SacI は TTC28 LINE-1 軌跡のすべての基準を満たし、5,700 塩基対のネイティブ制限フラグメントを生成します。

市販のDNA抽出キットを用いたサンプルからゲノムDNAを抽出し、長距離逆PCRに必要な高品質の高分子DNAを抽出することができます。ここでは、製造の指示を用いてMCF7乳がん細胞株と正常なヒト血液からゲノムDNAを抽出しました。蛍光計を用いてDNA濃度を測定します。

DNAの質と量を確認するために、DNA分子量マーカーと一緒に1人のアガロースゲルに1000ナノグラムのDNA。円形DNAテンプレートを作るためには、まず適当な制限酵素でDNAを消化する。ここでは、MCF7と血液ゲノムDNAを消化するためにSacIを使用して、テキストプロトコルに従って消化反応ミックスを作ります。

チューブと遠心分離機をフリックして溶液を混ぜます。メーカーの指示に従って、37°Cで1時間、加熱不活性化を行い、反応ミックスをインキュベートします。次に、消化したDNAを自己リゲートするテキストプロトコルに従ってライゲーション反応マスターミックス溶液を作る。

反応ごとに、このライゲーション反応マスターミックスの30マイクロリットルを、前のステップから50マイクロリットルの消化されたDNA溶液に直接加えます。チューブをフリックして溶液を混ぜ、チューブを遠心分離します。この反応ミックスを摂氏22度で10分間インキュベートし、さらに10分間摂氏60度で加熱不活性化ステップで仕上げます。

この円形DNAテンプレートは、後続の逆PCRステップで使用されます。サーマルサイクラーにアニーリング温度勾配を設定し、グラディエントPCRによる最適プライマーアニール温度を決定します。テキストプロトコルに従ってすべてのコンポーネントを組み合わせて混合することにより、PCR用のマスターミックスを準備します。

勾配の各アニーリング温度に対して1つの反応を設定します。各反応に対して、19マイクロリットルのマスターミックスPCRチューブを割り当て、血液ゲノムDNAから生成された円形DNAテンプレートを1マイクロリットル追加します。グラデーション PCR プログラムを実行します。

PCR産物の6マイクロリットルを実行し、アガロースゲルの1つのコースで異なるアニーリング温度でそれを加熱します。MCF7細胞株のゲノムにおけるデノボTTC28 LINE-1レトロトランスポジション活性を検出するために、MCF-7細胞株から生成された円形DNAテンプレート上で逆プライマーペアを用いてPCRを行う。勾配 PCR と同じ指示に従いますが、今回は温度勾配を摂氏 64 度の最適なアニーリング温度に置き換えます。

結果についてはアガロースゲルによる長距離逆PCR産物を分析します。この電気泳動後に撮影したアガロースゲル画像は、MCF7から抽出されたゲノムDNAと血液サンプルが高分子量であり、長距離逆PCRに適していることを示しています。このアガロースゲル画像は、電気泳動後に撮影された逆プライマーペアが、5キロベースと7キロベースDNAマーカーの間の強烈なスパンによって観察されるように、勾配のすべてのアニーリング温度で正しい円形テンプレートを増幅することを示しています。

しかし、低い温度でも様々なバンドが観察され、プライマー特異性が悪く、焼鈍温度が悪い。したがって、このプライマーペアの場合、摂氏64度が最適なアニーリング温度です。このアガロースゲル画像は、MCF7細胞株および正常血液から抽出されたDNAに対して長距離逆PCRを行った後に得られたPCR産物を示す。

5,700 塩基対の PCF 積は、アスタリスクで示され、そのネイティブ軌跡でライン 1 に対応するネイティブ PCR を表します。このネイティブ PCR 産物は、MCF7 および正常な血液 DNA の両方で見えます。デノボ LINE-1 レトロトランスポーズおよび MCF7 ゲノムは、アガロースゲル中の天然 PCR 産物と共に、異なるサイズの PCR 産物として検出可能です。

単一分子の読み込みシーケンシング技術によって長距離逆PCR産物をシーケンシングすることで、核密解で標的識別を識別できます。煩雑なアプローチですが、長距離逆PCR産物のクローニングやサンガーシーケンシングも可能です。本ビデオでは、染色体22上のLINE-1の活性が検出された。

同じワークフローを、異なる腫瘍タイプで活性のある他のLINE-1を監視するように調整できます。